Preparazione delle matric

Le matrici bianche o contenenti LP sono state preparate a partire da dispersioni polimeriche ad opportune concentrazioni (3 e 0.2 % rispettivamente per PVP e PAA) preparate in tampone fosfato Sørensen pH 7.0, 66.7 mM, per PVP, e acqua di grado Milli- Q, per PAA. La dispersione di PAA è stata neutralizzata con NaOH. Le matrici contenenti LP sono state preparate a partire da una miscela 2: 1 di dispersione polimerica e LP. 100 µl delle dispersioni preparate sono stati liofilizzati in appositi stampi di polietilene per ottenere le matrici solide M-PVP, M-PAA, M-PVP/LP e M-PAA/LP.

4.4.2 Metodi

Le cellule HCE sono state seminate su piastre di Petri (µ-Dish Ibidi; Figura 16 ) in cui è presente un inserto. L’inserto è costituito da 2 camere con un’area di crescita ciascuna di 0.22 cm2 divise da un setto che occupa uno spazio fra le cellule.

HCE sono state seminate alla concentrazione di 3·105 cellule/ml, 70 µl in ciascuna camera; dopo 24 ore le cellule hanno raggiunto la confluenza e l’inserto è stato rimosso, mostrando 2 aree cellulari separate da un’apertura di dimensioni precise. La coltura è stata quindi mantenuta in condizioni di crescita diverse fino alla totale chiusura dell’apertura. A tempi prefissati di 0, 2, 4, 6, 8, 24 ore dopo la rimozione dell’inserto sono state eseguite microfotografie e le immagini sono state analizzate mediante il software ImageJ (software di dominio pubblico sviluppato dal National Institute of Mental Health, dipartimento del NIH) per determinare la dimensione dell’apertura e da essa il percorso di migrazione cellulare.

HCE sono state mantenute in contatto con: - mezzo di crescita (controllo positivo);

- mezzo di crescita senza siero fetale bovino (mezzo SS, controllo negativo);

- mezzo SS addizionato di: LP (15 % v/v); dispersione polimerica da M-PVP e M- PAA; dispersione polimerica da M-PVP/LP e M-PAA/LP; AG (1.5 % p/v), come sostanza di riferimento per l’attività proliferativa.

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Risultati

Le proprietà mucoadesive dello sciroppo antitussivo sono state valutate misurando la capacità dei suoi componenti di legarsi ai siti adesivi attivi presenti sulle cellule dell’epitelio buccale con due diversi protocolli, eseguendo i trattamenti delle cellule in microprovette o piastre da 96 pozzetti. La metodica era già descritta in letteratura (Patel et al., 1999) e prevedeva il trattamento delle cellule all’interno di provette. Questo metodo però comportava l’uso di grandi volumi di reattivo, costosi nella preparazione e gravosi nello smaltimento, ed il continuo trasferimento delle cellule trattate da una provetta all’altra con alta probabilità di perdita di materiale. Inoltre, la colorazione finale ottenuta era piuttosto tenue risultando in valori di densità ottica sempre piuttosto bassi, inferiori a 0.2, e quindi con poco margine per apprezzare differenze fra i vari prodotti.

Nell’ottica di rendere il metodo più riproducibile, meno costoso e meno impattante, anche dal punto di vista ambientale, è stata valutata la possibilità di apportare variazioni

seguendo due diverse strade: l’utilizzo di microprovette, che comunque poteva non eliminare il problema del trasferimento del materiale, e l’utilizzo di piastre. Inoltre, si è tentato di aumentare l’intensità della colorazione ottenuta alla fine dei trattamenti.

Il primo cambio saggiato è stato l’aumento della concentrazione del reattivo streptavidina perossidasi rispetto al metodo originale al fine di valutare un eventuale cambiamento di colorazione in funzione della concentrazione del reattivo. Il presupposto era che la concentrazione di enzima potesse essere insufficiente a trasformare tutto il substrato a disposizione. La concentrazione è stata quindi variata da 0.5 a 5.0 µ g/ml ma non è stata rilevata alcuna correlazione fra concentrazione di STRP ed intensità di colorazione.

In figura 17 sono riportati i risultati ottenuti con i due protocolli, utilizzando microprovette o piastre: si può notare che i trattamenti eseguiti in microprovetta ed in piastra hanno mostrato una tendenza a produrre densità ottiche più elevate nel trattamento in piastra anche se le differenze risultano significative solo per il controllo positivo CPC.

