DERIVATI CARBOSSAMMIDICI A STRUTTURA BIFENILICA QUALI NUOVI LIGANDI SELETTIVI PER IL RECETTORE CB2

UNIVERSITÀ DI PISA

D

IPARTIMENTO DI

F

ARMACIA

Corso di Laurea Specialistica in Chimica e Tecnologia

Farmaceutiche

Tesi di Laurea

:

D

ERIVATI

C

ARBOSSAMMIDICI A

S

TRUTTURA

B

IFENILICA

Q

UALI

N

UOVI

L

IGANDI

S

ELETTIVI PER

IL

R

ECETTORE

C

ANNABINOIDE

CB

Relatori:

Correlatore:

Prof. Clementina Manera

Dott.ssa Chiara Arena

Dott. Simone Bertini

Candidata:

Gianna Riccio (N° MATRICOLA 410965)

Settore Scientifico Disciplinare: CHIM-08

2

I

NDICE

INTRODUZIONE GENERALE

CANNABIS: BREVE DESCRIZIONE BOTANICA……….5

CANNABIS: TASSONOMIA………..………6

I CANNABINOIDI………..………..8

I RECETTORI CANNABINOIDI………..………..9

GLI ENDOCANNABINOIDI……….………11

BIOSINTESI E CATABOLISMO DEGLI ENDOCANNABINOIDI……….…….13

PANORAMICA SUI LIGANDI PER I RECETTORI CANNABINOIDI………….…..15

CB1/CB2-AGONISTI……….……..15

AGONISTI CB1-SELETTIVI……….……..18

AGONISTI CB2-SELETTIVI……….……..19

ANTAGONISTI/AGONISTI INVERSI CB1-SELETTIVI……….……….20

ANTAGONISTI/AGONISTI INVERSI CB2-SELETTIVI……….……….22

ANTAGONISTI NEUTRALI……….…………23

MECCANISMI DI TRASDUZIONE DEL SEGNALE DEI RECETTORI CANNABINOIDI………23

MODULAZIONE DELL’ADENILATO CICLASI………...24

MODULAZIONE DEI CANALI IONICI……….………….26

REGOLAZIONE DEL CALCIO INTRACELLULARE……….……….27

TRASDUZIONE DEL SEGNALE MEDIANTE LA CHINASI DELL’ADESIONE FOCALE (FAK)……….………….28

TRASDUZIONE DEL SEGNALE ATTRAVERSO LA “MITOGEN ACTIVATED” PROTEINA CHINASI (MAPK) E LA FOSFATIDILINOSITOLO-3-CHINASI (PI3K)……….……….28

3

REGOLAZIONE DELLA OSSIDO NITRICO SINTETASI…………..………...30 DISTRIBUZIONE TISSUTALE DEI RECETTORI CANNABINOIDI…….…………31 DISTRIBUZIONE NEURONALE………..………..31 IMMUNODISTRIBUZIONE……….……….………34 ATTIVAZIONE DEI RECETTORI CANNABINOIDI: EFFETTI SULLA NEUROTRASMISSIONE……….………...35 ATTIVAZIONE DEI RECETTORI CANNABINOIDI: EFFETTI IMMUNOLOGICI………...….39

INTRODUZIONE ALLA PARTE SPERIMENTALE

PARTE SPERIMENTALE

4

5

LA CANNABIS: BREVE DESCRIZIONE BOTANICA

La cannabis è una pianta arbustiva a ciclo annuale appartenente alla famiglia delle Cannabaceae. Originaria dell'Asia Centrale, si è ampiamente diffusa nel corso dei secoli e cresce spontaneamente in aree temperate e tropicali o è anche coltivata.

La pianta erbacea della cannabis (Figura 1) è un arbusto la cui altezza varia tra 1.5 e 2 metri, presenta una lunga radice a fittone e un fusto sottile, eretto o ramificato con numerose foglie brattee.

Figura 1. Illustrazione della Cannabis sativa L., Franz Eugen Köhler, in Köhler's Medizinal-Pflanzen (1887).

Le foglie, picciolate e provviste di stipole (appendici che si differenziano alla base del picciolo delle foglie), hanno un aspetto vellutato, sono palmate e sono composte da foglioline lanceolate e seghettate che inizialmente si sviluppano

6

opposte poi, durante la fioritura, alternate. Sono costituite dapprima da una fogliolina, poi da 3, 5, 7, fino a un massimo di 13, a seconda della quantità di luce quotidiana.

Salvo rari casi di ermafroditismo che si possono verificare solo se la pianta cresce in ambienti particolarmente ostili, la cannabis è dioica, esistono cioè esemplari con fiori maschili ed altri con fiori femminili; i fiori unisessuali crescono su individui di sesso diverso. I fiori maschili (staminiferi), sono riuniti in pannocchie terminali, sono di color bianco-giallognolo e, giunti a maturazione, rilasciano il polline; la pianta maschio, giunta alla fine del suo ciclo, muore. I fiori femminili (pistilliferi), portanti il seme, sono composti da un calice contenente un ovulo pendulo e da uno o due pistilli; è nel calice che si trova la più alta concentrazione di resina ed è lì che, in caso di fertilizzazione, comincia a formarsi il seme. La pianta germina in primavera e fiorisce in estate inoltrata. L'impollinazione avviene mediante il trasporto operato dal vento (anemofila).1

CANNABIS: TASSONOMIA

La tassonomia include la cannabis nella famiglia delle Cannabacee o

Cannabinacee.

Schultes suddivide il genere (Cannabis) in tre specie:

• Cannabis sativa (volg. canapa), alta fino a tre metri e dalla forma

piramidale;

• Cannabis indica (volg. canapa indiana) più bassa della precedente e con

7

• Cannabis ruderalis (volg. canapa russa o ruderale o americana), alta al

massimo mezzo metro e priva di rami.

Queste non sono specie diverse dal punto di vista morfologico; sono in realtà delle varietà chimiche, ossia con differente contenuto di sostanze peculiari di questa pianta (i “cannabinoidi”, vedi paragrafi successivi).

Sulla tassonomia esatta sono ancora oggi in corso controversie; Small e Cronquist, distinguono una sola specie (sativa) comprendente due sottospecie, ciascuna con due varietà:

Cannabis sativa L.

ssp. indica (Lam.) E. Small & Cronq. var. indica

var. kafiristanica Vavilov ssp sativa

var. sativa

var. spontanea Vavilov

Nel 2002 Clarke e Watson hanno affermato che la specie Cannabis sativa comprenderebbe tutti gli individui (ad eccezione di alcune varietà usate per la produzione di hashish e marijuana in Afghanistan e Pakistan, che andrebbero raggruppate sotto la specie Cannabis indica). Divergenze sono sorte anche sull’appartenenza alla famiglia Cannabaceae, in quanto per il sistema Cronquist la

tassonomia sarebbe: Magnoliophyta – Magnoliopsida – Hamamelidae – Urticales – Cannabaceae. Invece per la classificazione APG (Angiosperm Phylogeny

8

Group) del 1998, la classificazione è la seguente: Magnoliophyta – Eudicotiledoni – Eudicotiledoni centrali – Rosidi – Rosales – Cannabaceae.

I CANNABINOIDI

Originariamente riferito ai composti derivanti dalla cannabis (che oggi sono denominati in particolare fitocannabinoidi), il termine “cannabinoidi” è associato a

tutti quei composti, naturali o sintetici, in grado di interagire con dei recettori specifici, denominati anch’essi recettori cannabinoidi (vedi paragrafi successivi).

I principali fitocannabinoidi sono rappresentati nella Figura 2.

H O CH₃ OH n-C5H11 9_{-Tetraidrocannabinolo} O CH₃ OH n-C₅H₁₁ 8_{-Tetraidrocannabinolo} O CH₃ OH n-C5H11 Cannabinolo HO CH₃ OH n-C₅H₁₁ Cannabidiolo HO OH n-C₅H₁₁ Cannabigerolo OH n-C₅H₁₁ O Cannabicromene OH COOH O Cannabiciclolo HO O n-C₅H₁₁ Cannabielsoina OH H H H

9

Il fitocannabinoide più importante dotato di attività biologica è il delta-9-tetraidrocannabinolo (abbrev. 9

-THC), olio viscoso rossastro, presente in elevate concentrazioni nella resina della pianta.

I cannabinoidi strutturalmente correlati al THC possono essere considerati dei dibenzopirani sostituiti, oppure dei terpenoidi sostituiti (cambia la numerazione chimica, come mostrato nella Figura 3). La numerazione dibenzopiranica è sicuramente quella più utilizzata.

