Come precedentemente descritto, i composti chimici presenti nel tabacco e nelle bevande alcoliche subiscono un’attivazione metabolica attraverso l’azione degli enzimi di fase I, principalmente dei citocromi P450; questi enzimi catalizzano reazioni che portano alla formazione di gruppi funzionali all’interno dei loro substrati, generando in questo modo cancerogeni attivi. Questi possono legarsi al DNA e formare degli addotti, causando un danno al materiale genetico.
I citocromi P450 appartengono ad una superfamiglia composta da oltre cento enzimi diversi; per gran parte di essi sono state individuate differenze
inter-individuali nella loro attività enzimatica che potrebbero determinare variazioni nella capacità di metabolizzare i cancerogeni, rappresentando quindi dei fattori di suscettibilità al tumore (Gonzàlez et al., 1998). Per quanto riguarda il cancro delle vie aero-digestive superiori, gli enzimi appartenenti a questa famiglia maggiormente studiati sono il CYP1A1, il CYP2E1, il CYP2D6 e il CYP1B1.
Il CYP1A1 è coinvolto nell’attivazione del benzo[a]pirene e di altri idrocarburi aromatici presenti nel fumo di sigaretta (Gonzalez e Gelboin, 1994). Sono stati identificati due polimorfismi per questo gene che risultano in un incremento della sua attività (Crofts et al., 1994): una sostituzione isoleucina → valina nell’esone 7 e una mutazione puntiforme T → C nella regione 3’-UTR (Msp1). Gli studi di associazione precedentemente realizzati non hanno mostrato nessuna significativa relazione tra il polimorfismo Msp1 e rischio per il cancro delle vie aero-digestive superiori (Gronau et al., 2003; Kao et al., 2002; Oude Ophuis et al., 1998; Jahnke et al., 1996). Per quanto concerne il polimorfismo nell’esone 7 i dati sono contrastanti: mentre gran parte degli studi non sono stati in grado di rilevare alcuna associazione (Evans et al., 2004; Gronau et al., 2003; Olshan et al., 2000; Oude Ophuis et al., 1998; Jahnke et al., 1996), Kao et al. (2002) e Morita et al. (1999) hanno invece dimostrato un aumento del rischio per il genotipo Val/Val, particolarmente per il cancro del cavo orale e della faringe.
Il CYP2E1 catalizza l’attivazione metabolica di diversi composti presenti nel fumo di sigaretta, come l’N-nitroso-dimetilamina, il benzene e la NNN (Yamazaki et al., 1992); è responsabile inoltre dell’ossidazione dell’etanolo ad acetaldeide (Hayashi et al., 1991). Più di 25 polimorfismi sono stati identificati per questo gene (Li et al., 2005), alcuni dei quali sono stati studiati quali fattori di suscettibilità per il cancro delle vie aero-digestive superiori. In particolare, per i polimorfismi -1293G>C (Morita et al., 1999; Gonzalez et al., 1998), G1532C (Li et al., 2005) -1053C>T e 7632T>A (Neuhaus et al., 2004) non è stata riscontrata nessuna evidente associazione; il polimorfismo di recente identificazione -71G>T, correlato ad un aumento dell’espressione del gene, è
risultato invece associato ad un aumento del rischio tra i soggetti fumatori (Neuhaus et al., 2004).
Il CYP2D6 è coinvolto nella detossificazione della nitrosamina tabacco- specifica 4-(metilnitrosamino)-1-butanone (Rannug et al., 1995). Sono stati identificati tre rilevanti polimorfismi, che hanno come effetto l’inattivazione del gene: una sostituzione G → A nella giunzione tra l’introne 3 e l’esone 4, una delezione nell’esone 5 e una delezione totale del gene. Nessuno dei tre ha però mostrato una significativa correlazione con l’insorgenza del cancro delle vie aero-digestive superiori (Gronau et al., 2003; Gonzalez et al., 1998).
