I dati riportati di seguito focalizzano l’attenzione sul profilo di suscettibilità ai singoli farmaci di prima linea INH, RIF, EMB e PZA ottenuto tramite sequenziamento e saggio HRM
Real-Time PCR.
L’analisi del profilo di suscettibilità ai farmaci attraverso sequenziamento è stata
eseguita amplificando sequenze specifiche di geni che contengono le regioni dove, secondo i dati di letteratura, sono state riscontrate le mutazioni più diffuse che conferiscono farmaco- resistenza. È stato identificato un totale di 13 mutazioni diverse (TABELLA 7 e FIGURA 15). Per analizzare la resistenza a INH sono stati sequenziati due frammenti, di cui il primo nel gene katG in cui è stata rilevata la sostituzione GC nel codone 315 (S315T) e il secondo nella regione del promotore di inhA in cui sono state identificate le mutazioni -34 CT, -15 CT e -8 TA. La resistenza a RIF è stata esaminata tramite sequenziamento di un frammento del gene rpoB in cui sono state rilevate 4 differenti mutazioni nei codoni 531 (TCGTTG), 526 (CACTAC e CACGAC) e 533 (CTGCCG). Per studiare la resistenza a EMB, è stato sequenziato un frammento del gene embB in cui sono state rilevate 4 differenti mutazioni tutte nel codone 306 (ATGATA, ATGATT, ATGGTG e ATGCTG), di cui le prime due determinano la stessa sostituzione amminoacidica
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(FIGURA 15). Infine è stato sequenziato l’intero gene pncA in cui è stata rilevata la
mutazione a livello del codone 57 (CATGAT).
Le mutazioni identificate tramite sequenziamento sono state utilizzate per effettuare l’analisi dei profili delle curve di melting ottenute tramite la tecnica di HRM Real-Time PCR
di ciascun isolato in modo da poter associare la presenza di una mutazione specifica con un determinato profilo di melting. I profili di suscettibilità ai farmaci ottenuti con le tecniche di sequenziamento e HRM sono stati poi confrontati con quelli derivati dall’antibiogramma colturale.
5.2.1 Isoniazide
Le analisi delle sequenze per la rilevazione della INH-resistenza hanno rilevato che 42 (60,9%) ceppi appartenenti al gruppo LONG DRUG e provenienti dalla U.O.C. Batteriologia avevano una mutazione a livello del gene katG e/o del promotore del gene inhA. Osservando in dettaglio i 37/42 (88,1%) isolati che presentavano mutazioni nel gene katG, tutti avevano la stessa mutazione AGCACC (S315T). Gli isolati che presentavano una mutazione nel promotore del gene inhA erano 14 (33,3%) di cui 1 aveva la sostituzione -8 TA, 12 avevano la sostituzione -15 CT e infine 1 isolato aveva la mutazione -34 CT (TABELLA 7). Nove isolati avevano una mutazione in entrambi i geni coinvolti nella INH-resistenza (FIGURA 15). Quindi il 91,1% (n=41/45) di isolati INH-resistenti secondo l’antibiogramma colturale presentavano una mutazione nota nel gene katG e/o inhA. Nei restanti (n=4/45) isolati non è stata rilevata alcuna mutazione nelle porzioni dei geni katG e inhA sequenziati. La sensibilità e la specificità di questa analisi tramite sequenziamento sono quindi risultate rispettivamente pari al 91% (CI95 79-98) e al 95,8% (CI95 79-91) rispetto all’antibiogramma colturale
(TABELLA 8).
L’analisi delle curve di melting degli amplificati del gene katG derivate dal saggio
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di riferimento H37Rv. Infatti, a causa della sovrapposizione dei profili delle curve dei ceppi
wild-type e mutanti, non è stato possibile associare una determinata curva di melting ad una
mutazione specifica (FIGURA 16). Il LOD6 del saggio era di 0,0875 ng/µl, mentre
l’efficienza ε era del 91-104% (TABELLA 9).
