3.1 Pazienti
Sono stati studiati 260 pazienti con infezione cronica da HBV HBeAg negativa/antiHBe positiva genotipo D (età mediana 48 anni, min-max: 13-77 anni; 165 maschi e 95 femmine), osservati in maniera consecutiva presso l’U.O. di Epatologia dell’Azienda Ospedaliero-Universitaria Pisana dal 1998 al 2016.
Tutti i portatori, al momento della prima osservazione, erano asintomatici e non in trattamento. I criteri di inclusione sono stati i seguenti: HBsAg/antiHBe positivi per almeno 2 anni; negativi per l’HBeAg e per gli anticorpi diretti contro il virus dell’epatite C (HCV), virus dell'epatite D (HDV), e per il virus dell'immunodeficienza umana (HIV); assenza di malattia autoimmune e di assunzione di alcool ≥40 g/giorno; nessun trattamento antivirale in corso.
Il Comitato Etico del nostro ospedale ha approvato lo studio, e i partecipanti hanno dato il loro consenso scritto.
Alla presentazione, 147 dei 260 (56,5%) soggetti inclusi nello studio avevano caratteristiche virologiche (HBV-DNA ≥20.000 UI/mL), biochimiche (ALT >40 U/L) e strumentali (ecografia, istologia e/o elastografia) indicative di epatite cronica senza cirrosi (CH: 82) o con cirrosi (CI: 65).
L'elastografia transitoria (TE), effettuata con fibroscan, è diventata disponibile nella nostra Unità a partire dall’aprile 2004 ed è stata eseguita in tutti i portatori durante il primo anno di follow-up a partire da tale data, ed alla prima visita nei portatori già in fase di follow-up in quel momento.
Tra i pazienti con cirrosi, 7 avevano un carcinoma epatocellulare (HCC) diagnosticato alla prima osservazione, altri 14 pazienti hanno sviluppato HCC durante il follow-up.
Dopo la valutazione iniziale, tutti i 147 pazienti hanno ricevuto un trattamento antivirale secondo i criteri definiti dalle linee guida EASL [108].
I rimanenti 113 portatori con bassi livelli di replicazione (HBV-DNA ≤20.000 UI/mL) e ALT entro valori normali alla prima osservazione sono stati seguiti con monitoraggio
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almeno trimestrale per 12 mesi, in modo da definire accuratamente il profilo di infezione. Alla fine del monitoraggio di 1 anno, 71 con ALT persistentemente normali e HBV-DNA ≤2.000 UI/mL sono stati classificati come aventi infezione HBeAg negativa (ENI);
42 con ALT persistentemente normali e HBV-DNA compreso tra >2.000 - ≤20.000 UI/mL sono stati definiti come portatori a bassa replica (Low Viremic, LV).
I campioni di siero raccolti al basale sono stati conservati a -20 °C per la successiva caratterizzazione virologica.
3.2 Test sierologici
La biochimica sierologica comprendeva: aspartato transferasi (AST) e alanina transferasi (ALT), gamma-glutamil transpeptidasi (GGT), fosfatasi alcalina (ALP), albumina, globuline, bilirubina totale, tempo di protrombina e alfa1-fetoproteina.
Questi test sono stati effettuati su campioni di siero freschi mediante procedure di routine presso il Laboratorio Centrale dell'Azienda Ospedaliera (Roche, Cobas Analyzer).
L’HBsAg qualitativo, l’anticorpo dell'antigene di superficie dell'epatite B (anti-HBsAg), l’anticorpo dell'antigene core dell'epatite B (anti-HBc), HBeAg ed anti-HBe, gli anticorpi verso HCV, HDV e HIV, sono stati rilevati mediante immunodosaggi disponibili in commercio (Abbott Laboratories; N Chicago, IL) utilizzando procedure di routine presso il Laboratorio di Trapiantologia Epatica.
I livelli sierici di HBV-DNA sono stati quantizzati presso il Laboratorio di Virologia utilizzando il test HBV Amplicor Monitor 2.0 (Roche Diagnostic Systems Inc.; Mannheim, Germania) con un limite inferiore di rilevamento di 200 copie/mL ed intervallo di linearità compreso tra 200 e 200.000 copie/mL (fattore di conversione: 5,82 copie = 1 UI) fino all’anno 2005, e, successivamente, con test COBAS TaqMan, sensibilità 6 UI/mL, intervallo dinamico 6-1,10 × 108 UI/mL.
