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SCUOLA DI SPECIALIZZAZIONE IN MICROBIOLOGIA E VIROLOGIA
DIPARTIMENTO DI RICERCA TRASLAZIONALE E DELLE NUOVE
TECNOLOGIE IN MEDICINA E CHIRURGIA
“High Resolution Melting Real-Time PCR” per il rilevamento delle
chemioresistenze in isolati clinici di Mycobacterium tuberculosis
Relatore:
Prof.ssa Susanna Ricci
Correlatore: Prof. Gianni Pozzi
Tesi di: Dott. Stefano De Giorgi
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Mi picchiano in vario lor metro spiando non so quali segni, m'auscultano con gli ordegni il petto davanti e di dietro. E sentono chi sa quali tarli i vecchi saputi... A che scopo? Sorriderei quasi, se dopo non bisognasse pagarli.. "Appena un lieve sussulto all'apice... qui... la clavicola..." E con la matita ridicola disegnano un circolo azzurro. "Nutrirsi... non fare più versi... nessuna notte più insonne... non più sigarette... non donne... tentare bei cieli più tersi: Nervi... Rapallo... San Remo... cacciare la malinconia; e se permette faremo qualche radioscopia..."
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INDICE
1. RIASSUNTO/ABSTRACT ……… pag. 3
2. INTRODUZIONE ……….………. pag. 8
2.1 Mycobacterium tuberculosis: caratteristiche generali, virulenza e
patogenesi………..……. pag. 8
2.2 Epidemiologia ……… pag. 10
2.3 Diagnosi di laboratorio ……….……… pag. 12
2.4 Antibiotici e antibiotico resistenza nella TB …….……….….… pag. 14
2.4.1 Isoniazide ……….….….….. pag. 15 2.4.2 Rifampicina ……….………….… pag. 16 2.4.3 Etambutolo ……….……….………….… pag. 17 2.4.4 Pirazinamide ……….…..………….. pag. 18
2.4.5 Farmaci di seconda linea ……….……….……… pag. 19
2.5 Analisi delle chemioresistenze ………..………. pag. 20
2.5.1 Antibiogramma colturale ………...…………... pag. 20
2.5.2 Antibiogramma molecolare ………... pag. 22
2.5.2.1 Test molecolari approvati dall’Organizzazione
Mondiale della Sanità (OMS)……….…… pag. 22
2.5.2.2 Altri approcci molecolari ..……….…… pag. 23
3. SCOPO DELLA TESI …...……….………. pag. 27
4. MATERIALI E METODI ………... pag. 29
4.1 Campioni ………... pag. 29
4.2 Analisi delle chemioresistenze ………. pag. 29
4.2.1 Antibiogramma colturale ……….…… pag. 29
4.2.2 Preparazione dei campioni per le analisi molecolari …..…... pag. 31
4.2.3 Identificazione delle mutazioni tramite sequenziamento ……… pag. 32
4.2.4 Identificazione delle mutazioni tramite High Resolution Melting
Real-Time PCR………. pag. 32
4.2.5 Analisi statistica e validazione del saggio ..………. pag. 33
2 5.1 Profilo fenotipico di suscettibilità agli antibiotici di prima linea .... pag. 36
5.2 Profilo genotipico di suscettibilità agli antibiotici di prima linea.... pag. 37
5.2.1 Isoniazide …..………... pag. 38 5.2.2 Rifampicina ……….……… pag. 39 5.2.3 Etambutolo ……..……….………..………. pag. 40 5.2.4 Pirazinamide ……….……….………... pag. 41 6. DISCUSSIONE ………. pag. 43
7. FIGURE E TABELLE ……….…….. pag. 48
8. ABBREVIAZIONI …..……….…….……….. pag. 81
9. BIBLIOGRAFIA ….……….….……. pag. 82
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1. RIASSUNTO
Mycobacterium tuberculosis è l’agente eziologico della tubercolosi. La terapia
antibiotica ha notevolmente ridotto la mortalità ma, il crescente numero di isolati resistenti a uno o più farmaci rappresenta un grosso ostacolo per il controllo della malattia a livello globale. I metodi colturali sono universalmente considerati il gold standard per la determinazione dell’antimicobatteriogramma. L'uso dei test fenotipici è tuttavia ostacolato
dalla lenta crescita del microorganismo che comporta ritardi nell’inizio della terapia. L'identificazione mediante sequenziamento delle mutazioni genetiche responsabili di fenotipi resistenti ha consentito di sviluppare diverse tecniche molecolari per la rilevazione della resistenza ai farmaci di prima e seconda linea con tempi di risposta molto ridotti.
Lo scopo di questo lavoro di tesi è stato quello di costruire un pannello diagnostico utilizzando la tecnologia della High Resolution Melting Real-Time PCR (HRM) in modo da identificare e caratterizzare le mutazioni genetiche in grado di conferire resistenza fenotipica ai farmaci di prima linea in isolati clinici di M. tuberculosis. A tale scopo, sono stati raccolti 74 isolati, di cui 57 risultati resistenti, secondo l’antibiogramma colturale, ad almeno uno dei farmaci di prima linea, quali isoniazide (INH), rifampicina (RIF), etambutolo (EMB) e pirazinamide (PZA). Successivamente, è stato definito il profilo di suscettibilità ai suddetti farmaci tramite due diversi approcci molecolari. Il primo metodo consisteva nel sequenziamento delle regioni geniche dove sono descritte, secondo dati di letteratura, le mutazioni più frequentemente correlate alla farmaco-resistenza. Tale metodo ha permesso di rilevare 13 diverse mutazioni genetiche: (i) 1 mutante nel gene katG e 3 nel promotore del gene inhA (INH-resistenza), (ii) 4 mutanti nel gene rpoB (RIF-resistenza), (iii) 4 mutanti nel gene embB (EMB-resistenza), (iv) 1 mutante nel gene pncA (PZA-resistenza). Il secondo metodo consisteva invece nella messa a punto e applicazione della tecnica della HRM
Real-4 Time PCR ai suddetti isolati clinici con l’obiettivo finale di associare al profilo di melting di
ciascun isolato una (e solo una) mutazione genetica nota correlata alla farmaco-resistenza. Rispetto al sequenziamento, tale tecnica è stata in grado di rilevare: (i) quasi il 100% delle mutazioni localizzate nel gene inhA e nessuna nel gene katG, (ii) il 96,7% delle mutazioni nella hot region del gene rpoB, (iii) il 100% delle mutazioni nel gene embB. Riguardo ai 5 isolati PZA-resistenti, sono stati ottenuti 4 diversi profili di melting, ma solo uno è stato associato a una mutazione specifica a causa del fallimento del sequenziamento degli altri 4 campioni. Il saggio HRM è stato poi validato attraverso l’analisi di parametri intra-test (efficienza e limite di rilevazione) e inter-test (sensibilità e specificità). Mettendo a confronto i tre diversi approcci, la sensibilità dei metodi molecolari è risultata generalmente inferiore rispetto al gold standard colturale, ma tale valore era variabile in base al gene target in esame. I tre metodi si sono rivelati equivalenti (sensibilità = 97-100%) nella identificazione della RIF-resistenza, mentre nel caso della EMB-resistenza, entrambi i saggi molecolari hanno dimostrato una bassa sensibilità (27,8%) rispetto all’antibiogramma colturale probabilmente
perché molte mutazioni che conferiscono resistenza a EMB sono localizzate al di fuori del gene embB da noi scelto. Per quanto riguarda la INH-resistenza, la tecnologia della HRM ha mostrato limiti significativi per la mancata identificazione di profili di melting mutazione-specifici nel gene katG, che è descritto in letteratura come il principale gene (64% degli isolati) associato a INH-resistenza. Inoltre, le mutazioni nel gene inhA, seppur individuate con questo saggio, coprono epidemiologicamente solo il 10-20% della resistenza a INH. La HRM si è invece dimostrata promettente per l’identificazione e la caratterizzazione della PZA-resistenza, soprattutto considerando le difficoltà interpretative dell’antibiogramma colturale
per PZA.