L’analisi della curva di melting dei prodotti PCR del promotore del gene inhA ha
mostrato che 14 isolati avevano un profilo di HRM differente da quello del ceppo H37Rv. In questo caso, la ΔFn era pari a -0,25 per gli isolati con la mutazione -15 C→T, a -0,15 ΔFn per
l’isolato con la sostituzione -34 C→T e a -0,05 per l’isolato con la mutazione -8 T→A. L’isolato 614-00, risultato resistente all’antibiogramma colturale ma privo di mutazione secondo sequenziamento, aveva una ΔFn = 0,10 (FIGURA 17). Poiché la ΔFn tra i ceppi wild- type e H37Rv era compresa tra -0,05 e 0, la curva di melting dell’isolato -8 TA non era
distinguibile da quella dei ceppi wild-type. La sensibilità e la specificità dell’analisi della INH-resistenza tramite HRM rispetto al gold standard erano rispettivamente pari al 31,1% (CI95 18-47) e al 100% (CI95 86-100) (TABELLA 8). Il LOD6 era < 0,044 ng/µl e l’efficienza
ε del saggio era del 80-92% (TABELLA 9). In confronto ai risultati del sequenziamento, la sensibilità e la specificità dell’analisi della farmaco-resistenza rispetto a INH (katG/inhA)
erano rispettivamente pari al 30,1% (CI95 18-47) e al 96,3% (CI95 81-100).
5.2.2 Rifampicina
L’analisi della sequenza della hot region del gene rpoB ha rilevato che 30 (43,5%)
ceppi provenienti dal progetto LONG DRUG e dalla U.O.C. Batteriologia di Siena presentavano 4 diverse mutazioni missenso nel suddetto gene. In particolare, 26 avevano la sostituzione TCGTTG (S531L), 1 la sostituzione CTGCCG (L533P) e 3 la mutazione a livello del codone 526 (TABELLA 7). Tra gli isolati che possedevano la mutazione del codone 526, 2 avevano la mutazione CACTAC (H526Y) e 1 la sostituzione CACGAC (H526D) (FIGURA 15). In tutti e 30 gli isolati risultati RIF-resistenti all’antibiogramma
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colturale è stata identificata una mutazione nel gene rpoB tramite sequenziamento. La sensibilità e la specificità dell’analisi della farmaco-resistenza tramite sequenziamento rispetto all’antibiogramma colturale erano rispettivamente del 100% (CI95 88-100) e 100% (CI95 91-
100) (TABELLA 8).
Successivamente è stata effettuatao il saggio HRM sugli amplificati del gene rpoB. L’analisi della curva di melting ha mostrato che 29 isolati avevano un profilo di HRM
differente da quello del ceppo H37Rv. Inoltre la ΔFn era pari a 0,35 per i 26 isolati con la
sostituzione S531L, a 0,25 per i 2 isolati con la mutazione H526Y, a 0,15 per l’isolato con la
mutazione H526D e a -0,05 per il ceppo L533P. La ΔFn tra gli isolati wild-type e il ceppo
H37Rv era invece compreso tra -0,1 e 0. Di conseguenza l’isolato con la mutazione L533P non presentava una curva di melting distinguibile rispetto a quella dei ceppi wild-type (FIGURA 18). In confronto al sequenziamento, la sensibilità e la specificità dell’analisi della RIF-resistenza tramite HRM erano rispettivamente del 96,7% (CI95 83-100) e del 100% (CI95
91-100). La sensibilità e la specificità dell’analisi della farmaco-resistenza tramite HRM di
rpoB erano in confronto all’antibiogramma colturale rispettivamente del 96,7% (CI95 83-100)
e del 100% (CI95 91-100) (TABELLA 8). Il LOD6 era di 0,044 ng/µl, mentre l’efficienza ε era
del 90-101% (TABELLA 9).
5.2.3 Etambutolo
L’analisi della sequenza del gene embB ha rilevato che 10 (14,5%) ceppi provenienti
dal progetto LONG DRUG e della U.O.C. Batteriologia di Siena presentavano 4 mutazioni diverse a livello dello stesso codone 306 (TABELLA 7). Quattro ceppi avevano la mutazione ATGATA (M306I), 4 ATGGTG (M306V), 1 ATGCTG (M306L) e 1 ATGATT (M06I). da notare che le mutazioni ATGATA e ATGATT risultano entrambe nella sostituzione di Met con Ile (FIGURA 15). Quindi solo 10/36 isolati EMB-resistenti tramite antibiogramma colturale presentavano una mutazione nel gene embB tramite sequenziamento.
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La sensibilità e la specificità dell’analisi della farmaco-resistenza tramite sequenziamento in confronto all’antibiogramma colturale erano pertanto rispettivamente del 27,8% (CI95 14-45)
e del 100% (CI95 89-100) (TABELLA 8).