La genotipizzazione di HBV è stata eseguita mediante sequenziamento diretto della regione small di HBs. L'HBsAg è stato quantizzato utilizzando il test HBsAg Architect, sensibilità 0,05 UI/mL, intervallo di linearità 0,05-250,0 UI/mL (Abbott Laboratories; Il, USA).La caratterizzazione della regione Pre-S/S è stata eseguita mediante sequenziamento diretto (ABI Prism 3100, Applied Biosystem) dell’intero gene S.
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Questa metodica riesce a sequenziare una popolazione virale purchè rappresenti almeno il 15% della quasispecie circolante. In breve, il DNA virale è stato estratto da 200 μL di siero utilizzando il kit QIAamp MiniElute Virus Spin (Qiagen Inc.; Chatsworth, CA, USA). Il DNA estratto è stato utilizzato per l'amplificazione nel sequenziamento diretto per la genotipizzazione di HBV e per la caratterizzazione della regione Pre-S/S. Dopo l'estrazione, 5 μL di DNA sono stati amplificati mediante PCR in un volume di reazione di 50 μL. Per l'amplificazione della regione Pre-S/S, sono state effettuate due PCR utilizzando i seguenti primers: P1-5'-TCACCATATTCTTGGGAACAAGA-3' e
S1-2-5'CGAACCACTGAACAAATGGC–3' per la regione Pre-S; LamEs-5'-GGATGTGTCTGCGGCGTTT-3' e
Pol4as-5'-GGCATTAACGCAGGATAWCCACATTG-3' per la regione Small S. Quando necessario, è stata utilizzata una eminested PCR con un primer interno: aP14-5'-TAACACCAGCAGGGTCCTA-3' e
Pol181as-5'-GACCCACAATTCKTTGACATACTTTCC-3', rispettivamente per le regioni Pre-S e S. Il profilo termico di amplificazione è stato il seguente: denaturazione per 15 min a 94 °C, seguita da 35 cicli, ciascuno costituito da 20 sec a 94 °C, 20 sec a 60 °C ed estensione 30 sec a 72 °C, seguiti da 5 min a 72 °C. I prodotti di PCR sono stati purificati utilizzando il Sistema di Purificazione ExoSAp e sequenziati direttamente utilizzando il metodo di terminazione della catena con il Kit di Sequenziamento BigDye Terminator v1.1 (Applied Biosystem). Le sequenze ottenute sono state analizzate e corrette con il software Chromas Lite, versione 2.6.4 (www.technelysium.com.au). L'allineamento multiplo è stato eseguito utilizzando il software NPS @ Multalin (http: //napa-pbil.ibcp.fr). Le regioni Pre- S1, Pre-S2 e S sono state analizzate per la presenza di mutazioni rispetto alla sequenza di riferimento del consenso per il genotipo D (HBVdb: numero di accesso JX090694.1_1) [136].
Innanzitutto, sono state analizzate tutte le mutazioni nucleotidiche responsabili di qualsiasi sostituzione amminoacidica nel gene S, escludendo le posizioni note come polimorfismi. Quindi, le mutazioni sono state classificate in base alle loro implicazioni biologiche, funzionali o antigeniche, come: influenzare i codoni iniziali delle 3 regioni, il codone di stop comune, creare codoni di stop prematuri, delezioni o inserzioni, mutazioni puntiformi
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La genotipizzazione di HBV, la quantizzazione di HBsAg ed il sequenziamento del gene S sono stati effettuati presso il Laboratorio di Epatologia.
3.3 Elaborazione dei dati ed analisi statistica
I dati sono stati espressi come valori mediani e range. La trasformazione logaritmica è stata utilizzata per dati quantitativi senza distribuzione normale. Il test di correlazione di Spearman è stato utilizzato per analizzare le correlazioni tra i livelli sierici di HBsAg e altre variabili continue. Le differenze tra i sottogruppi sono state analizzate usando il test di Mann-Whitney o il test di Kruskal-Wallis, ove appropriato. La regressione lineare è stata utilizzata per identificare i fattori indipendentemente associati ai livelli di HBsAg. L'analisi statistica è stata eseguita con il pacchetto software SPSS (versione 21.0, SPSS Inc.; Chicago, IL, USA).
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