O OH 6 1 2 3 4 5 7 8 9 10 11 12 13 6a 10a 10b 5' 3' 1' (a) O OH 6 1 2 3 4 5 7 8 9 10 _6' 4' 2' 1'' 3'' 5' 3' 1' (b) 5''

Figura 3. Numerazione dibenzopiranica (a sinistra) e terpenoide (a destra) del THC.

I RECETTORI CANNABINOIDI

I recettori in grado di interagire con le sostanze derivanti dalla cannabis o con altri ligandi strutturalmente simili o correlabili ad esse, vengono definiti “recettori cannabinoidi”.

Attualmente sono noti due principali recettori cannabinoidi: il recettore CB1 ed il recettore CB2.

Il recettore CB1, identificato nel 1988,2 è stato clonato dalla corteccia cerebrale di ratto,3 da cervello e testicoli umani4 e dal cervello di topo.5 Esso presenta un’omologia nella sequenza amminoacidica del 97-99% tra le varie specie. Quello

10

umano (hCB1) è costituito da 472 amminoacidi, quello del ratto e del topo da 473. Il recettore CB1 è caratterizzato da sette domini transmembranali (Figura 4). Una variante del recettore CB1, denominata CB1A,6 è stata isolata anche dal polmone umano. Overall homology = 44% Transmembrane homology = 68% CB1 CB2 1 1 360 472

Figura 4. Rappresentazione schematica dei recettori CB1 e CB2.7

Il recettore CB2 è stato clonato nel 1993 da cellule leucemiche umane HL-60 (human promyelocytic leukaemia cells).8 Quello umano (hCB2) è costituito da 360 amminoacidi e presenta anch’esso sette domini transmembranali (Figura 4). Rispetto all’hCB1 presenta un dominio ammino-terminale più corto, dove non vi è

sostanziale conservazione. L’omologia nella sequenza amminoacidica tra CB1 e CB2 è del 68% per quanto riguarda i domini transmembranali, e solo del 44% per quanto riguarda la totalità della proteina.8

11

GLI ENDOCANNABINOIDI

La scoperta e la clonazione dei recettori cannabinoidi è stata seguita dall’identificazione di composti, prodotti dai tessuti dei mammiferi, in grado di

attivarli. Il primo di tali cannabinoidi endogeni (detti quindi endocannabinoidi) ad essere identificato è stata l’anandamide (N-arachidonoil etanolammina, abbrev.

AEA) nel 1992; poi, pochi anni dopo, nel 1995, il 2-arachidonoilglicerolo (abbrev. 2-AG).9, 10 Entrambi vengono sintetizzati “on demand” in risposta ad elevati livelli intracellulari di Ca.11, 12

AEA 2-AG

Altre sostanze proposte come endocannabinoidi sono 2-arachidonil-glicerol-etere (noladin 2-arachidonil-glicerol-etere),la N-arachidonoil-dopamina (NADA), il 2-palmitoil-glicerolo, l’oleamide, la O-arachidonoil-etanolammina (virodamina) e la N-oleoil-dopamina

(OLDA).13 AEA e 2-AG sono i più noti e più studiati, pertanto vengono considerati endocannabinoidi maggiori.

Noladin etere NADA

12

Alcuni degli effetti prodotti dal rilascio endogeno di AEA e 2-AG sembrano incrementati mediante quello che viene definito “entourage effect”, ovvero il

co-rilascio di altri derivati endogeni degli acidi grassi (inclusi oleamide e 2-palmitoil-glicerolo) che potenziano i due endocannabinoidi maggiori.

Gli endocannabinoidi esercitano sia un’azione neuromodulatoria, attraverso l’inibizione del rilascio di neurotrasmettitori (con un meccanismo di segnalazione

retrograda),14 sia un’azione immunomodulatoria, mediante la regolazione del rilascio di citochine e della migrazione delle cellule immunitarie.15, 16

È ormai generalmente accettato che in certi stati patologici il rilascio di endocannabinoidi aumenta in particolari tessuti, ma vi sono anche evidenze che questa “up-regulation” del sistema endocannabinoide conduce in molti casi alla soppressione dei sintomi non voluti e che quindi sia in qualche modo “auto-protettiva”, o addirittura vi sono situazioni in cui l’aumento degli endocannabinoidi

produce esso stesso degli effetti indesiderati.13 Per fare alcuni esempi, il rilascio di endocannabinoidi migliora la spasticità muscolare nella sclerosi multipla ed allevia il dolore infiammatorio, ma d’altro canto incrementa l’obesità o crea problemi di fertilità in alcune donne. Per questo motivo, l’interesse della ricerca è oggi rivolto non solo all’individuazione di composti che agiscano in modo diretto sui recettori

cannabinoidi (da agonisti o da agonisti inversi/antagonisti), ma anche di composti che influenzino l’attività degli endocannabinoidi in maniera indiretta,

essenzialmente mediante due meccanismi: 1) modulazione allosterica dell’attivazione dei recettori indotta dagli endocannabinoidi; 2) variazione dei livelli

degli endocannabinoidi agendo sugli enzimi preposti alla loro biosintesi o su quelli deputati alla loro degradazione.

13

BIOSINTESI E CATABOLISMO DEGLI ENDOCANNABINOIDI

La biosintesi ed il catabolismo dell’anandamide sono rappresentati nella Figura

5.17 L'anandamide viene prodotta a partire da una piccola famiglia di fosfolipidi di membrana, le N-arachidonoil-fosfatidil-etanolammine (NarPE), prodotte a partire dai fosfolipidi e da fosfatidiletanolammina, mediante una aciltransferasi calcio-dipendente. Da questo punto in poi, la precisa via biosintetica è controversa, e sono state suggerite almeno 4 alternative:

1) La fosfolipasi D N-acilfosfatidiletanolammina-specifica (NAPE-PLD) converte direttamente NArPE in anandamide.

2) La -idrolasi 4 (ABHD4) catalizza la conversione di NarPE in liso-NArPE e quindi in glicerofosfoanandamide che, mediante la glicerofosfodiesterasi-1 (GDE1) viene convertita in anandamide.

3) La formazione di liso-NArPE sembra avvenire anche mediante una fosfolipasi A2 solubile, seguita dalla conversione diretta in anandamide, mediante

una liso-fosfolipasi D.

4) Una fosfolipasi C non ancora ben definita converte NArPE in fosfo-anandamide, seguita da una fosfatasi (come la protein tirosin fosfatasi N22 o la inositolo fosfatasi SHIP2) che converte la fosfo-anandamide in anandamide.

L'anandamide viene inattivata in seguito all'idrolisi del gruppo ammidico ad opera dell'enzima acido grasso ammide idrolasi (“Fatty Acid Amide Idrolase”, FAAH).

14 AA P -O-Et-NH2 + P -O-Et-NH-AA NArPE Aciltransferasi Ca2+_-dipendente NAPE-PLD AA-NH-Et-OH ANANDAMIDE P -O-Et-NH-AA LysoNArPE OH LysoPLD ABHD4 ABHD4 P -O-Et-NH-AA OH OH Glicero-fosfo-anandamide GDE1 sPLA2 1 2 2 2 3 3 P -O-Et-NH-AA Fosfono--anandamide PLC 4 4 PTPN22 SHIP2 Fosfolipide Fosfatidil--etanolammina FAAH AA + HO-Et-NH2

Figura 5. Biosintesi e catabolismo dell’anandamide.17

La biosintesi ed il catabolismo del 2-AG sono mostrate nella Figura 6.17 I precursori biosintetici di 2-AG, ovvero gli sn-1-acil-2-arachidonoilgliceroli (AArG) vengono prodotti a partire dai fosfatidilinositidi (o frosfatidilinositoli) di membrana, ad opera della fosfolipasi C (PLC). Gli AArG vengono quindi convertiti in 2-AG, ad opera di una qualsiasi delle due isoforme ( o ) della sn-1-diacilglidcerolo lipasi (DAGL o DAGL. Quest’ultimo enzima è sensibile al Ca2+

ed attivato dal glutatione.

Tra gli svariati enzimi proposti per l'inattivazione del 2-AG, la monoacilglicerolo lipasi (MAGL) pre-sinaptica è sicuramente quello più importante (un’altro enzima,

quale la ,-idrolasi 6, di cui è stata recentemente dimostrata la capacità di controllare i livelli di 2-AG nei neuroni e nella microglia, è localizzato post-sinapticamente). Da notare come l'inositolo trifosfato, prodotto in seguito alla formazione di AArG, stimoli la mobilizzazione di Ca2+ intracellulare attraverso

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specifici recettori sul reticolo endoplasmatico, contribuendo alla stimolazione di DAGL. AArG PLC Fosfatidilinositoli P -In- P - P AA AA OH Ca2+ + P -In- P - P Inositolo trifosfato DAGLo  AA OH OH 2-AG Recettore dell’IP3 Ca2+ OH OH OH AA + MAGL

Figura 6. Biosintesi e catabolismo del 2-AG.17

PANORAMICA SUI LIGANDI PER I RECETTORI CANNABINOIDI18

CB1/CB2 Agonisti

I composti in grado di attivare all’incirca con la stessa potenza i recettori CB1 e

CB2 rientrano essenzialmente in una delle seguenti quattro classi chimiche: 1)

Cannabinoidi classici; 2) Cannabinoidi non classici; 3) Amminoalchilindoli; 4) Eicosanoidi.