Anche il CYP1B1 è implicato nell’attivazione dei cancerogeni del tabacco, come gli idrocarburi aromatici policiclici e le amine aromatiche (Shimada et al., 1999). Tra i suoi polimorfismi, una sostituzione valina → leucina al codone 432 altera l’efficienza catalitica nella reazione di idrossilazione (Hanna et al., 2000); tuttavia non è stata riscontrata una significativa relazione tra questo polimorfismo e la suscettibilità a questo tipo di cancro (Li et al., 2005).
Tra gli enzimi di fase II coinvolti nella detossificazione dei composti cancerogeni contenuti nel tabacco un ruolo importante è sostenuto dalle glutatione-S-transferasi (GST); gli enzimi appartenenti a questa famiglia catalizzano la reazione di attacco del glutatione ad una vasta gamma di composti, tra i quali i radicali aromatici eterociclici e gli epossidi (Geisler e Olshan, 2001). La coniugazione facilita l’escrezione di questi substrati, quindi costituisce una tappa nel processo di detossificazione. Le GST sono formate da due subunità aggregate in omodimeri o eterodimeri e sono classificate in 5 classi: α, µ, π, σ e θ. Principalmente questi enzimi vengono espressi nel fegato, ma molti di essi sono stati ritrovati anche in tessuti extraepatici, come nel muscolo, nel cervello, nel cuore, nel sangue e nelle vie aero-digestive superiori (Hayes e Pulford, 1995). Tra gli enzimi appartenenti a questa famiglia i più studiati quali fattori di suscettibilità per il cancro delle vie aero-digestive superiori sono: GSTM1, GSTT1, GSTP1 e GSTM3.
GSTM1 è coinvolto nella detossificazione di agenti cancerogeni del
tabacco, come gli epossidi e i metaboliti idrossilati del benzo[a]pirene (Hayes e Pulford, 1995); il locus GSTM1 è polimorfico ed è caratterizzato dalla presenza
di almeno tre alleli, uno dei quali deriva da un’ampia delezione del gene e causa la perdita dell’attività enzimatica. Tale variante allelica è chiamata “GSTM1 nullo” (Seidegard et al., 1988). Alcuni studi di associazione, effettuati per valutare l’influenza di questo gene sulla suscettibilità al cancro delle vie aero-digestive superiori, hanno evidenziato un aumento del rischio di contrarre la malattia tra gli individui portatori dell’allele nullo (Gronau et al., 2003; Buch et al., 2002; Park et al., 2000; Cheng et al., 1999; Jourenkova et al., 1998). Tuttavia, numerosi studi non hanno rilevato tale associazione (Gajecka et al., 2005; Evans et al., 2004; To-Figueras et al., 2002; Hahn et al., 2002; Olshan et al., 2000; Katoh et al., 1999; Jourenkova-Mironova et al., 1999a; Morita et al., 1999; Matthias et al., 1998; Oude Ophuis et al., 1998; Gonzalez et al., 1998).
L’influenza del locus GSTT1, anch’esso dotato di un allele nullo, è una questione ancora più controversa: mentre numerosi studi non hanno rilevato alcuna correlazione (Gajecka et al., 2005; Gronau et al., 2003; To-Figueras et al., 2002; Buche t al., 2002; Olshan et al., 2000; Katoh et al., 1999; Matthias et al., 1998; Jourenkova et al., 1998; Oude Ophuis et al., 1998), alcuni hanno dimostrato un aumento del rischio per i soggetti portatori dell’allele nullo (Drummond et al., 2005; Sikdar et al., 2004; Jourenkova-Mironova et al., 1999a; Jahnke et al., 1996); Evans et al. (2004) hanno invece riscontrato un’associazione positiva tra la presenza dell’allele wild-type di GSTT1 e lo sviluppo del cancro delle vie aero-digestive superiori.
