ancora più approfonditi, allo scopo di comprendere a fondo il suo ruolo in situazioni fisiopatologiche.
C’è anche un notevole interesse nello sviluppo di antagonisti neutrali CB2-
selettivi, ovvero ligandi affini a questo recettore, privi di alcuna attività agonista o agonista inversa. Attualmente, (vedi anche l’Introduzione Generale) solo
pochissimi composti dotati di queste caratteristiche sono stati descritti.198, 199 In un sistema biologico che esprime i recettori CB2, gli antagonisti neutrali CB2-selettivi potrebbero essere sicuramente molto utili come “tools” farmacologici per distinguere tra l’attività tonica del recettore CB2 derivante dal rilascio di endocannabinoidi (alla quale possono opporsi) e l’attività tonica “costitutiva”, cioè
indipendente dalla presenza o meno del ligando (alla quale non possono opporsi).18
In questo contesto, il gruppo di ricerca presso il quale ho svolto la mia tesi di laurea aveva sviluppato una serie di derivati 1,2-diidro-2-oxo-piridin-3- carbossammidici (struttura generale A, Figura 8) caratterizzati da elevati livelli di affinità e selettività per il recettore CB2.200
A N NH O R1 O R2 R3
46
I risultati dei saggi di attività funzionale avevano rivelato aspetti molto interessanti: il profilo farmacologico di tali composti è risultato infatti fortemente influenzato dalla natura del sostituente in posizione 5 del nucleo centrale 2-oxo- piridinico. In particolare, tra i tre composti più affini, il derivato non sostituito in questa posizione è risultato essere un agonista CB1/CB2; il derivato 5-fenil- sostituito ha mostrato le caratteristiche di un agonista inverso CB2-selettivo; infine, l’introduzione nella stessa posizione, di un p-metossifenile, ha “shiftato” l’attività verso l’antagonismo neutrale/debole agonismo inverso CB2-selettivo (Figura 9).200
N NH O O H F N NH O O F N NH O O F MeO 5 5 5
CB1/CB2 agonista CB2-agonista inverso CB2-antagonista neutrale/
agonista inverso parziale
Figura 9. Profili farmacologici di alcuni derivati 1,2-diidro-2-oxo-piridin-3-carbossammidici: influenza del sostituente in posizione 5.
Successivamente, era stata sviluppata una serie di derivati carbossammidici a struttura bifenilica, quali analoghi strutturali dei composti 1,2-diidro-2-oxo-piridinici 5-sostituiti, in cui l’azoto del nucleo centrale era stato rimpiazzato da un atomo di
47 N NH O R1 O R2 R3 NHR2 O R1 OMe R3 B
Figura 10. Derivati bifenil-carbossammidici (B) strutturalmente analoghi dei derivati 1,2-diidro- 2-oxo-piridin-3-carbossammidici 5-aril-sostituiti.
In tali derivati, per quanto riguarda la posizione 1, ovvero quella in cui è presente il gruppo ammidico, erano stati inseriti sostituenti (R2), quali cicloeptile e
4-metilcicloesile (trans o cis), risultati i migliori sulla base dei dati di binding dei composti precedentemente sviluppati. In posizione 2 era stato inserito un gruppo metossilico, in sostituzione del carbonile in pos. 2 dei derivati 2-oxo-piridinici, peraltro non significativamente importante per l'affinità recettoriale. In posizione 3 (R1) erano stati introdotti sostituenti alchilici, in particolare metile e n-butile, per
verificare l'influenza sull'affinità recettoriale dovuta ad un maggiore o minore ingombro sterico in questa zona. In effetti, sostituenti di tipo alchilico (n-pentile, n- butile) in questa posizione, sono stati riportati recentemente in letteratura, in derivati strutturalmente simili a quelli da noi progettati; in particolare, derivati 4- oxo-1,4-diidro-chinolin-3-carbossammidici202 e derivati 4-oxo-1,4-diidropiridin-3- carbossammidici.203 Infine, per quanto riguarda il sostituente R3, erano stati inseriti
gruppi quali H, OMe, F, in analogia con i derivati precedentemente sviluppati. In questa serie di derivati bifenilici, l’introduzione di un gruppo n-butilico in pos.