1) Cannabinoidi classici. Sono composti dibenzopiranici, sia derivati naturali che analoghi sintetici. Gli esempi più importanti sono: il (-)-9

-THC che si lega con uguale affinità ai recettori CB1 e CB2 e si comporta da agonista parziale su

16

entrambi. Tuttavia, presenta una maggiore efficacia sul recettore CB1; il (-)-8

-THC che ricalca il derivato precedente per quanto riguarda l’affinità recettoriale e l’efficacia nell’attivare il recettore CB1; l’HU-210 che è un cannabinoide

particolarmente potente ed i cui effetti farmacologici in vivo risultano eccezionalmente di lunga durata (tutto ciò può essere in gran parte attribuito alla presenza della catena laterale dimetileptilica, al posto di quella pentilica presente nel THC).

(-)-9-THC (-)-8-THC

HU-210

2) Cannabinoidi non classici. Sono analoghi biciclici o triciclici del THC, in cui l’anello piranico è stato rimosso. L’esempio più tipico è il CP 55,940, agonista

cannabinoide considerevolmente più potente del THC (affinità nel range del nM) ed ampiamente utilizzato come riferimento nei test di laboratorio.

17

CP 55,940

3) Amminoalchilindoli. Il prototipo di questa classe è il WIN 55,212-2, ampiamente utilizzato nella ricerca sui cannabinoidi. Presenta livelli di affinità recettoriale nel range del basso nM ma, a differenza del CP 55,940, è leggermente più affine al recettore CB2 rispetto al CB1.

WIN 55,212-2

4) Eicosanoidi. I composti più studiati di questa classe sono i già citati anandamide e 2-AG. L’anandamide, pur presentando dei livelli di affinità recettoriali molto inferiori rispetto al THC, ricalca quest’ultimo nel comportarsi da

agonista parziale sia sul recettore CB1 che sul CB2 e per il fatto che mostra un’efficacia inferiore sul recettore CB2. Il 2-AG presenta dei livelli di affinità

18

recettoriale simili a quelli dell’anandamide, tuttavia rispetto a quest’ultima, mostra

dei livelli di efficacia superiori, sia su CB1 che su CB2.

Agonisti CB1-selettivi

I primi agonisti CB1-selettivi sono stati sviluppati proprio a partire dall’anandamide, la cui leggera selettività per il recettore CB1 è stata

significativamente incrementata inserendo un gruppo metilico (R-(+)-metanandamide) sul carbonio in posizione 2’. Inoltre, tale modifica strutturale conferisce una notevole resistenza all’azione idrolitica di FAAH, per cui la

R-(+)-metanandamide ed anche il suo ciano-analogo O-1812 possono considerarsi degli analoghi metabolicamente stabili dell’anandamide.

Altri agonisti CB1-selettivi caratterizzati da elevata efficacia, ma non resistenti alla FAAH, sono la 2’-cloroetilammide (ACEA) e la

arachidonil-ciclopropilammide (ACPA).

R-(+)-metanandamide O-1812

19

Agonisti CB2-selettivi

Di questa classe fanno parte JWH-133 e JWH-015; entrambi si legano maggiormente al recettore CB2 rispetto al CB1 ma il secondo composto risulta essere meno selettivo. Altri composti di questa classe sono GW-405833 che si comporta come agonista parziale dei recettori CB2,19 HU-308, AM-1241, L-759,633 e L-759,656.20, 21 Interessante è il comportamento del composto AM-1241: si comporta da agonista nei tessuti dove i recettori CB2 sono normalmente espressi ma non in quelli dove questi sono stati inseriti geneticamente e quindi presumibilmente sovraespressi.22

JWH-133 JWH-015

20

GW-405833

Antagonisti/agonisti inversi CB1-selettivi

Il principale composto di questa classe è il diarilpirazolo SR141716A.23, 24 I Dati sperimentali dimostrano che SR141716A è maggiormente efficace nel bloccare l’azione dei CB1-agonisti piuttosto che nel dare risposte agoniste inverse e questo

sembra dovuto al fatto che esso si lega con bassa affinità a un sito di legame del recettore CB1 diverso da quello dove si lega l’agonista (sito allosterico): è dunque

il legame di SR141716A a questo sito CB1 ad essere responsabile dell’effetto agonista inverso.26-30

AM-251 e AM-281 sono analoghi di SR141716A e anch’essi vanno a bloccare gli effetti mediati dal recettore CB1; il primo mostra un’affinità 350 volte maggiore rispetto all’altro31-38

e si comporta da agonista inverso quando è somministrato da solo.31, 33, 34

Un altro composto appartenente a questa classe è il benzofurano LY320135: come SR141716A, è più affine al recettore CB1 che al CB2, può legarsi anche a recettori muscarinici e serotoninergici39 (per concentrazioni nell’ordine del M), blocca gli effetti dei CB1-agonisti40-44 e mostra attività agonista inversa in qualche via di trasduzione del segnale del recettore CB1.40, 44

21

Vi sono evidenze che tutti questi composti non siano antagonisti neutri;21, 45 essi, oltre ad essere in grado di attenuare gli effetti dei CB1-agonisti, possono essi stessi provocare risposte opposte rispetto a quelle mediate dai CB1-agonisti. Gli effetti cannabimimetici inversi possono essere attribuibili a un diretto antagonismo delle risposte evocate sui CB1 dal rilascio di endocannabinoidi, ma non sempre è così: tutti questi composti sembrano infatti produrre effetti cannabimimetici inversi mediante la riduzione, in determinati tessuti, dell’attività costitutiva dei recettori

CB145 (il “coupling” del recettore CB1 con i suoi meccanismi effettori, che può avvenire anche in assenza di endocannabinoidi o CB1-agonisti esogeni).

SR141716A AM251 LY320135 AM281

22

Antagonisti/Agonisti inversi CB2-selettivi

I principali composti di questa classe sono i composti SR14452846 e AM630:47 entrambi si legano con maggiore affinità al recettore CB2, mostrano una potenza notevole come antagonisti dei recettori CB2 e si comportano anche come agonisti inversi, producendo da soli, effetti cannabimimetici inversi a livello dei recettori CB2.20, 21, 48

In particolare, AM630 è un agonista inverso meno potente rispetto a SR14452849 e per quanto riguarda la capacità di interagire con recettori CB1, alcuni studi hanno dimostrato che esso è un debole agonista parziale;48, 50-52 in altri studi si è mostrato un debole agonista inverso.53

AM630 è in grado di “revertare” l’inibizione della produzione di cAMP (stimolata da forskolina) indotta da CP 55,940 in cellule CHO trasfettate con recettori CB2 umani, a concentrazioni nel range del nM; è inoltre in grado di incrementare la produzione di cAMP (stimolata da forskolina) nella stessa linea cellulare, quando somministrato da solo.47

23

Antagonisti neutrali

Attualmente c’è un notevole interesse nello sviluppare antagonisti neutrali, sia sul recettore CB1 che sul CB2, ovvero composti ad elevata affinità di binding, ma che mancano di effetti agonisti e agonisti inversi. Un motivo di ciò è che a differenza dei ligandi a tutt’oggi disponibili, che vengono infatti denominati

antagonisti/agonisti inversi, un antagonista neutrale può essere sfruttato per distinguere, in un sistema biologico che esprima i recettori CB2, tra l’attività cannabimimetica derivante dal rilascio di endocannabinoidi (alla quale può opporsi) e quella costitutiva, cioè indipendente dal ligando (alla quale non può opporsi).

Sebbene a tutt’oggi non siano stati in pratica sviluppati degli antagonisti neutrali

CB2-selettivi, qualche progresso è stato fatto sul fronte del recettore CB1: vi sono evidenze che il 6’’-azidoes-2’-inil-cannabidiolo (O-2654), l’O-2050 (analogo

solfonammidico del 8-THC con catena laterale acetilenica) e il VCHR (analogo di SR141716A)54 siano antagonisti neutrali CB1-selettivi.