GSTP1 è responsabile della detossificazione dei metaboliti attivi degli
idrocarburi aromatici policiclici (Ali-Osman et al., 1997). Nel gene GSTP1 sono state identificate due varianti alleliche, GSTP1*B e GSTP1*C, oltre all’allele wild-type GSTP1*A. Entrambe le varianti sono caratterizzate dalla sostituzione A → G al nucleotide 313, che comporta il cambiamento di una isoleucina con una valina al codone 105. L’attività e l’affinità dell’enzima per i suoi substrati elettrofili risulta alterata dalla presenza della valina (Ali-Osman et al., 1997). Anche il ruolo di GSTP1 nello sviluppo della malattia risulta poco chiaro: gli studi condotti su questo polimorfismo hanno mostrato sia associazioni positive (Jourenkova-Mironova et al., 1999a) sia negative (Sikdar et al., 2004) con un aumento del rischio; bisogna inoltre precisare che diversi studi non hanno
mostrato evidenti associazioni (Evans et al., 2004; To-Figueras et al., 2002; Olshan et al., 2000; Jourenkova-Mironova et al., 1999b).
Un altro membro della classe µ è GSTM3; per questo gene sono stati identificati due alleli: GSTM3*A e GSTM3*B. Quest’ultimo contiene una delezione di 3 pb nell’introne 6 che genera un motivo di riconoscimento per il fattore di trascrizione YY1. E’ stato ipotizzato che la presenza dell’allele GSTM3*B comporti un aumento della trascrizione del gene, forse promuovendo l’azione detossificante dell’enzima (Yengi et al., 1996). Mentre alcuni studi hanno in effetti supportato quest’ipotesi, dimostrando una diminuzione del rischio per gli individui portatori dell’allele GSTM3*B (Sidkar et al., 2004; Park et al., 2000; Matthias et al., 1998; Jahnke et al., 1996), Jourenkova-Mironova et al. (1999b) hanno trovato invece un aumento del rischio per il cancro della laringe, nei soggetti portatori dello stesso allele.
Altri importanti enzimi di fase II coinvolti nella detossificazione dei cancerogeni del tabacco sono le N-acetiltransferasi (NAT), l’epossido idrolasi microsomale (mEH), la NAD(P)H chinone ossidoreduttasi (NQO) e le S- transferasi (SULT). Le N-acetiltransferasi metabolizzano varie amine aromatiche e eterocicliche presenti nel tabacco; le amine aromatiche e le idrazine (attraverso una N-acetilazione) e le amine eterocicliche (attraverso una O-acetilazione) sono esempi dei loro substrati che, in generale, vengono deattivati (via N-acetilazione) o attivati (via O-acetilazione) per azione di questi enzimi (Hein, 1988). Esistono due N-acetiltransferasi, distinte sia per la specificità nei confronti di vari substrati sia da un punto di vista genetico, definite NAT1 e NAT2. L’attività di NAT2 risulta elevata nel fegato e nel tratto gastrointestinale, mentre NAT1 è espressa in molti tessuti extra epatici, ma il contributo relativo dell’attivazione o deattivazione dei cancerogeni a livello epatico ed extra epatico non è ancora del tutto chiaro (Hein et al., 2000). Per NAT1 sono stati identificati almeno 26 aplotipi, con NAT*4 che è riconosciuto come l’aplotipo wild-type (Vatsis et al., 1995). Per NAT2 sono state identificate sette sostituzioni nonsenso (G191A, T341C, A434C, G590A, A803G, A845C e G857A) e quattro silenti (T111C, C282T, C481T e C759T); NAT2*4 è considerato l’aplotipo wild-type (Hein et al., 2000). Poiché sia NAT1 sia NAT2
catalizzano l’attivazione metabolica (attraverso una O-acetilazione) delle amine aromatiche e eterocicliche cancerogene, i polimorfismi genetici dei geni che codificano per questi enzimi potrebbero modificare il rischio di sviluppare la neoplasia.
Tra i polimorfismi di NAT1, due in particolare sono risultati associati ad un significativo aumento del rischio per il cancro delle vie aero-digestive superiori: l’allele NAT1*10, che presenta le due sostituzioni T1088A e C1095A (Katoh et al., 1998; Varzim et al., 2002), e l’allele NAT1*11 (Varzim et al., 2002), che presenta le sostituzioni C-344T, A-40T, G445A, G459A, T640G, ∆9 tra 1065- 1090 e C1095A.