In conclusione, la tecnologia HRM, se ulteriormente implementata sia qualitativamente (per katG) che quantitativamente (numerosità campionaria), si propone come
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un approccio rapido, efficiente ed economico per analizzare la farmaco-resistenza in isolati di
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ABSTRACT
Mycobacterium tuberculosis is the etiologic agent of tuberculosis. Antibiotic therapy has
significantly reduced mortality, but the increasing number of isolates resistant to ≥ 1 drugs represents a major difficulty to global disease control. Cultural methods are universally considered as the gold standard to determine drugs susceptibility profiles. However, phenotypic tests delay the beginning of therapy due to slow growth of the microorganism. Sequence identification of mutations responsible for resistant phenotypes has allowed to develop and implement several molecular techniques for rapid detection of first and second line drugs.
The aim of the present thesis was to develop a diagnostic panel to identify and characterize genetic mutants conferring resistance to first line drugs in clinical isolates of
M. tuberculosis by using “High Resolution Melting Real-Time PCR” (HRM) technology.
To this purpose, 74 isolates were collected, of which 57 were resistant to at least one of the first line drugs: isoniazid (INH), rifampicin (RIF), ethambutol (EMB) and pyrazinamide (PZA) according to culture antibiogram. Then, the drug susceptibility profile of these isolates was defined by using two different molecular approaches. The first method consisted in sequencing the genes where mutations were frequently associated with drug resistance, as described in the literature. This method allowed to detect 13 different genetic mutations: (i) 1 mutant in the katG gene and 3 in the inhA gene (INH-resistance), (ii) 4 mutants in the rpoB gene (RIF-resistance), (iii) 4 mutants in the
embB gene (EMB-resistance), (iv) 1 mutant in the gene pncA (PZA-resistance). The
second method consisted in the development, validation and implementation of the “HRM
Real-Time PCR” technology with the ultimate goal of associating a defined melting profile of each isolate to one (and only one) genetic mutation conferring drug resistance. Compared to sequencing, this approach detected: (i) almost 100% of inhA mutations and
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none in the katG gene; (ii) 96.7% of mutations in the rpoB hot region; (iii) 100% of embB mutations. As regard to the 5 PZA-resistant isolates, 4 different melting profile were observed. Only one was associated to a specific mutation due to sequence failure of the other 4 samples. HRM was finally validated by assessing intra-test (efficiency and detection limit) and inter-test (sensitivity and specificity) parameters. By comparing the three different methodologies, sensitivity of the molecular methods was generally lower compared to the gold standard phenotypic test, but the value varied depending on the target gene. The three methods showed to be comparable (sensitivity = 97-100%) in the identification of RIF resistance. As for EMB-resistance, both molecular assays demonstrated low sensitivity (27.8%) compared to the culture approach probably because the majority of mutations conferring EMB-resistance are located outside the embB gene. HRM technology has shown significant limitations in detecting INH-resistance, as it failed at identifying mutations in the katG gene; moreover, inhA mutations, although were all retrieved by HRM, epidemiologically cover only 10-20% of drug resistant isolates. HRM, on the other hand, showed to be promising for the identification and characterization of PZA-resistance, especially considering that phenotypic testing for PZA is challenging and often leads to unreliable results.
In conclusion, qualitatively (katG gene) and quantitatively (sample size of PZA-resistant isolates) implementation of HRM technology has the potential to account HRM as a rapid, efficient and cost-effective approach to analyze drug-resistant clinical isolates of M. tuberculosis.
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2. INTRODUZIONE
2.1 M. tuberculosis: caratteristiche generali, brevi cenni di virulenza e patogenesi
Mycobacterium tuberculosis o bacillo di Koch (BK) è l’agente eziologico della tubercolosi
(TB). È un bacillo sottile, diritto o leggermente incurvato le cui dimensioni variano da 2-4 µm di lunghezza e 0,2-0,3 µm di larghezza. Appartiene al genere Mycobacterium, famiglia
Mycobacteriaceae e classe Actinobacteridae. È un organismo aerobio obbligato, immobile,
asporigeno e ha un tempo di replicazione lungo (circa 15 ore) [1]. Gran parte delle proprietà esclusive che caratterizzano il genere Mycobacterium sono, direttamente o indirettamente, legate alla struttura della parete cellulare, che è alla base dell’alcol-acido resistenza di M.
tuberculosis [1]. La parete è costituita per circa il 60% del peso secco da lipidi (FIGURA 1).
La struttura di base è tipica dei batteri positivi. Tuttavia, rispetto a un batterio gram-positivo sono presenti mannosidi di fosfatidilinositolo e lipoarabinomannano ancorati alla membrana. Nello strato di peptidoglicano si inseriscono gli arabinogalattani, polisaccaridi ramificati formati da D-galattosio e D-arabinosio. Quest’ultimo è esterificato con gli acidi micolici, una particolare classe di acidi grassi β-idrossilati a catena lunga. Sono gli acidi micolici che si complessano con un’ampia varietà di polisaccaridi e peptidi, creando una
superficie di consistenza simile alla cera, che rende i micobatteri fortemente idrofobici [1;2]. In questo paragrafo sono esposti solo brevi cenni sulla virulenza e sui meccanismi patogenetici coinvolti nell’infezione da BK. I bacilli di M. tuberculosis solitamente infettano i
polmoni, ma l’infezione può interessare anche altri distretti come il rene, l’apparato scheletrico e il sistema nervoso centrale. Non tutti i pazienti infetti manifestano una TB attiva. Di conseguenza possono verificarsi due condizioni correlate alla tubercolosi: l’infezione latente (LTBI) e la malattia acuta. Sebbene questo microrganismo non produca fattori classici di virulenza, possiede proprietà strutturali che sono state riconosciute per il loro contributo
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alla virulenza e patogenesi della malattia. In una review dettagliata sui determinanti della virulenza di M. tuberculosis [3], sono state proposte 4 categorie di fattori di virulenza. La prima categoria comprende fattori secreti come HspX, Esat6/CFP-10 e una proteina di 19-kDa con funzione non ancora nota. Particolare attenzione è stata rivolta a queste proteine come marcatori diagnostici della LTBI. La seconda categoria comprende componenti della superficie cellulare come proteine coinvolte nella sintesi della parete. Tra questi è presente anche il fattore cordale, un glicolipide responsabile della crescita in forma di catene parallele implicato nell’inibizione della fagocitosi e sopravvivenza endovescicolare nei macrofagi. La
terza categoria include enzimi coinvolti nella crescita batterica e che fanno parte del metabolismo di amminoacidi, purine, lipidi e acidi grassi. Infine, l’ultima classe di fattori comprende il sistema di regolazione a due componenti PhoP/PhoR che sembra essere essenziale per la crescita e la virulenza del bacillo tubercolare [3].