MECCANISMI DI TRASDUZIONE DEL SEGNALE DEI RECETTORI CANNABINOIDI

La stimolazione dovuta agli agonisti dei recettori cannabinoidi CB1 e CB2 attiva la trasduzione del segnale di diverse vie della proteina Gi/o, appartenente alla

24

La proteina Gi regola l’adenilato ciclasi andando ad inibire la produzione di

AMP ciclico (cAMP) e quindi della proteina chinasi A, la quale va a regolare diverse vie di trasduzione del segnale, tra cui quella dei canali ionici e della adenosina chinasi, mentre il dimero libero  della proteina G regola la modulazione dell’attivazione della proteina chinasi “mitogen activated” e PI3K

(fosfatidilinositolo 3 chinasi). Vengono inoltre coinvolti altri secondi messaggeri, come mostrato nella Figura 7 e come spiegato più avanti nel testo.

PKA

Figura 7. Meccanismi di trasduzione del segnale coinvolti nell’attivazione dei recettori cannabinoidi.57

Modulazione dell’adenilato ciclasi

L’inibizione di tale enzima è stata riscontrata in vari distretti: a) tessuto

cerebrale e cellule neuronali che esprimono i recettori CB1; b) linfociti umani e cellule di milza di topo che esprimono i recettori CB2:48, 56, 58 questo tipo di risposta

25

è supportata dal fatto che le colture di linee cellulari che esprimono recettori CB1 o CB2 ricombinanti, portano all’inibizione di cAMP.59-62

L’attività dell’adenilato ciclasi nelle membrane di cellule N18TG2 del

neuroblastoma di topo che possiedono recettori CB1 endogeni è inibita da agonisti CB1 quali anandamide, R-(+)-methanandamide e 2-arachidonoilglicerolo.58, 63 Nelle linee cellulari CHO che esprimono invece recettori CB2, l’anandamide e la R-(+)-methanandamide inibiscono parzialmente ad alte concentrazioni l’accumulo

di cAMP indotto dalla forskolina.64-66 Questi dati suggeriscono che l'anandamide è un agonista con attività intrinseca relativamente bassa nell’inibire la produzione di

cAMP mediata dal recettore CB2, rispetto a quella mediata dal CB1.

Il 2-arachidonoilglicerolo si comporta come un agonista pieno quando va a inibire l’accumulo di cAMP mediato dalla forskolina nella linea cellulare CHO che

esprime recettori CB2 ricombinanti.66

Al contrario, la stimolazione dell’adenilato ciclasi è stata osservata in cellule trattate con la tossina della pertosse, suggerendo che in assenza di accoppiamento funzionale Gi/o, il recettore CB1 può attivare la proteina Gs.67

L'isoforma di adenilato ciclasi espressa nelle cellule sembra essere un fattore determinante per la risposta che si ottiene in seguito all’attivazione dei recettori cannabinoidi.68 Infatti, è stato dimostrato che l’espressione di recettori cannabinoidi CB1 o CB2 in cellule ospiti co-esprimenti le isoforme 1, 3, 5, 6 o 8 dell’adenilato ciclasi, porta all’inibizione dell’accumulo di cAMP. Invece, la

co-espressione di uno qualsiasi dei recettori cannabinoidi CB1 o CB2 con le isoforme 2, 4 o 7 dell’adenilato ciclasi conduce alla stimolazione dell’accumulo di cAMP.

26

Modulazione dei canali ionici

1) Modulazione dei canali ionici mediante la proteina chinasi A. I recettori CB1 attivano correnti di potassio di tipo A nelle cellule dell'ippocampo del ratto.69 Questa risposta è dovuta alla modulazione delle concentrazioni intracellulari di cAMP, regolando così la cascata fosforilativa dei canali ionici da parte della proteina chinasi A.

2) Attivazione del canale del potassio. I recettori CB1 espressi esogenicamente nelle cellule tumorali AtT-20 (tumore della ghiandola pituitaria) si accoppiano ai canali Kir in modo sensibile alla tossine della pertosse, indicando che le proteine

Gi/o fungono da trasduttori della risposta.70, 71 L’anandamide è un agonista pieno

(comparato a R-(+)-WIN55212) nell’attivazione delle correnti dei canali Kir nel

modello cellulare AtT-20.71 Tuttavia, essa si comporta da agonista parziale negli ovociti di Xenopus laevis che co-esprimono il recettore CB1 e canali Kir di tipo 1 o

4, accoppiati a proteina G.72

3) Inibizione dei canali del calcio voltaggio dipendenti (VGCCS) di tipo L, N, P e

Q. Sono tipici eventi intracellulari Gi/o-mediati, accoppiati esclusivamente

all’attivazione dei recettori CB1. I canali del calcio di tipo L, per esempio, risultano inibiti dall’anandamide e da R-(+)- WIN55212 nelle cellule muscolari lisce vascolari

del cervello di gatto che esprimono mRNA per il recettore CB1.73 I canali del calcio di tipo N sono inibiti dall’attivazione del recettore CB1 nelle cellule neuronali

attraverso la proteina Gi/o.74-77 Il 2-arachidonoilglicerolo e analoghi inibiscono la

depolarizzazione provocata dall’aumento di calcio intracellulare.78

I canali del calcio di tipo Q sono inibiti da R-(+)-WIN55212 e dall’anandamide nelle cellule

27

Regolazione del calcio intracellulare

Gli agonisti cannabinoidi portano a un rapido aumento di Ca2+ libero intracellulare nelle cellule indifferenziate N18TG2 del neuroblastoma e nelle cellule NG108-15 ibride di neuroblastoma-glioma.80, 81 Questa risposta è bloccata da SR141716A confermando l’implicazione del recettore CB1 in questo meccanismo:80, 82 per questo tipo di risposta, i composti HU-210, CP 55,940, 9 -THC, anandamide, e R-(+)-metandamide si comportano come agonisti parziali rispetto al 2-arachidonoilglicerolo.80-82 L’aumento di calcio dovuto a quest’ultimo è bloccato da un inibitore della fosfolipasi C e dalla tossina della pertosse, suggerendo un meccanismo in cui il rilascio recettore-mediato delle subunità  di Gi/o può andare ad attivare la fosfolipasi C e quindi il rilascio di IP3.80, 81

L’interazione tra recettori CB1 e fosfolipasi C è stato evidenziato in colture di

neuroni cerebellari in cui gli agonisti cannabinoidi aumentano i livelli di calcio in risposta alla stimolazione del recettore NMDA o alla depolarizzazione del K+.83 La risposta è antagonizzata da SR141716A, dalla tossina della pertosse e da un inibitore della fosfolipasi C.83 In questo studio, nel rilascio di calcio è risultato implicato il recettore per l’IP3. Al contrario, studi condotti sulla linea cellulare CHO

esprimente recettori CB1 o CB2 ricombinanti, non hanno evidenziato il rilascio di IP3 o acido fosfatidico in risposta ad anandamide o R-(+)-WIN55212, in condizioni

per cui altri recettori espressi esogenicamente interagiscono con la fosfolipasi C e provocano il rilascio di IP3. Ciò suggerisce che l’ambiente cellulare possa essere

dunque un fattore determinante in questo meccanismo di trasduzione del segnale del recettore CB1.60, 64

28

Trasduzione del segnale mediante la chinasi dell’adesione focale (FAK)

Gli agonisti cannabinoidi stimolano la fosforilazione di tirosina della chinasi della adesione focale (FAK) in diverse parti di ippocampo.81 Questo effetto può essere bloccato da SR141716A e dalla tossina della pertosse, a conferma del coinvolgimento dei recettori CB1 e della proteina Gi/o.

Trasduzione del segnale attraverso la “mitogen activated” proteina chinasi (MAPK) e la fosfatidilinositolo-3-chinasi (PI3K)

La MAPK (p38) viene attivata nella linea cellulare CHO che esprime recettori CB1 ricombinanti82 e nelle cellule endoteliali delle vene ombelicali umane che possiedono recettori endogeni CB1.83

9

-THC e HU-210 attivano MAPK (p42/44) in linee cellulari di glioma C6 ed in colture primarie di astrociti:84, 85 questi effetti sono mediati da recettori CB1 e proteine Gi/o e quindi bloccati da SR141716A e dalla tossina della pertosse.86

Vari studi evidenziano un sistema di trasduzione del segnale in cui il rilascio di subunità  della proteina Gi/o, mediato dal recettore CB1, porti all’attivazione di

PI3K, quindi alla fosforilazione di tirosina ed attivazione di Raf-1 ed infine alla conseguente fosforilazione di MAPK.84

Per quanto riguarda le funzioni cellulari regolate dall’attivazione delle MAPK, vi sono le seguenti evidenze: a) la stimolazione dell’attività di MAPK da parte di CP

55,940 in linee cellulari di cellule CHO esprimenti i recettori CB1, porta all’attivazione della pompa di scambio Na+