L’analisi HRM degli amplificati del gene embB ha mostrato che 10 isolati avevano un
profilo di HRM differente da quello del ceppo H37Rv. La ΔFn era pari a -0,45 per i 4 isolati
con la mutazione M306I (ATGATT), a -0,25 per l’isolato M306L, a 0,25 per l’isolato con la sostituzione M306I (ATGATA) e a 0.4 per i 4 isolati con la mutazione M306V. La ΔFn
tra gli isolati wild-type e il ceppo di riferimento H37Rv era compreso tra 0,10 e 0 e pertanto tutte le curve di melting dei ceppi mutanti erano distinguibili dalle curve dei ceppi wild-type (FIGURA 19). In confronto al sequenziamento, la sensibilità e la specificità dell’analisi della EMB-resistenza erano rispettivamente del 100% (CI95 69-100) e del 100% (CI95 94-100). La
sensibilità e la specificità del saggio HRM in confronto all’antibiogramma colturale era invece rispettivamente del 27,8% (CI95 14-45) e del 100% (CI95 89-100) (TABELLA 8). Il LOD6 era
< 0,044 ng/µl e l’efficienza ε del saggio era del 98% (TABELLA 9).
5.2.4 Pirazinamide
I 5 campioni provenienti dal Laboratorio di Microbiologia e Virologia della A.O.U. Careggi di Firenze sono stati sottoposti a sequenziamento con i primer specifici per il gene
pncA. È stata tuttavia rilevata solo la mutazione 57 CATGAT (H57D), a causa del
fallimento del sequenziamento dei restanti 4 campioni. L’analisi della curva di melting relativa al gene pncA I (dalla posizione 2289115 a 2289316) tramite saggio HRM ha mostrato che l’isolato Pzafi_03 aveva una profilo di HRM differente da quello del ceppo H37Rv con
una ΔFn di ≃ 0,10 (FIGURA 20A), mentre l’esame delle curve relative alla posizione a valle
di pncA (posizione da 2288972 a 2289133) ha permesso di distinguere 3 isolati rispetto al ceppo di riferimento (FIGURA 20B). In particolare, la ΔFn era pari a ≃ -0,18 per l’isolato
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l’isolato Pzafi_04. La sensibilità e la specificità del saggio HRM in confronto all’antibiogramma colturale erano invece rispettivamente del 80% (CI95 28-100) e del 100%
(CI95 3-100) (TABELLA 8). Il LOD6 era < 0,044 ng/µl e l’efficienza ε del saggio era del 92%
43 6. DISCUSSIONE
M. tuberculosis è l’agente eziologico della tubercolosi (TB). Secondo l'OMS, nel
2015, circa 10,4 milioni di persone hanno sviluppato una TB attiva di cui 1,8 milioni hanno avuto un esito fatale [8]. Il trattamento farmacologico anti-TB in uso comprende quattro farmaci denominati di “prima linea”: INH, RIF, EMB e PZA [36]. Tale terapia ha migliorato
sensibilmente il quadro epidemiologico mondiale, tuttavia, il continuo aumento di isolati farmaco-resistenti rappresenta un serio ostacolo per il controllo della malattia. La gestione inappropriata della TB ha fortemente contribuito all’insorgenza di isolati MDR e XDR
[32;33].
In questo lavoro di tesi, sono stati analizzati 74 isolati clinici di M. tuberculosis tramite tre diversi approcci, quali l’antibiogramma colturale, il sequenziamento e la HRM
Real-Time PCR di geni associati a farmaco-resistenza al fine di confrontare
metodologicamente e definire il profilo di suscettibilità ai farmaci di prima linea INH, RIF, EMB e PZA dei suddetti isolati. Il primo metodo utilizzato è stato l’antibiogramma colturale.