3 ha condotto a risultati particolarmente interessanti. Infatti i tre derivati butilici 1-3 (Figura 11) hanno mostrato, per quanto riguarda il binding, livelli di affinità e selettività per il recettore CB2 piuttosto buoni; in particolare il derivato 1 presenta
48
una Ki su CB2 di 11 nM a fronte di una Ki su CB1 di 1494 nM, con un “Selectivity
Index” (S. I.) pari a 130.201
OMe NH O MeO 1 OMe NH O MeO 2 OMe NH O MeO 3
Figura 11. Derivati bifenil-carbossammidici 3-n-butil-sostituiti.
Come mostrato nella Figura 12, nei saggi di attività funzionale, il composto 1 si è rivelato “silente” sul recettore CB2 se somministrato da solo; inoltre esso è risultato in grado di “revertare” in modo dose-dipendente, la risposta indotta da un
agonista (HU-210, 1 nM), così come quella indotta da un agonista inverso CB2- selettivo (SR144528, 3 nM). Sulla base di questi dati il derivato 1 è risultato quindi essere un antagonista neutrale CB2-selettivo.201
1 1
1
Figura 12. Il composto 1 è un CB2-antagonista neutrale che inibisce in modo dose-dipendente la risposta dell’agonista (HU-210, 1nM) e dell’agonista inverso (SR144528, 3 nM).
49
Dato che composti aventi queste caratteristiche sono piuttosto rari, il composto
1 può essere considerato come il primo membro di una nuova classe di derivati
bifenilici, utili quali “tools” farmacologici per lo studio approfondito delle
caratteristiche e del ruolo del recettore CB2.
NUOVI DERIVATI CARBOSSAMMIDICI A STRUTTURA BIFENILICA
Sulla base dei promettenti risultati conseguiti con la prima serie di derivati bifenilici, è stato ritenuto interessante sviluppare ulteriormente questo tipo di strutture, variando la natura dei sostituenti nelle posizioni 1 (sostituente sul gruppo ammidico), 3 e 5 del nucleo fenilico centrale. Tutto ciò allo scopo di migliorare ancora i livelli di affinità e di selettività per il recettore CB2 ed eventualmente di chiarire meglio il profilo farmacologico di questo tipo di molecole.
Le modifiche strutturali previste per i derivati bifenilici sono mostrate nelle Figura 13. In posizione 1, come sostituenti sull’ammide, sono stati previsti
cicloeptile, trans-4-metilcicloesile e cis-4-metilcicloesile, analogamente a quanto fatto per la prima serie bifenilica. In posizione 3 sono stati previsti i sostituenti che avevano condotto ai migliori risultati nei derivati 1,2-diidro-2-oxo-piridin-3- carbossammidici, ovvero benzile, p-fluorobenzile e morfolinoetile; in aggiunta, il n- pentile è stato previsto per questa posizione. In posizione 5 sono stati previsti il fenile, il p-fluorofenile, il p-metossifenile, analogamente alla prima serie; ed inoltre altri due sostituenti quali il furile ed il tienile. La progettazione di questa espansione numerica della serie ha previsto di coprire tutte le possibili
50
combinazioni dei sostituenti sopra citati, nelle 3 posizioni di variabilità strutturale (vedi Figura 13). F N O ● ● ● ● ● ● ● OMe NH O MeO 1 F MeO S O OMe NH O ● ● ● ● ●
Figura 13. Modifiche strutturali previste per l’espansione numerica della prima serie di derivati bifenilici.