29

MAPK stimolata da anandamide è associata alla fosforilazione della fosfolipasi A2

citoplasmatica, al rilascio di acido arachidonico ed alla conseguente sintesi di prostaglandina E2.86

In linee cellulari di glioma C6 ed in colture primarie di astrociti, 9-THC e HU-210 incrementano il metabolismo del glucosio e la sintesi di glicogeno.85 L’attivazione di Gi/o e PI3K da parte di agonisti cannabinoidi porta all’attivazione

della proteina chinasi B/Akt negli astrociti U373MG e nella linea cellulare che esprime recettori ricombinanti CB1.87 MAPK risulta inoltre attivata nelle colture cellulari umani di promielociti HL-60 che esprimono recettori endogeni CB2 e nella linea cellulare CHO che esprime recettori ricombinanti CB2. Comunque, i cannabinoidi non riescono ad attivare la proteina chinasi B nelle cellule HL-60 e il meccanismo di PI3K non risulta regolato da recettori CB2 in questo modello.87

Trasduzione del segnale attraverso la ceramide

Studi su colture primarie di astrociti hanno evidenziato che anandamide, 9 -THC e HU-210 incrementano il metabolismo del glucosio, la sintesi dei fosfolipidi e la sintesi di glicogeno mediante un meccanismo che può essere inibito da SR141716A.85 I dati supportano il coinvolgimento di una proteina Fan (“factor associated with neutral sphingomyelinase”) che accoppia con il recettore CB1 causando l’attivazione della sfingomielinasi, il rilascio di ceramide e la

30

La ceramide, tramite un meccanismo diverso, è in grado di attivare la carnitina palmitoiltransferasi I all’interno delle membrane mitocondriali andando a stimolare la chetogenesi e l’ossidazione di acidi grassi.89

L’aumento intracellulare prolungato di ceramide, è inoltre associato ad eventi che portano a una diminuzione della proliferazione e all’apoptosi nelle cellule di

glioma.90 Questa risposta è inizialmente innescata da una stimolazione persistente di entrambi i recettori CB1 e CB2 su una linea sensibile di glioma C6 e coinvolge l’aumento della sintesi di ceramide tramite l’attivazione della serina

palmitoiltransferasi, di Raf-1 e di MAPK (p42-44).

Regolazione della ossido nitrico sintetasi

I recettori CB1 e CB2 sono coinvolti nel rilascio di ossido nitrico (NO)91 con conseguente attivazione della guanilato ciclasi ed aumento dei livelli di cGMP.92

La produzione di NO risulta stimolata dall’anandamide in frammenti di eminenza

mediana di ratto93 e da anandamide o CP 55,940 nelle sanguisughe.94-96 Gli effetti in questi tessuti sono bloccati da SR141716A e ciò suggerisce il coinvolgimento del recettore CB1 in questo meccanismo.

Anandamide e HU-210 stimolano la produzione di NO in segmenti di vena safena umana,96 nelle colture di cellule endoteliali delle arterie umane,97, 98 delle vene ombelicali99 e nei monociti;100 anche in questo caso gli effetti sono bloccati da SR141716A. Nelle colture di cellule endoteliali delle arterie umane, il rilascio di NO è preceduto da un rapido incremento della concentrazione di calcio

31

intracellulare97, 98 in accordo con la stimolazione della NO sintetasi costitutiva regolata dal Ca2+.

L’anandamide inibisce l’attivazione dell’enzima NO sintetasi inducibile (iNOS) da parte del lipopolisaccaride ed interferone , nell’endotelio della vena safena e negli astrociti di topo.101 Poiché sia anandamide che S-nitrosil-N-acetil-penicillamina portano a una diminuzione dell’accumolo di cAMP (indotto da lipopolisaccaride ed interferone ), si ritiene che la soppressione di iNOS coinvolga l’inibizione della produzione di cAMP da parte di NO.96

DISTRIBUZIONE TISSUTALE DEI RECETTORI CANNABINOIDI

Distribuzione neuronale

Il recettore CB1 è quello primariamente espresso a livello del sistema nervoso centrale. La sua distribuzione è stata determinata attraverso studi di autoradiografia, di ibridazione in situ e di immunocitochimica.

Gli studi autoradiografici dei recettore CB1 sono stati di notevole importanza; essi hanno preceduto la clonazione di tale recettore ed hanno indicato che esso risulta espresso in quelle regioni ipotizzate in base agli effetti comportamentali dei cannabinoidi. I recettori CB1 sono largamente espressi nella corteccia cerebrale, nell’ippocampo, nei gangli basali e nel cervelletto; livelli inferiori si riscontrano nell’ipotalamo e nel midollo spinale. Risultano praticamente assenti nei centri

32

respiratori del tronco encefalico e ciò spiega l’osservazione clinica della bassa letalità da overdose di cannabinoidi.102

Qualitativamente, la distribuzione recettoriale nelle varie specie studiate (incluse l’uomo, la scimmia ed il ratto) risulta molto simile, ovvero con differenze

minime:67, 103, 104 ad esempio, nell’uomo i recettori CB1 sono maggiormente espressi nell’amigdala e nella corteccia cingolata rispetto alla scimmia o al ratto:103

ciò può spiegare le differenze negli effetti comportamentali “inter-specie” dovuti ai

cannabinoidi.

Le tecniche autoradiografiche hanno permesso inoltre di fornire una misura quantitativa della densità di distribuzione dei recettori cannabinoidi: il loro livello di espressione risulta maggiore di 1 pmole/mg di tessuto, ovvero più alto di quelli della maggior parte dei recettori accoppiati a proteine G.105, 106

Dopo la clonazione del recettore CB1 sono stati condotti studi di ibridazione107,

108

i cui risultati sono generalmente in accordo con quelli degli studi precedenti. Un dato importante degli studi di ibridazione è la conferma dell’ipotesi, emersa da

studi autoradiografici, che i CB1 si trovino spesso sugli assoni e sulle loro terminazioni. Un’altra importante evidenza e che i neuroni esprimenti i recettori CB1 presentano generalmente due “pattern” di distribuzione.107, 108 In alcune regioni i recettori sono espressi ampiamente e in modo omogeneo: nel cervelletto, per esempio, quasi tutte le cellule granulari esprimono recettori CB1; per contro, nell’ippocampo la maggior parte dei neuroni non esprime apprezzabili di livelli di

CB1-mRNA, ma alcuni ne esprimono livelli molto alti. Un “pattern” molto simile è riscontrabile nella corteccia cerebrale.

33

Diversi studi immunocitochimici sono stati condotti attraverso l’uso di anticorpi anti-CB1: questi studi hanno evidenziato alti livelli di recettori CB1 nelle fibre assoniche e nelle loro terminazioni.

Dettagliati studi al microscopio elettronico condotti sull’ippocampo di ratto ed umano hanno rivelato che i recettori CB1 si trovano principalmente sulle terminazioni presinaptiche.109, 110

La localizzazione dei recettori ha fornito inoltre indicazioni riguardo alla loro funzione: per esempio i recettori CB1 sono spesso espressi sulle terminazioni nervose che rilasciano acido -amminobutirrico (GABA) e colecistochinina (CCK);111-113 quindi l’inibizione della neurotrasmissione dovuta all’attivazione del recettore CB1 causa una diminuzione del rilascio sia di GABA che di CCK.

Un’altra caratteristica interessante è la reciproca localizzazione dei recettori CB1 e dell’enzima FAAH. In alcune regioni del cervello i CB1 e FAAH sembrano

trovarsi su neuroni opposti.114, 115 Per esempio, i neuroni piramidali dell’ippocampo e quelli del Purkinje esprimono alti livelli di FAAH e bassi livelli di CB1; al contrario, l’espressione di FAAH è bassa negli interneuroni dell’ippocampo e nelle cellule

granulari del cervelletto, che formano sinapsi rispettivamente con i neuroni piramidali e con quelli del Purkinje.

Oltre che nel sistema nervoso centrale, i recettori CB1 sono ampiamente espressi anche nel sistema nervoso periferico, sia sulle fibre nervose sensoriali che nel sistema nervoso autonomo.116 Sono stati evidenziati moderati livelli di espressione dei recettori CB1 anche nel testicolo117, 118 ed in altri distretti. Inoltre, i CB1 sono presenti in alcune cellule immunitarie, ma il loro livello è considerevolmente inferiore rispetto a quello dei CB2.

34

I recettori CB1 sono ampiamente espressi nelle regioni del cervello associate alle più alte funzioni cognitive. Livelli significativi di CB1 si ritrovano anche nella vie associate al dolore.

Come descritto più avanti, una conseguenza dell’attivazione dei recettori CB1 a livello delle terminazioni nervose, è la diminuzione dell’entrata di calcio attraverso i

canali del calcio voltaggio-dipendenti, che porta quindi ad una diminuzione del rilascio di neurotrasmettitori.