Il M. tuberculosis è trasmesso per via respiratoria (FIGURA 2). Attraverso l’aerosol infetto giunge fino agli alveoli dove è fagocitato dai macrofagi alveolari. M. tuberculosis impedisce la fusione del fagosoma con i lisosomi bloccando l’antigene endosomico precoce 1 (EEA1). Il fagosoma è in grado di fondersi con altre vescicole intracellulari, garantendo così l’accesso ai nutrienti e facilitando la replicazione intravacuolare del batterio [3]. M.
tuberculosis è in grado inoltre di evadere il killing macrofagico mediato da intermedi reattivi
dell’azoto e dell’ossigeno [4]. In risposta all’infezione, i macrofagi secernono interleuchina 12
(IL-12) e il fattore di necrosi tumorale alfa (TNF-α). Queste citochine aumentano il fenomeno infiammatorio locale attraverso il reclutamento di linfociti T e Natural Killer (NK) nell’area dei macrofagi infettati e inducono la differenziazione dei linfociti in cellule Th1, con conseguente secrezione di interferone gamma (INF-γ) [5]. L’aumento di INF-γ attiva i macrofagi infettati potenziandone, insieme al TNF-α, le proprietà di killing intracellulare. Una recente rivisitazione del sopradescritto “dogma centrale” dell’immunità contro la TB mette in risalto l’intervento anche di altre popolazioni di cellule T nel controllo dell’infezione di M.
10 tuberculosis, quali cellule T di CD8 +, cellule T non convenzionali come le cellule T γδ,
cellule T invarianti associate alla mucosa e cellule T CD1-restricted [6].
La clearance batterica è correlata alla capacità del sistema immunitario dell’ospite di contenere la proliferazione del bacillo. I macrofagi alveolari, le cellule epitelioidi e le cellule giganti di Langherans con i micobatteri intracellulari formano il nucleo centrale di una massa necrotica circondata da una spessa parete di cellule T CD4+, CD8+, NK e macrofagi. Questa struttura è chiamata granuloma. Se la risposta dell’ospite riesce a contenere l’infezione, la
lesione calcifica e si forma il complesso primario [3]. I batteri possono rimanere quiescenti in questo stadio o essere riattivati ad anni di distanza; se invece la risposta immunitaria del paziente è deficitaria (es. invecchiamento, immunosoppressione patologica e/o farmacologica) l’infezione potrà progredire. A livello polmonare, i granulomi potranno confluire e dare esito
alla tipica necrosi caseosa. In alcuni casi potrà conseguire un OMSprocesso di colliquazione con possibile disseminazione batterica in altri distretti (tubercolosi miliare) e/o eliminazione dei bacilli tramite aerosol infetto contribuendo così alla trasmissione aerogena dell’infezione [2;7].
2.2 Epidemiologia
Secondo l'OMS, nel 2015, circa 10,4 milioni di persone hanno sviluppato una TB attiva, e di questi 1,8 milioni hanno avuto un esito fatale. La TB è distribuita in modo eterogeneo nel mondo [8] (FIGURA 3A). Un importante fattore di rischio per contrarre l’infezione tubercolare è la presenza dell’infezione da HIV [9]: l’11% di tutti i nuovi casi di malattia
attiva e il 25% di decessi correlate alla TB si verificano in soggetti HIV-positivi. Altri fattori di rischio includono il diabete mellito di tipo 2 [2;10], l'abuso di alcol [11] e fumo [12]. Il 5-15% degli individui infetti da M. tubercolosis progredisce in malattia attiva in un tempo variabile che va da qualche mese a qualche anno [13], mentre il rimanente 85-95% mantiene un rischio variabile ma persistente di sviluppare la malattia durante tutta la vita [14]. Dal 1900
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al 1980, le morti per TB in Europa occidentale e Stati Uniti sono diminuite di 100 volte [15]. Questo declino era parzialmente iniziato anche prima della scoperta dei farmaci anti-TB grazie ai miglioramenti delle condizioni igienico-sanitarie ed economiche. Al contrario, l'incidenza di TB attiva è aumentata in Africa soprattutto a causa dell'epidemia di HIV-1. Secondo il documento congiunto ECDC e OMS Europa “Tuberculosis surveillance and monitoring in Europe 2016”, nella Regione Europea della OMS (53 paesi) sono stati notificati
340 mila nuovi casi di TB nel 2014, pari al 3,6% dell’incidenza mondiale. In questi paesi la TB colpisce prevalentemente le popolazioni vulnerabili come migranti, prigionieri o persone infettate da HIV [16]. Anche in Italia, il quadro epidemiologico è caratterizzato da una bassa incidenza nella popolazione e dalla concentrazione della maggior parte dei casi in alcuni gruppi a rischio, come stranieri provenienti da aree con alta endemia di TB, soggetti immunocompromessi e individui appartenenti ad alcune fasce di età. Nel decennio 2004-2014 sono stati notificati annualmente circa 4300 casi di TB [17].
Il trattamento farmacologico anti-TB ha salvato milioni di vite, tuttavia il fenomeno della farmaco-resistenza rappresentava un ostacolo per il controllo della malattia. I termini MDR (Multi Drug Resistant) e XDR (Extensively Drug Resistant) sono stati introdotti rispettivamente nei primi anni ‘90 e nel 2006 per indicare gli isolati di M. tuberculosis
resistenti ad alcune classi di farmaci anti-TB [18]. Agli MDR-TB appartengono gli isolati resistenti a rifampicina (RIF) e isoniazide (INH), mentre gli XDR-TB comprendono gli isolati che presentano resistenze, oltre ai farmaci suddetti, anche ai fluorochinoloni (FQ) e alcuni farmaci iniettabili [19]. In tutto il mondo, la prevalenza di MDR-TB è pari al 5%, ma tale dato varia tra l'1% in molti paesi dell’Africa sub-sahariana, Europa occidentale e Nord America fino al 20% in aree dell'ex Unione Sovietica (FIGURA 3B). La prevalenza di XDR-TB varia a seconda dell’area geografica e può arrivare anche al 19% dei casi di MDR-TB nei paesi dell’Est Europa [8].
12 2.3 Diagnosi di laboratorio
L’approccio diagnostico per la TB varia sulla base della necessità di rilevare una TB latente o una TB attiva [20]. Per la diagnosi di LTBI sono disponibili due tipologie di test: TST (Tubercolin Skin Test) e IGRA (Interferon-Gamma Releasing Assay). Il test TST, anche chiamato test di intradermoreazione di Mantoux, consiste nell'iniezione intradermica di 5 UI di PPD (Purified Protein Derivative) per valutare l’eventuale sviluppo di una reazione di ipersensibilità ritardata nei soggetti entrati in contatto con il bacillo. La lesione è caratterizzata, inizialmente, da eritema che evolve verso la formazione di una papula indurita. IL test viene considerato positivo se il diametro della zona indurita è >10 mm [21]. Si tratta di un test economico e facile da effettuare, ma presenta vari svantaggi, tra cui un periodo finestra ben definito per la lettura del risultato e un numero elevato sia di falsi positivi che negativi [22]. I test IGRA, introdotti nei primi anni 2000, sono test in vitro effettuati su campioni di sangue che analizzano la risposta immunitaria cellulo-mediata del paziente misurando il rilascio di IFN-γ da parte delle cellule T dopo stimolazione con antigeni ESAT-6 (Early
Secretory Antigen 6) and CFP-10 (Culture Filtrate Protein 10) [23;24]. Questi antigeni sono
più specifici per M. tuberculosis rispetto agli antigeni PPD perché non sono presenti nella formulazione del vaccino BCG e nella maggior parte di specie di micobatteri non tubercolari (ad eccezione di M. marinum, M. kansasii, M. szulgai e M. flavescens) [25].