Per quanto riguarda NAT2 è stato dimostrato che la presenza di omozigosi per l’allele wild-type NAT2*4 (acetilatori rapidi) conferisce un aumento del rischio per il cancro della cavità orale (Marques et al., 2006) e della laringe (Henning et al., 1999); un aumento del rischio per il cancro delle vie aero- digestive superiori è stato riscontrato anche per l’allele NAT2*5, caratterizzato dalla presenza della sostituzione C481T (Varzim et al., 2002; Gonzalez et al., 1998), per l’allele NAT2*6B, caratterizzato dalla sostituzione G590A, e per l’allele NAT2*7A, che presenta la sostituzione G857A (Morita et al., 1999). Questi ultimi 3 alleli conferiscono un fenotipo di lento acetilatore. Sono stati inoltre identificati due alleli che sembrano svolgere invece un ruolo protettivo: l’allele NAT2*6A, che presenta le due sostituzioni C282T e G590A (Gajecka et al., 2005) e l’allele NAT2*11 (Marques et al., 2006), che sembrano diminuire il rischio rispettivamente per il cancro della laringe e della cavità orale.
L’epossido idrolasi microsomale, codificata dal gene EPHX1, catalizza l’idrolisi degli epossidi, che costituiscono degli intermedi reattivi dei cancerogeni del tabacco (Hengstler et al., 1998). Questa reazione generalmente costituisce una via di detossificazione, poiché i metaboliti prodotti sono meno reattivi e più facilmente eliminabili. mEH inoltre interviene nell’attivazione metabolica degli idrocarburi aromatici policiclici, catalizzando la formazione di composti reattivi (Sims et al., 1974). Due varianti alleliche di EPHX1 sono state associate con un’alterazione dell’attività di mEH nei caucasici: la sostituzione tirosina → istidina nell’esone 3 (residuo 113)
diminuisce la sua attività, mentre la sostituzione istidina → arginina nell’esone 4 (residuo 139) la aumenta. Quando entrambe le sostituzioni sono presenti l’attività dell’enzima risulta pressoché normale (Hassett et al., 1994). mEH è espresso nelle vie aero-digestive superiori (Janot et al., 1993), quindi l’attività dell’enzima potrebbe influenzare la formazione e l’eliminazione dei cancerogeni del tabacco a livello di questo sito anatomico. E’ stata riscontrata una diminuzione del rischio di contrarre la malattia tra gli individui portatori della sostituzione Y113H, ed un aumento del rischio nei soggetti con genotipo associato ad un’elevata attività di mEH (Jourenkova-Mironova et al., 2000).
La NAD(P)H chinone ossidoreduttasi 1 (NQO1) è una flavoproteina dimerica che catalizza la riduzione dei chinoni (Ross et al., 1994). La riduzione dei chinoni previene la generazione dei radicali liberi e delle forme reattive dell’ossigeno, proteggendo in questo modo la cellula dal danno ossidativo. Tuttavia, la NQO1 svolge anche un ruolo nell’attivazione di alcuni farmaci chemioterapici e di alcuni cancerogeni ambientali, come le amine aromatiche e le amine eterocicliche contenute nel fumo di sigaretta (Larson et al., 1999). Tra i 24 polimorfismi identificati per il gene NQO1, la sostituzione C → T al nucleotide 609 causa lo scambio di una prolina con una serina al codone 187, con la conseguente perdita di attività dell’enzima (Traver et al., 1997). Mentre l’attività della NQO1 risulta normale negli individui portatori di entrambi gli alleli wild-type, essa risulta ridotta in maniera variabile nei soggetti eterozigoti per questo polimorfismo (Ross et al., 1996); l’attività della proteina è invece assente nei soggetti omozigoti (Traver et al., 1997). Gli studi di associazione precedentemente effettuati per valutare l’impatto di questo polimorfismo sulla suscettibilità genetica verso il cancro delle vie aero-digestive superiori non hanno però evidenziato alcuna associazione significativa (Begleiter et al., 2005; Li et al., 2005).