Il lavoro della mia tesi sperimentale di laurea si è inserito nell’ambito di questo
progetto di ricerca volto allo sviluppo delle carbossammidi a struttura bifenilica ed è consistito quindi nel sintetizzare alcuni dei nuovi derivati previsti. In particolare mi sono occupata dell’inserimento del sostituente fenilico nella posizione 5; delle tre possibili ammidi in posizione 1 e dell’introduzione, in posizione 3, del
raggruppamento benzilico e p-fluorobenzilico. I nuovi composti da me sintetizzati (4-11) sono mostrati nella Figura 14.
51 OMe NH O 4 6 OMe NH O OMe NH O F 5 7 OMe NH O 8 OMe NH O 9 OMe NH O F 10 OMe NH O F 11 OMe NH O F
Figura 14. Nuovi derivati bifenilici sintetizzati.
I composti 4-11 sono stati preparati come mostrato nello Schema 1. L’intermedio chiave della sintesi è stato l’acido arilboronico 14. Esso è stato ottenuto mediante una “borilazione” di Miyaura204 a partire dall’estere metilico
dell’acido 3-bromo-2-metossibenzoico 13, seguita da una idrolisi con ammonio acetato e sodio metaperiodato. L’intermedio 13 è stato facilmente preparato dal
precursore acido commerciale 12 per trattamento con metanolo ed H2SO4
concentrato.205 La reazione di Miyaura è stata effettuata trattando il precursore 13 con bis(pinacolborano) in presenza di bis(difenilfosfina)ferrocenedicloropalladio(II)
52
e potassio acetato in diossano anidro. Il corrispondente estere pinacolico così ottenuto è stato quindi sottoposto ad idrolisi in presenza di ammonio acetato e sodio periodato in acetone/acqua.206 L’acido boronico 14 è stato quindi sottoposto ad una reazione di cross-coupling, impiegando l’opportuno alogenuro benzilico (p-
fluoro-benzilbromuro oppure benzilbromuro) in presenza di carbonato di sodio, tetrakis(trifenilfosfina)palladio(0) come catalizzatore, in diossano/acqua207 per fornire così i derivati 15-16. Questi ultimi sono stati trattati con bromo in cloroformio,208 ottenendo in parte i composti desiderati, cioè quelli bromurati in posizione para rispetto al metossile (19-20), e in parte i derivati bromurati nella stessa posizione, ma anche demetilati sulla posizione 2 (17-18). Gli intermedi 17 e
18 sono stati poi convertiti rispettivamente nei derivati 19 e 20, mediante una
reazione di metilazione, realizzata impiegando solfato dimetilico e sodio idrossido in presenza di tetrabutilammonio bromuro in acqua/diclorometano.209 I derivati 19 e 20 sono stati quindi sottoposti una reazione di cross-coupling nelle condizioni di Suzuki, impiegando acido fenilboronico, in presenza di sodio carbonato acquoso, tetrakis(trifenilfosfina)palladio(0) in metanolo/toluene.210 Gli intermedi 21 e 22 così ottenuti, sono stati convertiti nei corrispondenti derivati acidi 23 e 24, mediante idrolisi del gruppo estereo con potassio idrossido in metanolo.211 Il trattamento dei derivati acidi 23 e 24 con cloruro di tionile, seguito da reazione con l'opportuna ammina, ovvero cicloeptilammina, trans-4-metilcicloesilammina oppure 4- metilcicloesilammina (miscela cis/trans) in diclorometano,209 ha infine permesso l'ottenimento dei prodotti finali desiderati 4-11. In particolare, per quanto riguarda gli isomeri cis 7 e 10, questi sono stati separati dai corrispondenti derivati trans, mediante cromatografia su colonna di gel di silice, recuperando in parte anche la miscela cis/trans (8 e 11). I due isomeri ottenuti dalla reazione sono stati distinti in
53
base agli spettri di risonanza magnetica nucleare protonica, ovvero in base al valore di chemical shift del protone in al gruppo amminico sul nucleo 1-ammino- 4-metilcicloesanico: nell'isomero cis, tale protone risuona a ppm più alti ( = 4.33- 4.36), rispetto al medesimo protone nell'isomero trans ( = 3.90-4.00) (Figura 15).
cis trans
= 4.33-4.36 = 3.90-4.00
Figura 15. Rappresentazione generale degli isomeri cis e trans dei prodotti finali e relativo chimica shift del protone in all’azoto.