Il test fenotipico è universalmente considerato il gold standard per la determinazione della suscettibilità ai farmaci antimicobatterici [19;89]. Tale metodo si basa sull’analisi fenotipica dell’isolato clinico e prevede quindi la coltura del ceppo in terreno solido o liquido in
presenza dei singoli farmaci [26;27]. I risultati dell’antibiogramma colturale confermano i dati di letteratura [90] relativamente a una bassa percentuale di isolati monoresistenti (24,3%) contro un’alta frequenza di multiresistenti, talvolta anche a 3 dei 4 farmaci di prima linea
(36,5%). È importante sottolineare come tutti gli isolati RIF-resistenti in esame erano anche INH-resistenti, in accordo con altri studi che riportano che oltre il 90% degli isolati RIF- resistenti sono resistenti anche a INH [42;54]. Tale osservazione conferma che la RIF- resistenza è un ottimo marker di MDR-TB, come testimoniato dal suo utilizzo in strumenti diagnostici di TB-MDR, quali il sistema Xpert MTB/RIF [30;40]. I dati fenotipici di RIF-
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resistenza sono stati poi ampiamente confermati dai due saggi molecolari in analisi. Abbiamo deciso di effettuare il sequenziamento sulla hot region del gene rpoB, poiché le mutazioni in questa regione comprendono oltre il 96% degli isolati RIF-resistenti [42]. Il sequenziamento del suddetto gene ha individuato tutti gli isolati RIF-resistenti e inoltre ha permesso di caratterizzare il tipo di mutazione presente (FIGURA 21), comprovando anche nel nostro caso la rilevanza del gene rpoB come bersaglio principale delle mutazioni associate a RIF- resistenza. Tutte le mutazioni identificate interessavano i codoni 531, 526 e 533 con una frequenza rispettivamente pari al 86,7%, 10% e 3,3% ed erano quindi quelle epidemiologicamente più frequenti [44]. I mutanti sopracitati avevano un fenotipo di resistenza ad alte concentrazioni di farmaco, come descritto precedentemente [42;44]. Infine, l’utilizzo della HRM Real-Time PCR per l’analisi delle curve di melting degli amplificati del
gene rpoB è stata capace di riconoscere quasi la totalità di isolati RIF-resistenti (29/30, FIGURA 21), dimostrando un’ottima sensibilità, specificità ed efficienza.
I dati dell’antibiogramma colturale degli isolati in esame ha anche evidenziato un’alta
frequenza di INH-resistenza (65%), in accordo con dati recenti che riportano percentuali paragonabili di isolati INH-resistenti non RIF-resistenti [34;91]. Successivamente, per esaminare la INH-resistenza con metodi molecolari, abbiamo selezionato i geni katG e inhA, in quanto quasi il 90% degli isolati INH-resistenti presentano mutazioni in questi geni e, in particolare, circa il 64% dei mutanti INH-resistenti posseggono mutazioni nel gene katG a livello del codone 315 (Ser315Thr) [42;44;50;53]. I dati di sequenziamento complessivi su entrambi i geni hanno rilevato il 93,3% (42/45, FIGURA 21) di mutazioni rispetto al test fenotipico e hanno evidenziato che 37/45 (82,2%) ceppi presentavano la sostituzione amminoacidica Ser315Thr. Le mutazioni nel gene inhA sono state invece riscontrate in 14/45 (31,1%) isolati e tutte erano localizzate nella regione del promotore come riportato in numerosi studi [39;50]. È interessante notare come 2/3 isolati risultati fenotipicamente INH- resistenti solo a concentrazioni critiche avessero mutazioni solo nel gene inhA, le quali infatti
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conferiscono resistenza solo a basso livello [39;50]. Tra gli isolati con mutazioni nel gene
inhA è stata identificata la sostituzione nucleotidica -34 CT, non ancora riportata in
letteratura. Non è stato tuttavia possibile associare tale mutazione a INH-resistenza, in quanto l’isolato esaminato aveva anche la mutazione S315T nel gene katG, che invece conferisce
farmaco-resistenza ad alte concentrazioni di farmaco [44]. I dati invece ottenuti tramite la tecnica di HRM hanno messo in evidenza limitazioni significative a causa del fallimento nella rilevazione degli isolati INH-resistenti con mutazioni nel gene katG. Non sono noti i motivi di tale insuccesso sperimentale, anche se potrebbe dipendere dalla termodinamica dello specifico frammento amplificato (es. la mutazione nel codone 315 comporta la sostituzione AGCACC che è termodinamicamente meno rilevabile rispetto ad una sostituzione purina↔primidina). L’analisi tramite HRM del promotore del gene inhA ha invece permesso
di rilevare 13/14 mutazioni ottenute tramite sequenziamento. Affinchè la tecnica di HRM sia utile a fini diagnostici, diventa cruciale la messa a punto del saggio per il gene katG, dato che le mutazioni presenti nel gene inhA coprono solo il 10-20% degli isolati INH-resistenti [92] e talvolta non conducono a resistenza fenotipica [38].