Le S-transferasi (SULTs), una superfamiglia di enzimi multifunzionali, catalizzano la coniugazione di solfati, che rappresenta un’importante tappa nella via del metabolismo di fase II di molti composti sia endogeni che esogeni (Falany, 1997). La solfonazione è generalmente considerata come un meccanismo di detossificazione che genera metaboliti maggiormente solubili in
acqua; tuttavia, in alcuni casi può portare alla bioattivazione di agenti cancerogeni (Glatt, 2000). L’enzima SULT1A1 è uno dei più importanti membri di questa famiglia, per la sua abbondanza e distribuzione in una vasta varietà di tessuti. E’ dotato di un’elevata attività verso un’ampia gamma di substrati, inclusi i cancerogeni del tabacco, e ci sono evidenze dell’espressione di SULT1A1 a livello della mucosa orale (Dooley et al., 2000). Alcuni studi hanno dimostrato variazioni inter-individuali nell’attività di questo enzima, che è in larga parte attribuibile al poliformismo recentemente identificato (una sostituzione G → A) nella regione codificante del gene SULT1A1 (Glatt et al., 2001). Questa sostituzione porta al cambiamento aminoacidico Arg → His al codone 213, associato ad una bassa attività dell’enzima. Vista la sua larga distribuzione e il significato funzionale del suo polimorfismo, è stato ipotizzato che SULT1A1 possa svolgere un ruolo importante nella predisposizione al cancro; in effetti almeno uno studio ha dimostrato un aumento del rischio di cancro delle vie aero-digestive superiori nei soggetti omozigoti His/His, specialmente tra gli individui anziani e forti bevitori (Boccia et al., 2006).
Per quanto riguarda gli enzimi responsabili dell’ossidazione dell’alcol ad acetaldeide, dei tre geni codificanti le ADH due di questi, ADH2 e ADH3, sono polimorfici, con gli alleli ADH3*1 e ADH2*2 che rappresentano i “metabolizzatori rapidi” (Brennan e Boffetta, 2004). Dato che i metabolizzatori rapidi ricevono un più alto picco di esposizione all’acetaldeide rispetto a quelli lenti in conseguenza allo stesso consumo di alcol, è ipotizzabile che i portatori degli alleli ADH3*1 e ADH2*2 siano soggetti ad un aumentato rischio di contrarre il tumore. Tuttavia, questa ipotesi non è stata supportata da evidenze sperimentali; diversi studi hanno dimostrato un aumento del rischio per il genotipo ADH2*1/1, risultati che sono addirittura contrari all’ipotesi (Yokoyama et al., 2001).
Il gene ALDH2, codificante l’enzima responsabile dello smaltimento dell’acetaldeide prodotta, è caratterizzato dalla presenza di un allele inattivo, ALDH2*2; gli omozigoti per questo allele sono incapaci di metabolizzare l’acetaldeide (Yokoyama e Omori, 2003). L’allele ALDH2*2 è raro nei caucasici, benché sia piuttosto comune negli asiatici. Negli eterozigoti per questo
polimorfismo è stato riscontrato una forte associazione con il cancro della cavità orale e della laringe, rispetto agli omozigoti per l’allele wild-type (Yokoyama et al., 2001).
Tutti questi studi hanno dimostrato che i polimorfismi in geni che codificano per gli enzimi responsabili del metabolismo dei cancerogeni possono conferire un aumento significativo del rischio di sviluppare una neoplasia nelle vie aero- digestive superiori. Tuttavia, ci sono spesso risultati discordanti riguardo all’associazione tra i vari genotipi e il rischio di cancro. Diversi fattori di confondimento potrebbero contribuire a questi risultati contradditori. Probabilmente il maggiore di questi consiste nel fatto che molti degli studi epidemiologici molecolari hanno analizzato coorti di grandezza insufficiente per misurare adeguatamente il rischio attribuibile associato ad ogni dato genotipo. In molti studi inoltre il reclutamento dei casi e dei controlli non è stato effettuato in modo che i due gruppi fossero caratterizzati da una esposizione ai cancerogeni comparabile. Quando si prendono in esame polimorfismi riguardanti geni coinvolti nel metabolismo di cancerogeni come il tabacco e l’alcol, in uno studio ideale gli individui appartenenti al gruppo dei controlli dovrebbe essere esposto agli stessi livelli di tabacco e alcol rispetto ai casi. La mancanza di questa corrispondenza minimizza le potenziali differenze di genotipo tra le coorti, probabilmente limitando l’efficacia dello studio.