Immunodistribuzione

L’mRNA del recettore CB1 si trova principalmente nei tessuti neuronali, ma può

essere presente, in minori livelli, anche in tessuti periferici tra cui ghiandola surrenale, midollo osseo, cuore, polmone, prostata, testicolo, timo, tonsille e milza.119-122 L’mRNA-CB1 si trova a bassi livelli nelle cellule della microglia del cervello di ratto neonato123, 124 e in determinate linee cellulari immunitarie, tra cui monociti umani THP-1, cellule B umane Raji, cellule tipo-natural killer NKB61A2 del topo e cellule T CTLL2 interleuchina-2-dipendenti del topo.125

Studi di ibridazione e autoradiografici evidenziano l’espressione dei recettori CB2 in molteplici organi linfoidi:126, 127 l’mRNA del recettore CB2 si trova nella milza, nel timo, nelle tonsille, nel midollo osseo, nei mastociti, nei leucociti periferici e in una varietà di modelli di colture cellulari immunitarie.120, 121, 128-132 Nella milza e nelle tonsille il contenuto di mRNA dei CB2 è equivalente a quello dell’mRNA dei CB1 nel sistema nervoso centrale.133

35

La distribuzione di mRNA dei CB2 nelle cellule immunitarie del sangue umano presenta questo ordine: linfociti B > cellule natural killer >> monociti > neutrofili polimorfonucleati > linfociti T8 > linfociti T4.121

Particolari esperimenti al microscopio confocale effettuati su tessuti tonsillari umani hanno dimostrato una marcata espressione dei recettori CB2 nelle zone mantellari dei follicoli secondari, mentre i centri germinali sono risultati piuttosto poveri di recettori; ciò suggerisce una modulazione di questo tipo di recettori durante la differenziazione da linfociti B vergini a cellule B della memoria.

Sono stati riportati diversi studi riguardanti il cambiamento dei livelli dei recettori cannabinoidi o del loro mRNA dopo il trattamento con vari modulatori o attivatori immunitari. In altre parole, i livelli dei recettori CB1 e CB2 sono stati studiati nelle cellule immunitarie, sia durante l’attività basale che in seguito all’attivazione delle

cellule stesse. 122, 124, 135 Nel loro insieme, questi studi suggeriscono che i recettori cannabinoidi hanno un’importanza biologica rilevante nelle cellule linfoidi e mieloidi durante determinati stadi dell’attivazione cellulare.

ATTIVAZIONE DEI RECETTORI CANNABINOIDI: EFFETTI SULLA NEUROTRASMISSIONE

L’attivazione dei recettori CB1 presinaptici porta all’inibizione del rilascio di

svariati neurotrasmettitori, eccitatori o inibitori, sia nel cervello che nel sistema nervoso periferico. Questo dato è stato ottenuto mediante esperimenti in cui il rilascio di neurotrasmettitori è stato monitorato sia direttamente in vivo e in vitro (acetilcolina, noradrenalina, dopamina, serotonina, D-aspartato, colecistochinina),

36

che indirettamente attraverso l’uso di tecniche elettrofisiologiche (glutammato, glicina, GABA).

I composti 9

-THC e R-(+)-WIN55212, a concentrazioni abbastanza elevate (50 M), risultano inibire l’uptake del GABA nel tessuto ottenuto dal globo pallido136, 137

o dalla substantia nigra138 di ratto.

Sebbene il principale effetto degli agonisti dei recettori CB1 sul rilascio di neurotrasmettitori sia di natura inibitoria, questo effetto può risultare in un aumentato rilascio di neurotrasmettitori, in seguito all’iniziale effetto inibitorio. Per esempio, vi sono evidenze che i cannabinoidi aumentano il rilascio di dinorfina nel midollo spinale e che questo effetto dipende dall’inibizione CB1-mediata di neuroni tonicamente attivi che esercitano un’influenza inibitoria su neuroni che rilasciano la

dinorfina.139 Inoltre, da esperimenti su animali interi140-147 o su fette di cervello,148 risulta che gli agonisti dei recettori CB1 possono stimolare il rilascio di dopamina nel nucleus accumbens ed è probabile che questo effetto derivi dall’inibizione, mediata dal recettore stesso, del rilascio di glutammato dalle fibre glutammatergiche. Queste sono larghe fibre che formano sinapsi, nel nucleus accumbens, con neuroni GABAergici che proiettano nell’area ventrale tegumentale per esercitare un effetto inibitorio su neuroni dopaminergici del mesoaccumbens.149 Tramite esperimenti di microdialisi su ratti è stato osservato che la stimolazione, mediata dal recettore cannabinoide, del rilascio di dopamina nel nucleus accumbens porti a un aumento del rilascio di acetilcolina nella corteccia prefrontale, in risposta a iniezioni intravenose di basse dosi di 9

-THC, HU-210 o R-(+)-WIN55212.29, 150 Perciò i neuroni GABAergici proiettano dal nucleus accumbens alla corteccia prefrontale e si pensa che la dopamina rilasciata nel nucleus accumbens possa agire su questi neuroni per disinibire la

37

liberazione di acetilcolina nella corteccia.151 Esperimenti di microdialisi su ratti indicano che, a basse dosi, i cannabinoidi somministrati per via endovenosa possono agire attraverso i recettori CB1 per aumentare il rilascio di acetilcolina anche nell’ippocampo,29, 150 mentre i dati che derivano da esperimenti elettrofisiologici in vivo, suggeriscono che i cannabinoidi somministrati sistemicamente possono aumentare il rilascio di dopamina dai neuroni corticali mesoprefrontali che proiettano dall’area tegumentale ventrale alla corteccia

prefrontale.152 Questo effetto stimolante sul rilascio di dopamina può derivare dall’inibizione del rilascio di GABA mediato dai recettori CB1 presumibilmente

localizzati sulle terminazioni di interneuroni GABAergici della corteccia prefrontale, i quali modulano l’attività dei neuroni piramidali.153 Una particolare risultato, ottenuto da esperimenti di microdialisi su ratti non anestetizzati, è che il composto R-(+)-WIN55212 può agire attraverso recettori cannabinoidi nella corteccia cerebrale, per aumentare il rilascio di glutammato calcio- dipendente.154 Esiste in realtà una apparente discrepanza tra i dati ottenuti da questi esperimenti e quelli ottenuti da precedenti studi elettrofisiologici che indicano invece un effetto inibitorio dei cannabinoidi sul rilascio di glutammato. È possibile che quando gli agonisti dei recettori CB1 sono somministrati in vivo, abbiano un effetto bifasico dose-dipendente sul rilascio di acetilcolina a livello della corteccia e dell’ippocampo: un effetto stimolante a dosi basse ed un effetto inibitorio a dosi più

alte.

I risultati di studi più recenti indicano che gli endocannabinoidi possono agire attraverso recettori cannabinoidi presinaptici, funzionando come veloci messaggeri sinaptici retrogradi. In particolare, la biosintesi e il rilascio non vescicolare di endocannabinoidi possono essere rapidamente innescati dall’intensa attività a

38

livello delle sinapsi glutammatergiche nell’ippocampo e nel cervelletto. Nell’ippocampo, questo rilascio sembra provenire da cellule piramidali155, 38

che ricevono segnali sia da neuroni glutammaergici eccitatori che da neuroni GABAergici inibitori. Si pensa che le cellule piramidali producano e rilascino endocannabinoidi in risposta all’aumento dei livelli di calcio intracellulare

provocato dal rilascio sinaptico di glutammato e che gli endocannabinoidi così prodotti agiscano quindi attraverso i recettori CB1 sui neuroni GABAergici, per inibire l’entrata di calcio, diminuendo così il rilascio di GABA sulle cellule

piramidali. Nel cervelletto, il glutammato rilasciato sulle cellule del Purkinje sembra essere in grado di innescare la produzione e il rilascio di endocannabinoidi, sia incrementando in maniera temporanea i livelli di calcio in queste cellule, che agendo sui recettori postsinaptici metabotropici del glutammato, attivando le proteine G senza produrre alcun aumento dei livelli di calcio intracellulari.156, 157 Dopo che gli endocannabinoidi sono stati rilasciati dalle cellule del Purkinje, si pensa che vadano ad agire attraverso i recettori cannabinoidi che si trovano sulle terminazioni delle fibre ascendenti e parallele delle cellule granulari del cervelletto, per inibire il continuo rilascio di glutammato.157, 158 È noto che nel cervelletto, la soppressione dell’inibizione indotta dalla depolarizzazione, sia dovuta al rilascio

degli endocannabinoidi da parte delle cellule del Purkinje, sui recettori CB1 presinaptici che sono presenti sulle terminazioni GABAergiche delle cellule stellate e delle cellule dei canestri.158, 159