Nei trattamenti eseguiti in piastra sono stati variati anche i volumi di reattivo (100 o 200 µl), ma non sono state evidenziate correlazioni fra la densità ottica risultante ed il

quantitativo di reattivo impiegato. Infine, l’analisi spettrofotometrica dei campioni trattati in piastra è stata eseguita sia sul solo sovranatante, trasferito in altri pozzetti, che sul mezzo di reazione direttamente nel pozzetto di trattamento, quindi in presenza del letto di cellule. La lettura in presenza del letto di cellule sembra più variabile, seppure non porti, mediamente, a valori di densità ottica diversi (figura 18).

Dai risultati ottenuti è possibile concludere che il saggio può essere eseguito anche in piastre da 96 pozzetti, portando a risultati paragonabili a quelli ottenuti impiegando microprovette; per una maggiore ripetibilità la lettura spettrofotometrica deve essere eseguita sul sovranatante trasferito in pozzetti puliti. La concentrazione di enzima può essere mantenuta alla concentrazione più bassa saggiata.

Il saggio enzimatico di mucoadesione permette di correlare questa proprietà con il legame del prodotto a siti adesivi presenti sulle cellule, ma non rappresesnta la forza, e quindi la durata, di questo legame. Per questo tipo di valutazione il prodotto è stato sottoposto ad una valutazione mediante test tensile. In Figura 19 sono riportati i valori di lavoro di adesione ottenuti per lo sciroppo e la sostanza di riferimento (HPMC) mediante il test tensile.

I valori di lavoro di adesione dei prodotti studiati è in ogni caso diverso da quello ottenuto fra le sole superfici di mucina (386.5±31.34 erg/cm2), indicando che la separazione del sistema avviene all’interfaccia adesivo/mucina e non all’interno di essa. Il controllo positivo è costituito da una dispersione al 3.0 % di idrossipropilmetil cellulosa, conosciuto in letteratura come prodotto con buone capacità mucoadesive anche sulle mucose orali e che presenta infatti un alto valore di lavoro di adesione (533.5±36.06 erg/cm2).

Nelle condizioni di esecuzione del saggio il prodotto è considerato mucoadesivo in quanto presenta un valore di lavoro di adesione superiore a 200 erg/cm2 (309±16.93 erg/cm2), limite accettato in letteratura, seppure con moderata forza, probabilmente dovuta alla alta solubilità in acqua di almeno alcuni suoi componenti.

Analizzando gli indicatori statistici derivati dai due diversi metodi di valutazione della mucadesione, enzimatico su cellule o tensile su substrato mucoso, è possibile evidenziare che il metodo tensile risulta più accurato rispetto a quello che valuta l’entità di legame alle cellule in coltura, come dimostrato dai valori di CV% ottenuti negli esperimenti (Tab. 1). Comunque, i risultati di mucadesione ottenuti sono paragonabili: se riportiamo i valori di mucoadesione del prodotto come percentuale del valore ottenuto per il controllo avremo 55 % di mucoadesività, impiegando il metodo enzimatico su colture cellulari, e 57 % quando invece è impegato il test tensile.

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Nella figura 20 sono illustrati i risultati ottenuti dagli esperimenti di resistenza al lavaggio dello sciroppo dopo deposizione sulla superficie cellulare. Il grafico illustra il profilo della quantità di prodotto residuo al lavaggio nel tempo, come percentuale del totale impiegato per la prova.

Si può notare che le concentrazioni residue tendono a diminuire gradualmente nel tempo, ma che dopo 240 minuti è ancora presente il 44% di prodotto (Tab. 2). Il saggio dimostra che il prodotto in esame non è facilmente eliminato dalla superficie di cellule epiteliali orali, indicando una buona resistenza alla diluizione e alla rimozione.

Gli studi di citotossicità sono stati condotti su nuovi possibili eccipienti ad uso farmaceutico: liquidi ionici di nuova sintesi (gruppo Prof.ssa Chiappe), intesi come promotori di permeazione transdermica.

Come è noto, i promotori di permeazione aumentano la permeabilità a livello cutaneo mediante alterazioni transitorie delle caratteristiche chimico-fisiche dello strato corneo. Il principale problema associato a questa attività è l’irritazione cutanea derivante dalla distruzione delle strutture lipidiche organizzate delle membrane cellulari e dei loro componenti. Da qui l’importanza di valutare attentamente la citotossicità di eccipienti impiegabili quali promotori di permeazione. Nella presente tesi fu scelta una linea cellulare di epitelio corneale di coniglio come substrato per la valutazione della citotossicità, in quanto partricolarmente sensibile rispetto al tessuto cutaneo, e quindi rappresentando il peggiore scenario. La Figura 21, in cui sono riportati i dati ottenuti dal test di vitalità cellulare, illustra gli effetti di 1 ora di esposizione delle cellule a diverse concentrazioni dei differenti liquidi ionici allo studio come percentuale di vitalità cellulare rispetto al controllo. La vitalità cellulare era sopra il 70% per i prodotti B, D ed E, mostrando praticamente non tossicità anche ad alte concentrazioni. Differentemente, il liquido ionico C mostrava una certa tossicità, anche se solo alla sua più alta concentrazione (1.0%), con valori di vitalità cellulare che calavano al 36.4%. Solo il prodotto A mostrava una risposta dose dipendente con una curva sigmoidale dalla quale è stato possibile calcolare un valore di EC50 di 0.006% p/v: la più alta concentrazione saggiata produceva una vitalità cellulare inferiore al 30%.