Per la diagnosi di TB attiva vengono utilizzate quattro differenti metodiche: le tecniche di imaging, la microscopia, i metodi colturali e i test molecolari (TABELLA 1). La diagnosi microbiologica è in grado di fornire certezza o il livello di maggior probabilità diagnostica e costituisce il riferimento cardine per la terapia da applicare (FIGURA 4) [26]. In caso di positività microscopica per batteri alcool acido resistenti (BAAR) può essere effettuato il test di amplificazione genica direttamente sul campione per discriminare in tempi molto rapidi i micobatteri tubercolari dai non tubercolari o da altri microrganismi alcol-acido resistenti. L’osservazione microscopica diretta del singolo campione ha una bassa sensibilità
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(30%-80%) rispetto al metodo colturale, che è invece il gold standard, e dipende dal tipo di campione, dal metodo di rilevamento utilizzato (colorazione di Ziehl-Neelsen, Kinyoun o con aurammina) e dall’esperienza dell’analista. L'esame microscopico è un elemento importante
per la valutazione della contagiosità del paziente, essendo questa direttamente correlata al numero di micobatteri presenti nelle secrezioni polmonari [27].
Gli attuali standard internazionali raccomandano l’utilizzo sia di terreno liquido che di terreno solido per l’isolamento dei micobatteri da campioni biologici. L’esame colturale
richiede tempi abbastanza lunghi ma è molto sensibile. In caso di crescita di micobatteri in coltura, questi devono essere identificati, isolati e poi deve essere eseguito l’antibiogramma. Il tempo medio per la crescita di un isolato di M. tuberculosis in terreno liquido è di circa 7-15 giorni. L’esame colturale sui tradizionali terreni solidi invece necessita 3-6 settimane. Attualmente il sistema di rilevazione dei micobatteri tramite coltura è affidato ad apparecchiature automatizzate idonee alla gestione computerizzata dei dati. È possibile effettuare la ricerca dei micobatteri su tutti i tipi di campioni biologici, incluso il sangue.
L’uso nella diagnosi di TB attiva dei test di amplificazione degli acidi nucleici (NAAT) permette l’identificazione di M. tuberculosis non solo nelle colture positive ma
anche direttamente dai campioni clinici con un anticipo di una o più settimane rispetto all’esame colturale. Sebbene la microscopia per la ricerca di BAAR abbia molte limitazioni, continua ad essere il test primario nei paesi a basso reddito [28;29]. Nel Dicembre 2010, la OMS ha raccomandato l’utilizzo nelle zone endemiche per TB del metodo Xpert MTB/RIF
(Cepheid Inc., Sunnyvale, California, USA), un test molecolare basato sulla tecnologia automatizzata GeneXpert (Cepheid Inc.) che ha cambiato notevolmente il panorama diagnostico [30].
14 2.4 Antibiotici e antibiotico-resistenza nella TB
M. tuberculosis è naturalmente resistente a molti antibiotici comunemente usati nel
trattamento delle infezioni sostenute da batteri Gram-positivi e Gram-negativi ed è sensibile solo a un ristretto numero di farmaci. L'introduzione, più di 70 anni fa, di alcuni farmaci efficaci contro M. tuberculosis ha reso la TB una malattia curabile [31]. Tuttavia la prescrizione inadeguata dei regimi terapeutici ha contribuito allo aumento di isolati MDR e XDR [32;33]. Per ridurre al minimo il rischio di farmaco-resistenza, le terapie anti-TB devono includere almeno quattro antibiotici efficaci e con attività battericida. Il trattamento della TB suscettibile agli antimicobatterici in uso comprende quattro farmaci denominati di “prima linea”: INH, RIF, etambutolo (EMB) e pirazinamide (PZA) [34]. Essi presentano una buona
efficacia in relazione a una tossicità accettabile e vengono comunemente impiegati in pazienti come primo trattamento anti-TB. Una seconda classe di farmaci comprende i farmaci di “seconda linea”, che sono tuttavia più tossici alle dosi battericide. Questi ultimi sono utilizzati
nel trattamento della TB con un profilo di multifarmacoresistenza [35]. Tra i farmaci di seconda linea sono inclusi i FQ, come la ciprofloxacina e l’ofloxacina, alcuni farmaci iniettabili come kanamicina, amikacina, capreomicina e streptomicina (STR) ed infine altri farmaci tra cui etionamide, cicloserina e linezolid [36].
La resistenza ai farmaci antitubercolari deriva principalmente dall’insorgenza di mutazioni all’interno del genoma batterico piuttosto che dall’acquisizione di nuovo materiale
genetico (FIGURA 5) (TABELLA 2). Nel BK, tali mutazioni influenzano fattori di trascrizione, pompe di efflusso e inibitori della sintesi della parete. Si tratta di mutazioni puntiformi risultato dell’aggiunta o della perdita di un nucleotide, oppure della sostituzione di una base nucleotidica con un’altra. Si possono originare in seguito a errori di replicazione del
DNA (10-4-10-5 per replicazione) oppure a causa di agenti mutageni. Le mutazioni puntiformi del DNA producono sempre un cambiamento nella sequenza dell’mRNA, ma non sempre hanno effetti sulla sequenza amminoacidica. Come sopra accennato, nel M. tuberculosis sono
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stati riportati meccanismi di resistenza antibiotica collegati a fenomeni di trasferimento genico orizzontale [37;38]. La probabilità di osservare mutazioni che conferiscono resistenza a più di un farmaco è calcolata come prodotto dei singoli tassi di resistenza ed è pertanto molto bassa. Questo sottolinea come la terapia multi-farmaco riduca la probabilità di selezione di isolati MDR e XDR [33;39;40]. I ceppi resistenti ai farmaci possono essere trasmessi in modo efficace alla popolazione e questa rappresenta la causa principale della diffusione della farmaco-resistenza [37;38].
2.4.1 Isoniazide
L’INH è un farmaco battericida attivo solo sui bacilli in attiva replicazione utilizzato
principalmente per trattare le infezioni causate dalle specie appartenenti al M. tuberculosis complex. La tolleranza di INH da parte dei bacilli non in attiva crescita sembra essere dovuta alla proteina MDP1 (Mycobacterial DNA-Binding Protein 1), che opera come repressore della trascrizione del gene katG [38;41].