Esperimenti su colture primarie di neuroni corticali di ratto indicano che il glutammato e NMDA stimolano la formazione di 2-arachidonoilglicerolo e che la formazione di anandamide può essere stimolata mediante l’attivazione simultanea

39

ATTIVAZIONE DEI RECETTORI CANNABINOIDI: EFFETTI IMMUNOLOGICI

L’identificazione di recettori cannabinoidi periferici in vari tipi di cellule immunitarie e il fatto che i cannabinoidi inibiscono l’adenilato ciclasi nelle cellule

immunitarie attraverso un meccanismo sensibile alla tossina della pertosse,119, 161,

162

hanno suggerito un ruolo dei recettori cannabinoidi nella modulazione delle funzioni delle cellule immunitarie. È stato dimostrato che la soppressione della risposta immunitaria umorale dovuta ai cannabinoidi è solo parzialmente mediata dall’inibizione di adenilato ciclasi dovuta al meccanismo accoppiato alla proteina

G, sensibile alla tossina della pertosse.119 9

-THC e CP 55,940 inibiscono la proliferazione dei linfociti ed evidenze più dirette del legame funzionale tra i recettori cannabinoidi e la modulazione delle attività immunologiche sono state ottenute attraverso l’uso di agonisti inversi/antagonisti CB1-selettivi CB2-selettivi.

I cannabinoidi, agendo sui loro recettori, influenzano alcune attività funzionali dei macrofagi e delle cellule di tipo macrofagico. 9-THC modula la capacità dei macrofagi di processare antigeni che sono necessari per l’attivazione dei linfociti T

e CD4+.163, 164 Esso Inibisce inoltre il processamento del lisozima intatto in modo dose-dipendente e questa inibizione è bloccata da SR144528, indicando che l’effetto inibitorio è mediato, almeno in parte, dal recettore CB2. Questi dati sono

stati confermati da studi su topi CB2-knockout.165

Il trattamento con CP 55,940 diminuisce la migrazione in vitro di macrofagi di ratto e questo effetto coinvolge sia i recettori CB1 che i CB2; entrambi i composti SR141716A e SR144528 sono capaci di bloccare l’inibizione indotta da CP 55,940

40

sulla migrazione spontanea, ma l’antagonista/agonista inverso CB2-selettivo risulta più potente.166

È stato riportato che il recettore CB1 sia in grado di mediare l’inibizione della

produzione di iNOS (NO sintetasi inducibile) da parte di cellule microgliali di ratto neonato.123 CP 55,940, potente agonista, inibisce in modo dose-dipendente iNOS e tale effetto è “revertato” da SR141716A. D’altro canto, alcuni autori hanno dimostrato che il 2-arachidonoilglicerolo stimola il rilascio costitutivo di NO da parte di monociti umani, di tessuti vascolari e di immunociti dell’invertebrato

Mytilus edulis; questo effetto è mediato dal recettore CB1 nelle cellule umane e da

un “apparente” recettore cannabinoide negli immunociti di invertebrato. Inoltre, sia

nei monociti che negli immunociti, il rilascio di NO dovuto al 2-arachidonilglicerolo è bloccato da antagonisti/agonisti inversi CB1 ma non da antagonisti/agonisti inversi CB2.166

È stato suggerito un coinvolgimento del recettore CB1 nell’infezione dei macrofagi dovuta all’agente patogeno intracellulare Brucella suis e al riguardo è stata appunto studiata l’influenza di SR141716A e SR144528, degli agonisti CB1/CB2

CP 55,940 e R-(+)-WIN55212: la moltiplicazione intracellulare di Brucella suis risulta essere inibita in modo dose-dipendente nelle cellule trattate con SR141716A ma non con SR144528, CP 55,940 o R-(+)-WIN55212. Gli agonisti CP 55,940 e R-(+)-WIN55212 “revertano” l’effetto indotto da SR141716A e ciò suggerisce il coinvolgimento del recettore CB1 in questo processo.167

Entrambi i recettori CB1 e CB2 risultano coinvolti in una complessa rete che media l’attività citolitica delle cellule natural killer. In particolare, è stata riscontrata un’inibizione dell’attività di queste ultime: la somministrazione in vivo di 9

-THC a topi inibisce in maniera significativa l’attività citolitica senza influire sulla

41

proliferazione degli splenociti indotta da concanavalina A. Il pretrattamento con SR141716A e SR144528 “reverta” parzialmente tale effetto, ma l’antagonista/agonista inverso CB1-selettivo risulta più efficace di quello

CB2-selettivo.168

È stato inoltre studiato l’effetto del 2-arachidonoilglicerolo sulla concentrazione di calcio intracellulare nelle cellule HL-60 di leucemia promielocitica umana che esprimono i recettori CB2: questo composto porta a un aumento rapido e transitorio della concentrazione di calcio libero intracellulare e l’effetto risulta bloccato dal pretrattamento delle cellule con SR144528, ma non con SR141716A, indicando il coinvolgimento del recettore CB2 e non del CB1 in questo processo.169

L’espressione di CB2 è “down-regolata” durante la differenziazione delle cellule B:

la più bassa espressione si osserva nei centri germinali dei centroblasti tonsillari. L’agonista CP 55,940 aumenta la proliferazione CD40-mediata delle cellule B:

questo aumento è bloccato da SR144528, ma non da SR141716. Tutto ciò mostra un diretto coinvolgimento funzionale dei recettori CB2 durante la differenziazione delle cellule B.170

Una possibile spiegazione della capacità dei cannabinoidi di esercitare, attraverso i propri recettori, un così ampio spettro di effetti funzionali immunologici è che questi composti inducono espressioni differenziali dei profili citochinici. 9-THC e altri agonisti cannabinoidi aumentano l’espressione di citochine immuno-inibitorie

di tipo Th2, mentre inibiscono le citochine immuno-stimolatorie di tipo Th1. In particolare, 9-THC sembra inibire l’immunità antitumorale dovuta ad un meccanismo citochina-dipendente e mediato dal recettore CB2. Ciò è stato rilevato in due modelli murini di cancro polmonare.171

42

I

NTRODUZIONE ALLA

43

BACKGROUND

Come già spiegato nell’Introduzione Generale, sono stati attualmente identificati

due principali sottotipi recettoriali per i cannabinoidi: il recettore CB1 ed il recettore CB2. Il CB1 si trova essenzialmente nei neuroni centrali e periferici, dove media l’inibizione del rilascio di svariati neurostrasmettitori.172, 173

Tuttavia, esso è stato riscontrato anche in tessuti periferici non neuronali.174 Il CB2 è espresso principalmente a livello del sistema immunitario, dove modula il rilascio di citochine da parte delle cellule immunologiche e la migrazione di queste ultime.175 L’espressione del CB2 è stata anche riscontrata in altri distretti quali: alcuni

neuroni centrali e periferici, cellule endoteliali vascolari, muscolatura liscia vascolare, cardiomiociti, osteoblasti ed osteoclasti.176

Composti in grado di attivare i recettori cannabinoidi presentano un vasto range di applicazioni terapeutiche.175, 177 Ci sono tre specialità medicinali attualmente in commercio (di cui soltanto una autorizzata molto recentemente in Italia, come descritto più avanti) a base di agonisti cannabinoidi non selettivi (CB1/CB2): Cesamet® e Marinol® sono usati in clinica per ridurre la nausea ed il vomito indotti dalla chemioterapia; il Marinol® è impiegato anche per stimolare l’appetito ad es. in pazienti affetti da AIDS; il Sativex® è in uso per il sollievo da dolore neuropatico/tumorale e per il controllo della spasticità muscolare in pazienti affetti da sclerosi multipla.174, 175, 178 In particolare, il Sativex® è l’unico farmaco a base di cannabinoidi che l’AIFA (Agenzia Italiana del Farmaco) ha autorizzato in Italia, tra l’altro molto recentemente (Gazzetta Ufficiale n. 100 del 30 aprile 2013,

Supplemento Ordinario n. 33). Esso è indicato unicamente per il trattamento della spasticità da moderata a grave in pazienti con sclerosi multipla che non abbiano

44

risposto adeguatamente al trattamento con altri farmaci anti-spastici. Il Sativex® è a base di due principi attivi di origine naturale, ovvero il 9-THC e il CBD (cannabidiolo) ed è formulato come spray oro-mucosale, quindi facilmente assumibile anche da persone con problemi di deglutizione.