Circa la metà (51%) degli isolati in studio era EMB-resistente secondo l’antibiogramma colturale (FIGURA 21). Poiché i dati epidemiologici riportano che il 47-
65% degli isolati resistenti possiede mutazioni nel gene embB [60;61], abbiamo focalizzato l’attenzione su questo gene. Tuttavia, sia il sequenziamento che la HRM sul gene embB,
hanno mostrato solo il 27,7% (10/36, FIGURA 21) di ceppi EMB-resistenti in confronto ai dati del test fenotipico. Malgrado il saggio HRM abbia manifestato una sensibilità e specificità paragonabili a quelle del sequenziamento, il gene embB non è in grado da solo di coprire una percentuale rilevante di isolati EMB-resistenti, rendendo necessario l’estensione dell’analisi ad altri geni, quali il gene embC. Alcuni studi hanno infatti riportato la presenza di mutazioni conferenti EMB-resistenza anche negli altri geni dell’operone embCBA [60;61].
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La PZA è un farmaco cruciale nella terapia della TB per la sua elevata capacità battericida in vivo, la sua efficacia nei confronti dei bacilli intracellulari e il suo utilizzo nel trattamento della TB-MDR [36;77]. Ciononostante, i convenzionali saggi fenotipici sono spesso difficoltosi e forniscono risultati talvolta inaffidabili. Di conseguenza, la disponibilità di saggi molecolari per la valutazione dell PZA-resistenza è di particolare importanza. In questo lavoro di tesi, sono stati analizzati 5 isolati con PZA-resistenza. Poiché l’intero gene
pncA da solo sembra coprire circa il 72-98% delle mutazioni che conferiscono PZA-resistenza
[42;93], è stata eseguita l’analisi tramite sequenziamento su tale gene. Sebbene il sequenziamento abbia identificato solo 1/5 degli isolati PZA-resistenti, l’utilizzo della HRM
Real-Time PCR ha invece mostrato che 4/5 isolati PZA-resistenti avevano un profilo di HRM
differente da quello del ceppo wild-type di controllo. A causa della mancanza dei corrispondenti dati di sequenza, tuttavia, non è stato possibile associare ogni profilo di
melting ad una particolare mutazione, ad eccezione del mutante a livello del codone 57
(HisAsp). Il presente risultato preliminare ottenuto tramite HRM Real-Time PCR è incoraggiante, ma necessita di ulteriori campioni da testare al fine di migliorare il livello di confidenza del saggio.
L’antibiogramma colturale rimane, per adesso, il sistema di riferimento per valutare la
suscettibilità agli antimicobatterici. Tuttavia, i metodi genotipici sono in continua e rapida ascesa e, si prevede che, in alcuni casi, potrebbero non solo affiancare ma addirittura sostituire alcuni saggi fenotipici. L’identificazione genotipica è già l’approccio preferito per la
rilevazione della RIF-resistenza (Xpert MTB/RIF) [30]e parzialmente anche per la PZA- resistenza[93]. Le metodologie molecolari per la ricerca di mutazioni associate alla farmaco- resistenza sono molteplici e alcune di queste hanno un livello di sensibilità e specificità tali da essere considerate come il futuro gold standard del Drug Susceptibility Testing per M.
tuberculosis [36;40;44;79]. Il sequenziamento dei geni associati a farmaco-resistenza è un
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ma presuppone la conoscenza di tutti i geni coinvolti nella chemioresistenza. La farmaco- resistenza in M. tuberculosis origina da mutazioni puntiformi che possono conferire resistenza tramite modificazione e/o overespressione del bersaglio del farmaco o inibizione dell’attivazione del farmaco. Tuttavia, recenti studi hanno sottolineato come mutazioni
compensatorie secondarie possano implementare la fitness batterica compensando così il ‘costo’ delle mutazioni associate alla resistenza e influenzando indirettamente la suscettibilità
ai farmaci [85;94]. Alla luce di questo panorama e poiché le mutazioni possono verificarsi nell’intero genoma del bacillo, la strategia definitiva è rappresentata dal sequenziamento dell’intero genoma [40;85]. Questo approccio presuppone, tuttavia, la disponibilità nell’ambito di un laboratorio diagnostico standard di attrezzature sofisticate e di personale
specializzato, oltre al fatto di necessitare tempi di esecuzione relativamente lunghi e costi elevati.