Durante il mio lavoro di tesi si è resa necessaria l’ottimizzazione di alcuni
passaggi dello schema sintetico sotto riportato (Schema 1) allo scopo di ottenere rese accettabili e, in alcuni casi, ridurre i tempi di reazione.
In particolare, il secondo passaggio della via sintetica, che consente l’ottenimento dell’acido arilboronico 14, intermedio chiave della suddetta
procedura sintetica, ha necessitato di una precisa messa a punto al fine di ottenere tale composto sufficientemente puro ed in rese accettabili. Come detto prima, la sintesi dell’acido arilboronico 14 prevede due diversi step (descritti in dettaglio in Figura 16): la “borilazione” di Miyaura204
a partire dal composto 13, seguita da una idrolisi di quest’ultimo con ammonio acetato e sodio metaperiodato
(Figura 16C).
La sintesi di Miyaura prevede la reazione tra l’opportuno alogenuro arilico con
54
come catalizzatore e potassio acetato come base e conduce alla formazione dell’estere arilboronico corrispondente (Figura 16A).
Il meccanismo di reazione è rappresentato dal ciclo catalitico illustrato in Figura 16B: a) l’addizione ossidativa dell’alogenuro arilico al Pd(0) fornisce il complesso ArPd(II)X; b) la transmetallazione tra quest’ultimo addotto e il bis(pinacolborano) genera l’intermedio ArPd(II)B(OR)2; c) l’eliminazione riduttiva fornisce l’estere
arilboronico e rigenera il complesso del Pd(0).
Inizialmente la preparazione dell’acido boronico 14 è stata effettuata seguendo
la procedura descritta in letteratura,206 cioè l’estere metilico dell’acido 3-bromo-2- metossibenzoico 13 è stato trattato con bis(pinacolborano) e potassio acetato, in diossano anidro, in presenza di bis(difenilfosfina)ferrocenedicloropalladio(II) complessato con CH2Cl2 (5 mol%). La miscela di reazione è stata poi scaldata a
110 °C per due ore, ottenendo così l’estere arilboronico, il quale è stato
sottoposto, senza ulteriore purificazione, al successivo step di idrolisi, realizzato in presenza di sodio metaperiodato (3 eq) e ammonio acetato (3 eq) in acetone/acqua. In questo modo è stato possibile isolare l’acido boronico 14 con
55
Figura 16. A. Sintesi di un estere pinacolico mediante reazione di Miyaura; B. Meccanismo di reazione catalitico della reazione di Miyaura; C. Idrolisi di un estere pinacolico e formazione dell’acido boronico.
In seguito, si è osservato che raddoppiando gli equivalenti di sodio metaperiodato e di ammonio acetato utilizzati nello step di idrolisi dell’estere
pinacolico, non si otteneva alcun evidente incremento della resa, ma soltanto una riduzione dei tempi di reazione (da 48 a 24 ore). Successivamente, nel tentativo di purificare mediante cromatografia su colonna l’estere pinacolico, è stato possibile
56
individuare il sottoprodotto dello step di borilazione, corrispondente al derivato de- bromurato del composto di partenza 13. Per questa ragione, allo scopo di ridurre la formazione di questo prodotto indesiderato, la reazione di borilazione è stata ripetuta diminuendo la quantità di catalizzatore (Pd(dppf)Cl2) fino a 0.03 eq
(piuttosto che 0.05 eq). Effettuando la reazione in queste condizioni, l’acido
boronico 14 è stato ottenuto con una resa del 73%.