Altre applicazioni terapeutiche degli agonisti CB1/CB2 includono: epilessia, ansia, depressione, morbo di Parkinson, corea di Huntington, sclerosi laterale amiotrofica, cancro, glaucoma, disordini epatici e intestinali.177, 178

È ben noto che uno dei maggiori limiti dell’uso terapeutico degli agonisti cannabinoidi non selettivi è l’insorgenza degli effetti psicotropici, i quali sembrano essere mediati pressoché esclusivamente dall’attivazione dei recettori CB1

centrali;179 per questo motivo, il “targeting” selettivo del recettore CB2 è una delle strategie attualmente proposte allo scopo di evitare tali effetti indesiderati e quindi incrementare il rapporto beneficio/rischio degli agenti da usarsi in terapia.175, 180 Inoltre, vi sono recenti evidenze che indicano il ruolo importante del recettore CB2 in patologie che coinvolgono una componente infiammatoria (malattie neurodegenerative,181, 182 malattie infiammatorie dell’intestino,183 aterosclerosi184), nell’osteoporosi185, 186

e nel cancro.187, 188 Infine, studi recenti indicano il coinvolgimento del recettore CB2 nell’alleviare il dolore.189, 190

È importante sottolineare che in alcuni studi sono riportate proprietà analgesiche ed antiinfiammatorie di agonisti CB2 selettivi;191, 192 in altri, le stesse proprietà sono descritte per gli agonisti inversi CB2 selettivi.193, 194 Un andamento simile si può riscontrare nell’ambito del rimodellamento osseo e dell’osteoporosi.185, 197

Tutte queste considerazioni indicano che il recettore CB2 è sicuramente un target terapeutico di importanza crescente e che la sua farmacologia merita studi

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ancora più approfonditi, allo scopo di comprendere a fondo il suo ruolo in situazioni fisiopatologiche.

C’è anche un notevole interesse nello sviluppo di antagonisti neutrali

CB2-selettivi, ovvero ligandi affini a questo recettore, privi di alcuna attività agonista o agonista inversa. Attualmente, (vedi anche l’Introduzione Generale) solo

pochissimi composti dotati di queste caratteristiche sono stati descritti.198, 199 In un sistema biologico che esprime i recettori CB2, gli antagonisti neutrali CB2-selettivi potrebbero essere sicuramente molto utili come “tools” farmacologici per distinguere tra l’attività tonica del recettore CB2 derivante dal rilascio di endocannabinoidi (alla quale possono opporsi) e l’attività tonica “costitutiva”, cioè

indipendente dalla presenza o meno del ligando (alla quale non possono opporsi).18

In questo contesto, il gruppo di ricerca presso il quale ho svolto la mia tesi di laurea aveva sviluppato una serie di derivati 1,2-diidro-2-oxo-piridin-3-carbossammidici (struttura generale A, Figura 8) caratterizzati da elevati livelli di affinità e selettività per il recettore CB2.200

A N NH O R₁ O R₂ R₃

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I risultati dei saggi di attività funzionale avevano rivelato aspetti molto interessanti: il profilo farmacologico di tali composti è risultato infatti fortemente influenzato dalla natura del sostituente in posizione 5 del nucleo centrale 2-oxo-piridinico. In particolare, tra i tre composti più affini, il derivato non sostituito in questa posizione è risultato essere un agonista CB1/CB2; il derivato 5-fenil-sostituito ha mostrato le caratteristiche di un agonista inverso CB2-selettivo; infine, l’introduzione nella stessa posizione, di un p-metossifenile, ha “shiftato” l’attività verso l’antagonismo neutrale/debole agonismo inverso CB2-selettivo (Figura 9).200

N NH O O H F N NH O O F N NH O O F MeO 5 5 5

CB1/CB2 agonista CB2-agonista inverso CB2-antagonista neutrale/

agonista inverso parziale

Figura 9. Profili farmacologici di alcuni derivati 1,2-diidro-2-oxo-piridin-3-carbossammidici: influenza del sostituente in posizione 5.

Successivamente, era stata sviluppata una serie di derivati carbossammidici a struttura bifenilica, quali analoghi strutturali dei composti 1,2-diidro-2-oxo-piridinici 5-sostituiti, in cui l’azoto del nucleo centrale era stato rimpiazzato da un atomo di

47 N NH O R₁ O R₂ R₃ NHR2 O R₁ OMe R₃ B

Figura 10. Derivati bifenil-carbossammidici (B) strutturalmente analoghi dei derivati 1,2-diidro-2-oxo-piridin-3-carbossammidici 5-aril-sostituiti.

In tali derivati, per quanto riguarda la posizione 1, ovvero quella in cui è presente il gruppo ammidico, erano stati inseriti sostituenti (R2), quali cicloeptile e

4-metilcicloesile (trans o cis), risultati i migliori sulla base dei dati di binding dei composti precedentemente sviluppati. In posizione 2 era stato inserito un gruppo metossilico, in sostituzione del carbonile in pos. 2 dei derivati 2-oxo-piridinici, peraltro non significativamente importante per l'affinità recettoriale. In posizione 3 (R1) erano stati introdotti sostituenti alchilici, in particolare metile e n-butile, per

verificare l'influenza sull'affinità recettoriale dovuta ad un maggiore o minore ingombro sterico in questa zona. In effetti, sostituenti di tipo alchilico (pentile, n-butile) in questa posizione, sono stati riportati recentemente in letteratura, in derivati strutturalmente simili a quelli da noi progettati; in particolare, derivati 4-oxo-1,4-diidro-chinolin-3-carbossammidici202 e derivati 4-oxo-1,4-diidropiridin-3-carbossammidici.203 Infine, per quanto riguarda il sostituente R3, erano stati inseriti

gruppi quali H, OMe, F, in analogia con i derivati precedentemente sviluppati. In questa serie di derivati bifenilici, l’introduzione di un gruppo n-butilico in pos.

3 ha condotto a risultati particolarmente interessanti. Infatti i tre derivati butilici 1-3 (Figura 11) hanno mostrato, per quanto riguarda il binding, livelli di affinità e selettività per il recettore CB2 piuttosto buoni; in particolare il derivato 1 presenta

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una Ki su CB2 di 11 nM a fronte di una Ki su CB1 di 1494 nM, con un “Selectivity

Index” (S. I.) pari a 130.201

OMe NH O MeO 1 OMe NH O MeO 2 OMe NH O MeO 3

Figura 11. Derivati bifenil-carbossammidici 3-n-butil-sostituiti.

Come mostrato nella Figura 12, nei saggi di attività funzionale, il composto 1 si è rivelato “silente” sul recettore CB2 se somministrato da solo; inoltre esso è risultato in grado di “revertare” in modo dose-dipendente, la risposta indotta da un

agonista (HU-210, 1 nM), così come quella indotta da un agonista inverso CB2-selettivo (SR144528, 3 nM). Sulla base di questi dati il derivato 1 è risultato quindi essere un antagonista neutrale CB2-selettivo.201

1 1

1

Figura 12. Il composto 1 è un CB2-antagonista neutrale che inibisce in modo dose-dipendente la risposta dell’agonista (HU-210, 1nM) e dell’agonista inverso (SR144528, 3 nM).

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Dato che composti aventi queste caratteristiche sono piuttosto rari, il composto

1 può essere considerato come il primo membro di una nuova classe di derivati

bifenilici, utili quali “tools” farmacologici per lo studio approfondito delle

caratteristiche e del ruolo del recettore CB2.

NUOVI DERIVATI CARBOSSAMMIDICI A STRUTTURA BIFENILICA

Sulla base dei promettenti risultati conseguiti con la prima serie di derivati bifenilici, è stato ritenuto interessante sviluppare ulteriormente questo tipo di strutture, variando la natura dei sostituenti nelle posizioni 1 (sostituente sul gruppo ammidico), 3 e 5 del nucleo fenilico centrale. Tutto ciò allo scopo di migliorare ancora i livelli di affinità e di selettività per il recettore CB2 ed eventualmente di chiarire meglio il profilo farmacologico di questo tipo di molecole.

Le modifiche strutturali previste per i derivati bifenilici sono mostrate nelle Figura 13. In posizione 1, come sostituenti sull’ammide, sono stati previsti

cicloeptile, trans-4-metilcicloesile e cis-4-metilcicloesile, analogamente a quanto fatto per la prima serie bifenilica. In posizione 3 sono stati previsti i sostituenti che avevano condotto ai migliori risultati nei derivati 1,2-diidro-2-oxo-piridi3-carbossammidici, ovvero benzile, p-fluorobenzile e morfolinoetile; in aggiunta, il n-pentile è stato previsto per questa posizione. In posizione 5 sono stati previsti il fenile, il p-fluorofenile, il p-metossifenile, analogamente alla prima serie; ed inoltre altri due sostituenti quali il furile ed il tienile. La progettazione di questa espansione numerica della serie ha previsto di coprire tutte le possibili