I dati ottenuti dal saggio di citotossicità sono stati correlati con quelli ottenuti dagli studi di valutazione della proprietà enhancer dei liquidi ionici allo studio. Lo studio di permeazione è stato effettuato utilizzando come farmaco modello il diltiazem cloridrato e come substrato la pelle di ratto hairless (Monti et al. 2017), i liquidi ionici sono stati tutti impiegati a concentrazione dell’ 1%, la massima concentrazione saggiata sulle colture

cellulari. Osservando la figura 22, dove sono riportati i fattori di promozione, intesi come aumento della quantità di farmaco permeata in confronto al non utilizzo di promotore, in funzione della vitalità cellulare, si evince un’ottima correlazione fra le due serie di dati. Questa correlazione conferma la possibilità di estrapolare i dati di citotossicità dalle cellule corneali alla cute, se questa è vista come transitoria alterazione delle sue proprietà di barriera.

I saggi di citotossicità dimostrano chiaramente che i liquidi ionici B, D ed E sono praticamente non tossici sulle cellule corneali facendo presupporre la loro buona tollerabilità e accettabilità per uso cutaneo.

Il test di proliferazione e migrazione cellulare è stato effettuato come test indicativo della velocità di guarigione di una ferita superficiale corneale. Il presupposto del saggio è che le sostanze che accelerano la riduzione dell’apertura fra le due aree cellulari siano sostanze in grado di accelerare la guarigione di lesioni dell’epitelio corneale.

I risultati dei saggi biologici sono riportati in Tabella 3 ed in forma grafica in Figura 23, come riduzione dello spazio di apertura fra le due aree cellulari nel tempo, rappresentante lo spazio e la velocità di migrazione cellulare.

Dai risultati è evidente che la sottrazione del siero fetale bovino dal mezzo di crescita cellulare porta ad un rallentamento, seppure minimo, nella proliferazione e migrazione cellulare. Tale effetto viene compensato se il mezzo di crescita SS viene implementato con una uguale quantità di arabinogalattano. Questa sostanza è infatti conosciuta per la sua attività di stimolo della proliferazione e migrazione cellulare (Burgalassi et al., 2011). Quando il mezzo di crescita SS viene implementato con una uguale quantità di lisato piastrinico (LP) tale effetto non è visibile, anzi si assiste ad una diminuzione della velocità di migrazione delle cellule sul fronte dell’apertura, (da 28,58±2,17 a 15,58±0,70 µm/h per mezzo SS e LP, rispettivamente). L’effetto del LP è invece evidente quando questo è veicolato nella formulazione polimerica; l’aggiunta di M-PVP/LP e M-PAA/LP al mezzo di crescita SS porta in ogni caso ad un incremento nella velocità di chiusura dello spazio fra le aree cellulari e quindi del tempo stimato di copertura completa dello spazio. Questo effetto, maggiormente evidente per M-PVP/LP, la cui velocità di migrazione cellulare è paragonabile a quella ottenuta con il mezzo di crescita arricchito con il siero fetale bovino, sembrerebbe coadiuvato dalla presenza del polimero. È infatti noto che alcuni polimeri abbiano la proprietà di facilitare l’adesione delle cellule al substrato e quindi di facilitarne il processo di migrazione. PVP sembra presentare questa proprietà, non nota in letteratura e quindi sicuramente da approfondire con ulteriori studi. Il tempo stimato di chiusura dello

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spazio fra le aree cellulari risulta paragonabile a quello ottenibile con il mezzo di crescita cellulare completo (9,54 e 9,94 ore rispettivamente per mezzo di crescita e M-PVP).

In conclusione, LP sembra presentare un’attività sulla velocità di proliferazione delle cellule che però necessitano di un ulteriore stimolo per l’adesione e quindi per il processo di migrazione, stimolo impartito dal polimero impiegato nella formulazione, in modo particolare da PVP.

Studi futuri punteranno, oltre ad approfondire l’attività di PVP sulle cellule epiteliali corneali, a mettere in evidenza l’attività proliferativa di LP con saggi dedicati.