Inoltre, per ridurre ulteriormente i tempi di reazione, lo step di borilazione è stato effettuato mediante riscaldamento al microonde, che ha consentito di ottenere l’estere pinacolico desiderato in 30 minuti a 130 °C piuttosto che in 2 ore a 110 °C,
come descritto in letteratura.
Infine, per ottimizzare ulteriormente la via sintetica sopra riportata, sono state effettuate delle modifiche anche ai passaggi c ed f (Schema 1). Si tratta in entrambi i casi di reazioni di cross-coupling di tipo Suzuki effettuate, come descritto in letteratura, a partire dall’opportuno bromuro benzilico (p-
fluorobenzilbromuro o benzilbromuro) o arilico (composti 19-20) in presenza di carbonato di sodio come base, tetrakis(trifenilfosfina)palladio(0) come catalizzatore e dell’idoneo acido boronico. In questo caso l’ottimizzazione dei due
passaggi ha riguardato principalmente la riduzione dei tempi di reazione, mediante l’utilizzo del microonde. Quindi, è stato possibile effettuare il passaggio c in 15
minuti a 140 °C piuttosto che in 4 ore a 100 °C, e il passaggio f in 10 minuti a 150 °C piuttosto che in 24 ore a 90 °C.
57
Schema 1
4-11
Reagenti e Condizioni: a) MeOH, H2SO4 (conc.), 85 °C, overnight; b) 1) Pd(dppf)Cl2, KOAc,
(PinB)2, 1,4-diossano anidro, 110 °C, 2 h; 2) NH4OAc, NaIO4, acetone/H2O, t. a., overnight; c) R1-
Br, Pd(PPh3)4, 1,4-diossano, H2O, MW (130 °C, 5 bar), 30 min; d) Br2, CHCl3, t. a., 24 h; e) TBAB,
(CH3)2SO4, NaOH (aq), CH2Cl2, t. a., overnight; f) acido fenilboronico, Pd(OAc)2, PPh3, Na2CO3 (aq),
toluene anidro, MW (150 °C, 5 bar), 10-20 min.; g) KOH, MeOH, 75 °C, overnight; h) 1) SOCl2
riflusso, 30 min.; 2) R2-NH2, CHCl2 anidro, t. a., overnight.
Per quanto riguarda i saggi biologici atti a valutare l’affinità/selettività dei nuovi
composti sintetizzati nei confronti dei recettori cannabinoidi, sono attualmente disponibili i dati preliminari di binding relativi a quattro derivati bifenil- carbossammidici, ovvero i composti 4, 9, 10 e 11. Tali risultati sono mostrati nella Tabella 1.
58
Tabella 1. Dati di binding relativi ad alcune nuovi derivati bifenil-
carbossammidici. Composto Struttura Ki (CB1) Ki (CB2) S. I.a 4 OMe NH O F 1276 nM 75.2 nM 17 9 OMe NH O 1 M 1 M 10 OMe NH O 1 M 1 M 11 OMe NH O 1 M 1 M a “Selectivity Index” = K i(CB1)/Ki(CB2)
59
L’affinità dei nuovi composti è stata determinata mediante esperimenti di
spiazzamento competitivo del radioligando di riferimento [3H]CP-55,940, utilizzando membrane di cellule CHO-K1 transfettate, esprimenti recettori hCB1 e
hCB2.
Come si può notare dai risultati, il derivato 4, recante il cicloeptile come sostituente ammidico in posizione 1, un p-fluorobenzile in posizione 3 ed un fenile in posizione 5, mostra un’apprezzabile valore di affinità nei confronti del recettore
CB2 (Ki = 75.2 nM), sebbene inferiore a quelli dei derivati precedentemente
sviluppati; inoltre presenta una significativa CB2-selettività, con un valore di “Selectivity Index” pari a circa 17.