INH è un pro-farmaco attivato dalla catalasi perossidasi batterica KatG (codificata dal gene katG) e, nella forma attiva, inibisce la sintesi degli acidi micolici attraverso l’enoil-acil proteina reduttasi NADH-dipendente codificata dal gene inhA [42;43]. Le resistenze più frequenti si verificano a causa di mutazioni che interessano il gene katG, con conseguente perdita di attività della catalasi-perossidasi. La mutazione più frequente si trova a livello del codone 315 (Ser315Thr) e rappresenta circa il 64% del totale delle resistenze a INH. Questa variante conferisce elevati livelli di resistenza ma non elimina completamente l'attività della catalasi batterica [44]. Nel gene katG sono state, inoltre, identificate mutazioni meno frequenti che coinvolgono i codoni 138, 328 e 463 [45-47] (FIGURA 6). In alcuni isolati resistenti, sono state anche riscontrate mutazioni nella regione intergenica furA-katG del promotore di
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Le mutazioni nel gene inhA hanno una frequenza che varia dal 12 al 42%. Quando interessano la regione del promotore, si traducono generalmente in un’iperespressione del bersaglio, mentre se si verificano a livello della regione codificante si traducono in una ridotta affinità di legame al target. Le sostituzioni più comuni sono -15 CT, -9 TA e -8 TC e conferiscono una resistenza a basso livello in quanto i valori di MIC sono molto vicini al
breakpoint delle concentrazioni critiche impiegate nei test diagnostici fenotipici [39;50]. Le
sostituzioni che riguardano katG e inhA comprendono l'80-90% delle resistenze all'INH. Una piccola percentuale di ceppi INH-resistenti a basso livello non hanno mutazioni nei geni katG o inhA [51;52]. Sono state identificate altre mutazioni coinvolte nella INH-resistenza in geni coinvolti nel metabolismo di INH quali ndh, ahpC, oxyR, mshA, furA [42;44;50;53]. Un’altra ipotesi per coprire il rimanente 10-20% di isolati INH-resistenti potrebbe ricercarsi nel fenomeno dell’eteroresistenza. In alcuni casi infatti, l’isolamento dei singoli cloni mostra la
presenza sia di batteri resistenti a causa di mutazioni nel gene katG sia cellule wild-type sensibili a INH [42].
2.4.2 Rifampicina
La RIF è il farmaco battericida più potente contro M. tuberculosis. La RIF lega la subunità β della RNA polimerasi e inibisce la trascrizione [42;50]. Le mutazioni in una
regione di 81 bp nel gene rpoB sono responsabili di oltre il 96% dei casi RIF-resistenza. Questo gene quindi rappresenta un bersaglio ideale per lo sviluppo di test molecolari (FIGURA 7) [42;54]. La resistenza alla RIF è considerata un marker di TB-MDR, in quanto più del 90% degli isolati resistenti a tale farmaco sono resistenti anche all’INH. Le tecniche che utilizzano l’amplificazione del DNA per rilevare la RIF-resistenza rappresentano dunque
strumenti di rilevante utilità clinica e con un buon rapporto costo-efficacia in gruppi a rischio di sviluppo di TB-MDR. Esse permettono infatti di identificare precocemente quei pazienti a rischio di fallimento terapeutico con i farmaci di I linea. Le diverse sostituzioni
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amminoacidiche determinano livelli di resistenza diversi, anche se generalmente tutte sono collegate a fallimento terapeutico [44]. Le mutazioni più frequenti interessano i codoni 531 e 526 con una frequenza rispettivamente pari al 40-65% e 10-40%. La sostituzione Ser531Leu coinvolge il 50% degli isolati resistenti, a cui a questa si aggiungono le mutazioni His526Asp, His526Arg e His526Tyr come varianti in grado di conferire resistenza ad alte concentrazioni [42;44]. Altre mutazioni nel gene rpoB interessano i codoni 509, 511, 513, 515, 516, 522, 526, 531, 533, 535 e, in particolare le sostituzioni Leu511Pro, Asp516Tyr, His526Asn, His526Leu e Leu533Pro potrebbero rappresentare oltre il 10% delle altre mutazioni coinvolte nella RIF-resistenza [55]. Alcune mutazioni sono state identificate al di fuori della suddetta
hot region, suggerendo quindi la necessità di osservare tutta la regione codificante rpoB in
modo da fare un'analisi completa della resistenza molecolare alla RIF [55-57]. Le mutazioni nel gene rpoB generalmente conferiscono cross-resistenza anche alle altre rifamicine [42;50].
2.4.3 Etambutolo
EMB è un farmaco battericida che interferisce con la biosintesi dell’arabinogalattano della parete del micobatterio [58]. In particolare, il bersaglio di questo farmaco è l’arabinosil-transferasi codificata dal gene embB e coinvolta nella sintesi dell’arabinogalattano [59]. Le mutazioni nell'operone embCAB, in particolare embB, sono responsabili della resistenza a EMB (FIGURA 8). La mutazione più frequente negli isolati clinici resistenti a questo farmaco avviene a livello del codone 306 e rappresenta fino al 68% dei ceppi EMB-resistenti [60;61]. Sono state rilevate mutazioni anche in tre codoni aggiuntivi: Phe285Leu, Phe330Val e Thr630Ile. La MIC per i ceppi che presentano le sostituzioni Met306Leu, Met306Val, Phe330Val e Thr[38]630Ile sono generalmente più alte rispetto a quelle degli isolati con la sostituzione Met306Ile [60].
Altre sostituzioni amminoacidiche hanno invece effetto minore sulla resistenza [62]. Tuttavia, poiché circa il 35% degli isolati resistenti a EMB non hanno mutazioni nel gene
18 embB [59], esistono altri meccanismi di resistenza. Le mutazioni nel gene ubiA, che codifica
per la decaprenil-5fosfato-fosforibosiltransferasi (DPPR-sintasi) coinvolta nella sintesi della parete cellulare, sono state recentemente riportate come causa di EMB-resistenza. La loro rilevanza nell’EMB-resistenza sembra essere paragonabile a quella delle mutazioni a livello
del gene embB [62].
2.4.4 Pirazinamide
La pirazinamide è un analogo strutturale della nicotinamide e ha un'alta attività battericida su batteri persistenti non in attiva replicazione che risiedono in ambienti acidi. Il farmaco viene convertito nella sua forma attiva, l'acido pirazinico, dalla pirazinamidasi codificata dal gene pncA. Il farmaco attivato interferisce con la produzione di energia della membrana, inibendo sia la proteina ribosomiale S1 (Rpsa) codificata dal gene rpsA e coinvolta nella traduzione, sia PanD, codificata da panD e coinvolta nella sintesi del pantotenato e del coenzima A [42;50;63]. Le mutazioni che interessano il promotore e la regione codificante del gene pncA rappresentano il meccanismo principale della PZA-resistenza e hanno una frequenza pari al 72-98%. Pertanto questo gene rappresenta un ottimo
marker molecolare in grado di coprire la maggior parte degli isolati PZA-resistenti. Le
mutazioni nel gene pncA sono disperse in tutto il gene, inclusa la regione del promotore. Le mutazioni di solito consistono in SNP (Single Nucleotide Polymorphism), inserzioni e delezioni che causano l’inattivazione della pirazinamidasi [42;63]. Più di 400 SNP sono stati descritti in 78 studi pubblicati (FIGURA 9) [63]. La perdita dell’attività enzimatica è associata a mutazioni che si trovano in tutto il gene[63]. Le mutazioni possono interessare anche i geni rpsA e panD, ma il loro effettivo contributo in termini di frequenza non è ancora chiaro [42;50]. Oltre alle suddette mutazioni, sono stati descritti casi di resistenza alla PZA associati all’inserimento delle sequenze d’inserzione IS6110 all'interno del gene pncA [64].
19
colturale possono portare all’identificazione di falsi resistenti [42]. Pertanto è necessario implementare la rilevazione molecolare della resistenza alla pirazinamide.