La tecnologia della HRM Real-Time PCR rappresenta invece un metodo semplice, efficace e rapido per identificare mutazioni associate alla chemio-resistenza. Nell’ultimo decennio diversi studi hanno applicato la HRM Real-Time PCR all’analisi della farmaco- resistenza nei micobatteri [84;95]. Questo approccio presuppone la conoscenza a priori (tramite sequenziamento) delle mutazioni genetiche epidemiologicamente più rappresentate così da poter associare in maniera univoca ad un determinato profilo di melting una specifica mutazione. La costruzione di una ‘banca dati’ contenente i principali profili di
melting/mutazioni che conferiscono farmaco-resistenza, permetterebbe l’identificazione in
tempo reale di una mutazione presente in un isolato clinico, evitando la necessità di sottoporre il campione a sequenziamento e riducendo in maniera significativa il tempo di refertazione. In conclusione, in questa tesi, è stato sviluppato e validato un saggio molecolare in-house per l’identificazione e caratterizzazione della farmaco-resistenza in 74 isolati clinici di M.
tuberculosis utilizzando la tecnologia della HRM Real Time PCR. Il saggio ha dimostrato una
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economico rispetto a kit commerciali e/o altri test molecolari in-house che prevedono l’utilizzo di sonde costose. In futuro, ci proponiamo di risolvere le difficoltà relative all’identificazione delle mutazioni nel gene katG, di aumentare il numero di isolati PZA-
resistenti da testare e di esaminare il problema della eteroresistenza di campioni clinici contenenti sia micobatteri mutanti farmaco-resistenti sia di ceppi wild-type sensibili.
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7. FIGURE E TABELLE
FIGURA 1. Struttura della parete cellulare di M. tuberculosis. La parete
cellulare di M. tuberculosis è composta da tre macromolecole distinte: peptidoglicano, arabinogalattano e acidi micolici circondati da una capsula esterna costituita da proteine e polisaccaridi. Lo strato di peptidoglicano circonda la membrana plasmatica. Uno strato di arabinogalattano circonda lo strato di peptidoglicano. È costituito da ripetizioni del disaccaride galattano modificato con lunghi polimeri arabinici. La maggior parte dell’arabinogalattano è legata agli acidi micolici a catena lunga che creano la caratteristica superficie di consistenza cerosa dei micobatteri e contribuiscono all'impermeabilità della parete cellulare. La figura è stata modificata da Kieser
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FIGURA 2. Patogenesi della TB. Il M. tuberculosis attraverso l’aerosol infetto
giunge fino agli alveoli polmonari dove è fagocitato dai macrofagi alveolari. Il batterio impedisce la fusione del fagosoma con i lisosomi ed è così in grado di evadere il killing macrofagico. Il contenimento dell’infezione è correlata alla capacità del sistema immunitario dell’ospite di limitare la proliferazione del bacillo. I macrofagi alveolari, le cellule epitelioidi e le cellule giganti di Langherans insieme ai micobatteri intracellulari formano il nucleo centrale di una massa necrotica circondata da una spessa parete di cellule T CD4+, CD8+, NK e macrofagi. Questa struttura è chiamata granuloma. Se la risposta dell’ospite è efficace, la lesione calcifica. Tuttavia nel polmone calcificato i batteri possono rimanere quiescenti o essere riattivati ad anni di distanza. Se la lesione progredisce, i granulomi potranno confluire e dare esito alla tipica necrosi caseosa (tubercolo). In alcuni casi, potrà conseguire un processo di colliquazione con possibile disseminazione batterica in altri distretti e/o eliminazione dei bacilli tramite aerosol infetto contribuendo così alla trasmissione aerogena dell’infezione. La figura è stata modificata da Nunes-Alves C. et al, Nat Rev Microbiol, 2014.
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A
B
FIGURA 3. Quadro epidemiologico della TB nel mondo nel 2016. A. Incidenza
della TB per 100.000 abitanti. I nuovi casi sono distribuiti soprattutto nell’Africa centromeridionale e nel sud-est asiatico. B. Distribuzione (%) di nuovi casi di MDR- TB. La regione dell’Ex Unione Sovietica è la zona a maggior di incidenza di isolati di MDR. Le immagini sono state modificate dal Global tuberculosis report, WHO 2016.