Gli altri tre derivati (9, 10 e 11) risultano invece praticamente privi di affinità nei confronti di entrambi i sottotipi recettoriali.
I risultati ottenuti sono sicuramente incoraggianti per una ulteriore ottimizzazione strutturale di questo tipo di molecole.
I saggi biologici atti a valutare l’affinità/selettività dei restanti composti nei confronti dei recettori cannabinoidi, sono attualmente in corso.
60
61
La struttura di tutti i composti è stata confermata per mezzo della spettrometria di risonanza magnetica nucleare protonica (1H-NMR).
Gli spettri 1H-NMR sono stati registrati utilizzando uno spettrometro Bruker Avance IIITM 400 (operante a 400 MHz) e sono riferiti al segnale residuo del solvente. I chemical shifts sono espressi in ppm e le costanti di accoppiamento J sono espresse in Hz.
Le evaporazioni sono state eseguite sotto vuoto in evaporatore rotante. Le TLC analitiche sono state eseguite usando lastrine di gel di silice 60 F254 (MERCK) contenenti un indicatore fluorescente; le varie macchie sono state valutate per mezzo di lampada UV (254 nm). Per la cromatografie su colonna è stato usato gel di silice 60 (0.040-0.063 mm) (MERCK).
Le procedure assiste dal microonde sono state effettuate con un Biotage iniziator.
62
SINTESI DEL COMPOSTO 13
La reazione è stata condotta in un pallone da 100 mL dotato di refrigerante e tappo al cloruro di calcio.
Ad una soluzione di acido 3-bromo-2-metossibenzoico commerciale 12 (2.0 g, 8.66 mmoli) in metanolo (40.0 mL) è stato aggiunto acido solforico concentrato (2.0 mL). La soluzione così ottenuta è stata scaldata a riflusso (85 °C), sotto agitazione magnetica, overnight.
Dopo raffreddamento fino a temperatura ambiente, al contenuto del pallone è stata aggiunta una soluzione satura di bicarbonato di sodio in modo da ottenere una soluzione a pH = 7 (formazione di precipitato bianco).
Il tutto è stato trasferito in un imbuto separatore ed estratto con acetato di etile. La fase organica, essiccata con solfato di sodio anidro, filtrata ed evaporata, ha fornito 1.37 g di composto 13 puro (resa: 65%).
1
H-NMR (CDCl3) (ppm): 7.75 (dd, 1H, J = 7.6 Hz, J = 1.6 Hz), 7.73 (dd, 1H, J
63
SINTESI DEL COMPOSTO 14
La reazione è stata condotta in una fiala per microonde, sotto azoto.
Ad una soluzione del composto 13 (1.50 g, 6.0 mmoli) in diossano anidro (13.0 mL) sono stati aggiunti in successione bis(pinacol)borano (390.0 mg, 7.65 mmoli), acetato di potassio (301.0 mg; 15.35 mmoli) e bis(difenilfosfina)ferrocenedicloropalladio(II) (112.0 mg, 0.53 mmoli). La fiala è stata poi riscaldata al microonde (130 °C, 5 bar) per 30 minuti. Il contenuto della fiala è stato trasferito in un pallone da 250 mL ed il solvente è stato rimosso per evaporazione sottovuoto. L’estere boronico grezzo ottenuto dallo step precedente
è stato utilizzato per lo step successivo senza ulteriore purificazione. È stato quindi dissolto in una miscela di acetone (11.0 mL) ed acqua (11.0 mL) e trattato con metaperiodato di sodio (6.6 g, 30.6 mmoli) e acetato di ammonio (2.4 g, 30.6 mmoli). La miscela risultante è stata lasciata sotto agitazione magnetica, a temperatura ambiente e monitorata mediante TLC. Dopo completo consumo del prodotto di partenza, la miscela di reazione è stata filtrata sotto vuoto. Il filtrato ottenuto è stato concentrato al rotavapor fino alla completa evaporazione dell’acetone. Il residuo è stato trasferito in imbuto separatore ed estratto con
acetato di etile. La fase organica, essiccata su solfato di sodio anidro, è stata filtrata ed evaporata. Il grezzo di reazione oleoso è stato purificato mediante cromatografia su colonna di gel di silice flash (Ø = 3.5 cm, h = 18 cm), usando come miscela eluente esano/acetato di etile 6:4. Le opportune frazioni, riunite e evaporate hanno fornito 779.2 mg di composto 14 puro (resa: 72%).