2.4.5 Farmaci di seconda linea
Mutazioni associate alla resistenza alla STR sono state identificate nell’ rRNA 16S (gene rrs) e nel gene rpsL, che codifica per la proteina ribosomiale S12 [65]. Cambiamenti in un singolo nucleotide possono portare a STR-resistenza. Mutazioni puntiformi nel gene rrs sono raggruppate in due regioni corrispondenti ai codoni 530 e 915. Tuttavia, la maggior parte delle mutazioni puntiformi che causano resistenza alla STR si verificano nel gene rpsL e interessano il codone 43 (LysArg e meno frequentemente LysThr) [45;66].
Come per gli altri farmaci, anche per i fluorochinoloni è stata osservata una rapida selezione di resistenze soprattutto a causa del loro utilizzo come monoterapia o anche in associazione ad un solo altro farmaco [67]. I FQ inibiscono la DNA girasi. Le principali mutazioni associate a questa resistenza interessano una regione ristretta, di circa 120 pb, del gene gyrA che codifica per la girasi A. Mutazioni in questa regione sono coinvolte nella resistenza ai fluorochinoloni nel 70-80% dei ceppi di M. tuberculosis FQ-resistenti [67;68]. In un numero limitato di casi sono state osservate mutazioni anche nel gene gyrB [69]. Un altro possibile meccanismo di resistenza ai fluorochinoloni sembra essere dovuto alla proteina MfpA (codificata dal gene mfpA), antagonista competitivo del farmaco per il sito di legame sulla DNA girasi [67].
La classe dei farmaci iniettabili comprendono gli inibitori della sintesi proteica kanamicina, amikacina, capreomicina e viomicina. È stata osservata cross-resistenza tra amikacina e kanamicina [70]. L’identificazione di una mutazione specifica, conferente resistenza a un particolare aminoglicoside, permette pertanto di prevedere la cross-resistenza a altri farmaci della stessa classe e di scegliere di conseguenza quello più appropriato per il trattamento [71].
20
L’etionamide (ETH) è un derivato dell'acido isonicotinico, strutturalmente omologo
all’INH con cui condivide lo stesso bersaglio ma un diverso meccanismo di attivazione [42;50]. Questo farmaco può essere quindi considerato un'alternativa all'INH nei casi di MDR-TB. Solo pochi studi hanno osservato la presenza di mutazioni nei geni ethA-ethR legati alla resistenza di ETH [72-74]. L’iperproduzione della proteina EthA, regolata dal repressore trascrizionale EthR, conferisce maggiore suscettibilità al farmaco, mentre l’iperproduzione di EthR è correlata a ETH-resistenza [74]. ETH, una volta attivato dall’enzima EthA, interferisce con la sintesi degli acidi micolici attraverso l’enoil-acil proteina reduttasi NADH-dipendente
[42;50;74]. Uno studio ha rilevato che la presenza di una mutazione nella regione codificante del gene inhA e una nel suo sito regolatore produce oltre a una INH-resistenza ad alto livello anche cross-resistenza all'etionamide [47].
2.5 Analisi delle chemioresistenze 2.5.1 Antibiogramma colturale
I metodi colturali sono universalmente considerati il sistema di riferimento (gold
standard) per la determinazione della suscettibilità ai farmaci antimicobatterici. I metodi
tradizionali sono basati sull’analisi fenotipica dell’isolato clinico e prevedono quindi la
coltura del ceppo in esame in terreno solido o liquido in presenza dei singoli farmaci.
I sistemi più frequentemente impiegati nei laboratori di micobatteriologia sono basati sull’osservazione sperimentale che in presenza di una percentuale di bacilli resistenti ≥ 1% (≥
10% per la PZA), il trattamento farmacologico non sarà efficace [75]. Il primo sistema utilizzato è stato il metodo delle proporzioni su piastra che prevede la semina di una sospensione dell’isolato in esame su piastre Petri suddivise in quadranti. Un quadrante della piastra contiene il terreno senza farmaco e gli altri tre contengono terreno con i singoli antibiotici da saggiare in concentrazioni definite “critiche”. L’osservazione della crescita nei settori contenenti l’antibiotico è indice di resistenza al farmaco specifico e il confronto tra il
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numero di colonie presenti nei quadranti con i farmaci rispetto al quadrante di controllo senza farmaco (inoculato con una sospensione batterica 100 volte più diluita), permette di valutare per ogni farmaco se la percentuale di batteri resistenti è maggiore o minore dell’1%[76].
Un altro metodo è il sistema Bactec (Beckton Dickinson, Milano, Italia) che si basa sul rilevamento di CO2 radiomarcata liberata dall’attività metabolica del micobatterio che cresce
in un terreno liquido contenente come unica fonte di carbonio acido palmitico marcato con C14 [77]. La produzione di CO2 radioattiva nell’aria contenuta nel flacone di coltura è indice
di moltiplicazione batterica. Il valore della radioattività misurata viene espresso come Indice di Crescita (GI). Per l’effettuazione dell’antibiogramma, l’isolato viene inoculato in una serie di flaconi contenenti i singoli antibiotici e in un flacone di controllo, senza farmaco. L’inoculo
del controllo viene eseguito con una sospensione batterica 100 volte più diluita secondo il principio delle proporzioni sopra descritto. Il test di sensibilità tramite sistema radiometrico prevede la lettura giornaliera dei flaconi fino a quando il controllo non raggiunge un GI > 30.
Il sistema maggiormente in uso nei laboratori è il sistema automatico BACTEC MGIT 960 (BD). Tale sistema è validato dalla F.D.A. e venduto in Europa con il marchio CE per l’esecuzione del test di sensibilità qualitativo nei confronti di M. tuberculosis complex per i
farmaci di prima linea. Il sistema usa un algoritmo, basato sul principio del metodo delle proporzioni, per comparare le cinetiche di crescita in assenza e in presenza di farmaco e per interpretarle in termini di sensibilità e di resistenza (vedi pag. 29).
Un altro sistema è rappresentato dal VersaTREK (TREK Diagnostic Systems, UK) anch’esso validato dalla F.D.A. e commercializzato in Europa con il marchio CE per l’esecuzione del test di sensibilità qualitativo sui ceppi del M. tuberculosis complex per INH,
RIF ed EMB. La tecnologia di rivelazione della crescita è basata sul monitoraggio continuo della pressione all’interno dei flaconi dovuta alla produzione di gas.
Il limite principale di tali tecniche è tuttavia rappresentato dalle lunghe tempistiche. Poiché M. tuberculosis è un microrganismo a crescita lenta, il tempo medio necessario per la
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refertazione è di 3-5 settimane. Considerando il tempo necessario per ottenere l’isolato a partire da una coltura pura (3-5 settimane), il risultato dell’antimicobatteriogramma può non essere disponibile prima di 6-10 settimane dall’invio del campione al laboratorio. Questo percorso diagnostico può portare a ritardi nella rilevazione della farmaco-resistenza e quindi nella scelta terapeutica[78].
2.5.2 Antibiogramma molecolare
L'identificazione mediante sequenziamento delle mutazioni genetiche responsabili di fenotipi resistenti ha consentito di sviluppare diverse tecniche molecolari per la rilevazione della resistenza ai farmici di prima e seconda linea [34;79]. Questi approcci molecolari hanno permesso di ridurre in maniera significativa i tempi di refertazione (fino a 1-2 giorni), di aumentare la sensibilità e la specificità, ridurre il livello di biosicurezza e il grado di specializzazione del personale tecnico-sanitario [40].
2.5.3 Test molecolari approvati dalla OMS
Xpert MTB/RIF (Chepheid Inc, Milano, Italia) è un test automatizzato di
amplificazione di acidi nucleici (NAAT) che permette non solo un’identificazione di specie (M. tuberculosis complex) ma anche il profilo genotipico di RIF-resistenza. Nel dicembre 2010 la OMS ha approvato il suo utilizzo nei paesi con TB endemica come l’Africa centromeridionale e nel 2014 ha consigliato il suo utilizzo anche in zone a bassa prevalenza. Oggi il test è utilizzabile per la diagnosi delle TB polmonari, pediatriche extrapolmonari e RIF-resistenti. Questo strumento si basa sul sistema GeneXpert, che purifica e concentra i bacilli di M. tuberculosis in campioni del distretto respiratorio, isola il materiale genetico previo trattamento con ultrasuoni e successivamente amplifica il DNA genomico mediante
23 Beacon. La sensibilità e la specificità di GeneXpert sono rispettivamente pari al 95% e 98%
per la rilevazione della resistenza a RIF [30;40].
Una delle tecnologie più utilizzate è la Line Probe Assay (LiPA) grazie alla sua semplicità d’uso e di interpretazione. I test LiPA si basano sull’ibridazione inversa di
amplificati a sonde legate su un supporto di nitrocellulosa. I prodotti, che sono il risultato di una PCR multiplex, vengono denaturati, marcati con biotina e infine ibridati alle sonde legate al supporto. L’avvenuta ibridazione è rilevata da una reazione colorimetrica dovuta alla
formazione di un composto giallo (P-nitrofenolo) ad opera della fosfatasi alcalina (coniugata a streptavidina). Le sonde coprono sequenze parzialmente sovrapposte nelle regioni d’interesse e sono costruite sia sulla sequenza del ceppo selvaggio che su quelle degli isolati mutanti epidemiologicamente prevalenti. La presenza di tali mutazioni è indicata dall’assenza di
ibridazione alle sonde wild-type e, al contrario, dalla presenza di ibridazione a una o più sonde mutate. Tra i test commerciali in uso ricordiamo INNO-LiPA Rif.TB (Innogenetics, Milano, Italia) e GenoType MTBDRplus (Hain Lifescience, Nehren, Germania). INNO-LiPA identifica le mutazioni più frequenti nella hot region di rpoB. Sui ceppi isolati da coltura, il test ha una sensibilità del 95-100% e una specificità del 100%, mentre la sensibilità è inferiore se saggiata direttamente sui campioni biologici. GenoType, oltre alle mutazioni più frequenti nel gene
rpoB, identifica anche quelle presenti nei geni katG e inhA che conferiscono INH-resistenza.
In questo caso le percentuali di sensibilità e specificità per RIF sono pari al 98%, mentre la sensibilità e la specificità per INH sono rispettivamente pari al 80-90% e 99% [30;77;80]. Infine, il test Genotype MTBDRsl permette l’analisi della resistenza ai farmaci di seconda linea sia sulla coltura che su campioni biologici [77].
2.5.4 Altri approcci molecolari
È possibile utilizzare anche sistemi molecolari in-house per la ricerca di mutazioni note associate a farmaco-resistenza in M. tuberculosis. Tra i metodi più utilizzati vi è
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sicuramente la PCR Real-Time. Tale tecnica si basa sul principio che la concentrazione di
target presente nel campione è inversamente proporzionale al numero di cicli necessari per il
rilevamento del segnale fluorescente soglia, definito CT (threshold cycle). Poiché il CT viene
determinato durante la fase esponenziale di amplificazione, il risultato è disponibile in tempi minori rispetto a quelli ottenibili in end-point tramite la PCR tradizionale.
Sono stati sviluppati molti metodi per il rilevamento dell’amplificato tramite approcci sia qualitativi che quantitativi. L’amplificato può essere rilevato tramite sonde bersaglio-specifiche marcate con fluorofori in modo che il segnale venga prodotto solo se la sonda è ibridizzata con la sequenza target. Le tipologie di sonda maggiormente in uso sono le sonde TaqMan, le sonde FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) e le Molecular Beacon. La sonda TaqMan è un corto oligonucleotide di DNA che contiene un fluorocromo in posizione 5’ e un quencher in posizione 3’. Tale oligonucleotide si lega al bersaglio, ma il
segnale fluorescente compare solo quando la polimerasi, presente nel mezzo di reazione e dotata di attività esonucleasica, provoca l’idrolisi della sonda separando fluorocromo e
quencher e permettendo così l’emissione di fluorescenza. Le FRET sono, invece, due sonde di
DNA realizzate in maniera tale da ibridizzare con la sequenza bersaglio rimanendo separate da un breve spazio di interposizione. La sonda a monte è legata alla estremità 3’ con un fluoroforo donatore, mentre la sonda a valle è legata alla estremità 5’ con un fluoroforo accettore. In presenza del gene target, l’ibridazione delle due sonde permette l’avvicinamento dell’estremità 5’ del donatore all’estremità 3’ dell’accettore in modo da indurre l’accettore a
emettere un segnale fluorescente [78]. I metodi molecolari sono poco sensibili nell’identificare popolazioni batteriche costituite sia dal tipo selvatico che dal tipo mutato, in
quanto non determinano la proporzione di batteri resistenti al farmaco come invece è possibile utilizzando il test fenotipico [40]. Uno studio effettuato nell’ambito del progetto europeo LONG DRUG poneva come obiettivo lo studio di metodi di identificazione di SNP conferenti farmaco-resistenza in presenza di alleli selvaggi in campioni di DNA eterogenei.
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L’identificazione è stata eseguita tramite PCR Real-Time con sonde Molecular Beacon,
TaqMan e FRET per il rilevamento di SNP conferenti resistenza in presenza dell'allele
wild-type e mutato nei geni rpoB e katG con il risultato di una migliore sensibilità e specificità
delle sonde FRET rispetto agli altri metodi [81].
Un altro metodo molecolare di PCR Real-Time richiede invece l’utilizzo di fluorofori come il SYBR green che si intercalano al DNA a doppia elica. Questa tipologia di fluorocromi, tuttavia, rileva prodotti di PCR sia specifici che aspecifici. A miglioramento di tale tecnica viene utilizzata la High Resolution Melting (HRM) Real-Time PCR, che è un metodo semplice, conveniente e con una buona sensibilità e specificità [82]. La HRM
Real-Time PCR non richiede l'uso di sonde fluorescenti costose e fasi di elaborazione post-PCR e
pertanto rappresenta un valido metodo genotipico alternativo per analizzare la suscettibilità ai farmaci tubercolari [83]. Prende origine dal metodo tradizionale di PCR Real-Time che utilizza il SYBR Green e permette di ottenere una curva di melting a bassa risoluzione con incrementi di temperatura di circa 0,5°C. Il profilo della curva dipende dalla lunghezza del frammento amplificato e dal contenuto in GC. Il punto di massimo decremento della fluorescenza avviene in corrispondenza della temperatura di melting (Tm) del campione. La
Tm è definita come la temperatura in cui il 50% della molecola di DNA si trova nella forma a
doppia elica e il restante 50% è sotto forma di singola elica di DNA. La Tm è più alta per
frammenti più lunghi e con contenuto in GC più alto. Il principio dell’HRM Real-Time PCR è lo stesso della PCR Real-Time con SYBR Green ad eccezione che l’incremento di temperatura durante la fase di melting è di 0,008-0,2°C. Da ciò ne consegue una migliore risoluzione della curva di melting grazie anche all’utilizzo di nuovi fluorofori intercalanti la doppia elica. Il
SYBR Green è infatti un fluoroforo non saturante che può staccarsi dalla doppia elica e
intercalarsi nelle regioni di DNA in cui i filamenti sono ancora appaiati.