1
H-NMR (CDCl3) (ppm): 8,03 (dd, 1H, J = 7,2 Hz, J = 2 Hz), 7.96 (dd, 1H, J =
64
SINTESI DEL COMPOSTO 15
Metodo 1
La reazione è stata condotta in fiala.
All’interno della fiala sono stati introdotti: 4-fluorobenzilbromuro (582.3 mg, 3.08
mmoli), carbonato di sodio (685.8 mg, 6.45 mmoli), il composto 14 (647.1 mg, 3.08 mmoli), tetrakis(trifenilfosfina)palladio(0) (71.1 mg, 0.06 mmoli), DME (12.3 mL) e acqua (6.1 mL). La fiala è stata chiusa, la miscela di reazione scaldata a 100 °C e lasciata reagire per 4 h sotto agitazione magnetica.
Dopo raffreddamento, il contenuto della fiala è stato trasferito in imbuto separatore ed estratta con acetato di etile. La fase organica, essiccata su solfato di sodio anidro, è stata filtrata ed evaporata.
Il grezzo di reazione (1.05 g) è stato purificato mediante cromatografia su colonna di gel di silice flash (Ø = 3.5 cm, h = 18 cm) usando come miscela eluente esano/acetato di etile 9:1.
Le opportune frazioni, riunite e evaporate hanno fornito 478 mg di composto 15 puro (resa: 57%).
Metodo 2
La reazione è stata condotta in una fiala per microonde, sotto azoto.
All’interno della fiala sono stati introdotti: il composto 14, (200.0 mg, 0.95
mmoli), 4-fluorobenzilbromuro (0.12 mL, 0.95 mmoli), carbonato di sodio (212 mg, 2 mmoli), tetrakis(trifenilfosfina)palladio(0) (22.0 mg, 0.02 mmoli), diossano anidro (3.8 mL) e acqua (1.9 mL). La fiala è stata chiusa e scaldata al microonde (140 °C, 5 bar), per 15 minuti. Il contenuto della fiala è stato poi trasferito in imbuto
65
separatore, estratto con acetato di etile e lavato con brine. La fase organica, essiccata su solfato di sodio anidro, è stata filtrata ed evaporata.
Il grezzo di reazione oleoso così ottenuto è stato purificato mediante cromatografia su colonna di gel di silice flash (Ø = 3.5 cm, h = 18 cm) usando come miscela eluente esano/acetato di etile 9:1.
Le opportune frazioni, riunite e evaporate hanno fornito 164.9 mg di composto
15 puro (resa: 63%).
1
H-NMR (CDCl3) (ppm): 7.70 (dd, 1H, J = 7.7 Hz, J = 1.8 Hz), 7.27 (dd, 1H, J
= 7.5 Hz, J = 1.8 Hz), 7.19-7.03 (m, 3H), 7.02-6.88 (m, 2H), 4.01 (s, 2H), 3.92 (s, 3H), 3.73 (s, 3H).
66
SINTESI DEL COMPOSTO 16
La reazione è stata condotta in una fiala per microonde, sotto azoto.
All’interno della fiala sono stati introdotti: il composto 14 (390.0 mg, 1.85 mmoli),
benzilbromuro (0.2 mL 1.54 mmoli), carbonato di sodio (334.0 mg, 3.23 mmoli), tetrakis(trifenilfosfina)palladio(0) (35.7 mg, 0.03 mmoli), diossano anidro (6.2 mL) e acqua (3.1 mL). La fiala è stata chiusa e scaldata al microonde (140 °C, 5 bar), per 15 minuti.
Il contenuto della fiala è stato poi trasferito in imbuto separatore, estratto con acetato di etile e lavato con brine. La fase organica, essiccata su solfato di sodio anidro, è stata filtrata ed evaporata.
Il grezzo di reazione (480.0 mg) ottenuto è stato purificato mediante cromatografia su colonna di gel di silice flash (Ø = 3.5 cm, h = 18) cm usando come miscela eluente esano/acetato di etile 9:1.
Le opportune frazioni, riunite e evaporate hanno fornito 309.5 mg di composto
16 puro (resa: 66%).
1
H-NMR (CDCl3) (ppm): 7.67 (dd, 1H, J = 7.7 Hz, J = 1.8 Hz), 7.30-7.13 (m,
67
SINTESI DEI COMPOSTI 17-19
La reazione è stata condotta in un pallone da 100 mL munito di tappo al cloruro di calcio.
Il composto 15 (120.0 mg, 0.43 mmol) è stato dissolto cloroformio (0.7 mL) e alla soluzione risultante è stata aggiunta, goccia a goccia, una soluzione di bromo (0.02 mL, 0.43 mL) in cloroformio (0.4 mL). La miscela di reazione è stata poi lasciata sotto agitazione magnetica, a temperatura ambiente, overnight. Il contenuto del pallone è stato trasferito in un imbuto separatore ed estratto con acetato di etile. La fase organica, essiccata su solfato di sodio anidro è stata filtrata ed evaporata.
Il grezzo di reazione (olio giallo denso) è stato purificato mediante cromatografia su colonna di gel di silice flash (Ø = 2 cm, h = 20 cm) usando come miscela eluente esano/acetato di etile 9:1.
Le opportune frazioni, riunite e evaporate hanno fornito 40.2 mg (resa : 24%) di composto 17 puro e 72.8 mg di composto 19 puro (resa: 42%).
Composto 17 1 H-NMR (CDCl3) (ppm): 11.05 (s, 1H), 7.85 (d, 1H, J = 2.6 Hz), 7.32 (d, 1H, J = 2.6 Hz), 7.22-7.16 (m, 2H), 7.02-6.92 (m, 2H), 3.95 (s, 5H), 3.88 (s, 3H), 3.69 (s, 3H). Composto 19 1 H-NMR (CDCl3) (ppm): 7.82 (d, 1H, J = 2.2 Hz), 7.36 (d, 1H, J = 2.6 Hz), 7.18-7.10 (m, 2H), 7.02-6.94 (m, 2H), 3.96 (s, 2H), 3.92 (s, 3H), 3.72 (s, 3H).
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SINTESI DEL COMPOSTO 19 A PARTIRE DA 17
La reazione è stata condotta in un pallone da 50 mL munito di tappo al cloruro di calcio.
Ad una soluzione del composto 17 (220.0 mg, 0.65 mmoli) in diclorometano (2.2 mL) si aggiungono in successione tetra-n-butilammoniobromuro (20.9 mg, 0.06 mmoli), idrossido di sodio (75.6 mg, 1.89 mmoli) previamente solubilizzato in acqua (1.1 mL) e dimetilsolfato (0.1 mL, 1.28 mmoli). La miscela di reazione è stata poi lasciata sotto agitazione magnetica, a temperatura ambiente, overnight.
Successivamente, al contenuto del pallone è stato aggiunto cloruro di ammonio (0.2 g) ed acido cloridrico acquoso al 10% fino ad ottenere una soluzione avente pH = 5-6.
La miscela è stata quindi trasferita in imbuto separatore ed estratta con diclorometano. La fase organica, essiccata su solfato di sodio anidro, è stata