Nella tecnica di HRM Real-Time PCR sono invece utilizzati fluorofori saturanti o
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denaturazione ottenendo in fase di melting una riduzione di fluorescenza in maniera costante. Questa caratteristica fornisce maggiore sensibilità nell'analisi della curva di melting. Il metodo prevede due fasi. Nella prima fase viene eseguita una PCR che amplifica la regione d’interesse in presenza di un fluoroforo che lega il DNA a doppio filamento. Questo
particolare fluoroforo è altamente fluorescente quando si lega al dsDNA mentre è debolmente fluorescente quando non è legato. La seconda fase consiste nella graduale denaturazione del dsDNA attraverso l’aumento della temperatura di reazione con piccoli incrementi che
delineano uno specifico profilo di melting. L’analisi della curva di melting monitorata in tempo reale permette di definire il profilo caratteristico della regione amplificata (FIGURA 10) [83]. Confrontando il profilo di melting del campione in esame con un controllo di riferimento, è possibile rilevare la presenza di qualsiasi mutazione all’interno della regione
amplificata. Gli homoduplex solitamente sono correlati a una variazione della Tm, mentre gli heteroduplex corrispondono a variazioni dell’ampiezza della curva. A differenza di altri
metodi molecolari, HRM Real-Time PCR offre il vantaggio di rilevare qualsiasi mutazione nella sequenza amplificata del gene bersaglio [84].
La metodica da utilizzare per la ricerca di mutazioni meno frequenti è sicuramente il sequenziamento dei geni associati alla farmaco-resistenza. Il sequenziamento permette di identificare tutte le mutazioni presenti nel gene d’interesse, incluse quelle non ancora descritte
in letteratura. Tuttavia questo tipo di analisi presuppone la disponibilità di attrezzature specifiche e personale specializzato; inoltre determinare la sequenza nucleotidica di geni diversi richiede tempi di esecuzione lunghi e costi elevati.
L’approccio definitivo consiste nel sequenziamento dell’intero genoma di MTB. Tale
metodica offre una potente alternativa per la rilevazione di TB resistente e favorisce una rapida e accurata determinazione di tutte le mutazioni clinicamente rilevanti [40;85].
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3. SCOPO DELLA TESI
Mycobacterium tuberculosis è l’agente eziologico della tubercolosi. La terapia antibiotica ha
salvato milioni di vite, tuttavia, il crescente numero di isolati resistenti a uno o più farmaci rappresenta un grosso ostacolo per il controllo della malattia a livello globale. I metodi colturali sono universalmente considerati il gold standard per la determinazione dell’antimicobatteriogramma. L'uso dei test fenotipici è ostacolato dalla lenta crescita del
microorganismo che comporta ritardi per l’inizio di una terapia mirata. L'identificazione mediante sequenziamento delle mutazioni genetiche associate a fenotipi resistenti ha consentito di sviluppare diverse tecniche molecolari per la rilevazione della resistenza ai farmaci di prima e seconda linea con tempi di risposta molto ridotti.
Lo scopo di questo lavoro di tesi è quello di sviluppare e validare un pannello diagnostico tramite la tecnologia della High Resolution Melting Real-Time PCR (HRM) in modo da identificare e caratterizzare le resistenze a farmaci di prima linea in isolati clinici di
M. tuberculosis. A tal fine, sono stati raccolti e selezionati 74 isolati risultati fenotipicamente
resistenti ad almeno uno dei farmaci di prima linea quali rifampicina, isoniazide, etambutolo e pirazinamide. Nella prima parte della tesi è descritto il metodo di analisi del profilo di resistenza fenotipica dei campioni analizzati attraverso il sistema automatico “Bactec MGIT 960”. Nella seconda parte della tesi, è stato analizzato il profilo di suscettibilità ai farmaci di
prima linea dei campioni in esame attraverso due differenti metodi molecolari. Il primo metodo consiste nel sequenziamento delle regioni dove sono presenti, in accordo con la letteratura, le mutazioni più diffuse associate alla farmaco-resistenza. Il secondo metodo consiste invece nella identificazione e analisi di mutazioni note associate a farmaco-resistenza degli isolati clinici in esame tramite HRM. Infine, il saggio HRM è stato validato attraverso
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l’analisi di parametri intra-test (efficienza, limite di rilevazione) e inter-test (sensibilità e
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4. MATERIALI E METODI
4.1 Campioni
Il presente lavoro di tesi si è basato su un totale di 74 isolati clinici di M. tuberculosis, di cui 54 sono risultati fenotipicamente resistenti ad almeno uno dei farmaci di prima linea quali INH, RIF, EMB e PZA, mentre 17 erano invece suscettibili ai suddetti farmaci e sono stati utilizzati come controllo. Cinquantacinque ceppi provenivano dal progetto europeo “LONG DRUG” (Longitudinal study on drug resistance development, contratto N°
QLK-CT-2002-01612) che aveva come obbiettivo la caratterizzazione molecolare delle farmaco-resistenze in isolati di M. tuberculosis provenienti da aree geografiche europee ad alta prevalenza di tubercolosi. Quattordici isolati con referto positivo per M. tuberculosis e resistenti ad almeno un farmaco di prima linea sono stati invece selezionati tra i campioni pervenuti presso l’U.O.C. “Batteriologia” dell’A.O.U.S. Policlinico Le Scotte di Siena tra il
2012 e il 2016. Inoltre, in questo lavoro di tesi sono stati inseriti 5 isolati pirazinamide-resistenti provenienti dal Centro di Riferimento Regionale per la diagnosi deli micobatteri presso il laboratorio di Microbiologia e Virologia dell’A.O.U.C. Careggi di Firenze nel
biennio 2015-2016.
4.2 Analisi delle chemioresistenze 4.2.1 Antibiogramma colturale
L’analisi del profilo di resistenza fenotipica dei campioni analizzati è stata effettuata attraverso il sistema automatico “Bactec MGIT 960” (Mycobacterial Growth Indicator Tube)
(Becton Dickinson, Milano, Italia). Il sistema MGIT utilizza una provetta di plastica con tappo a vite contenente 7 ml di brodo 7H9 (MGIT™ 960 - Tubes 7 ml) per S, INH, RIF e EMB. Il test per PZA prevede invece l'impiego di un tubo MGIT specifico a pH 5.9 (MGIT™
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960 PZA Medium, Becton Dickinson). Alla base del tubo è adeso, in un film di silicone, un sale metallico di rutenio che è fluorescente e sensibile alle variazioni della concentrazione di O2. L’elevato contenuto iniziale di O2 nella provetta inattiva la fluorescenza, ma il suo
consumo da parte dai micobatteri durante la crescita determina la comparsa di una fluorescenza arancio quando la provetta viene esposta a raggi ultravioletti. Lo strumento utilizza un algoritmo basato sul principio del metodo delle proporzioni [26]. Esso compara le cinetiche di crescita in assenza e in presenza di farmaco e interpreta tali risultati in termini di sensibilità o resistenza. Le istruzioni operative riportate sul kit sono in accordo con il manuale M24-A2 Susceptibility testing of mycobacteria, nocardiae, and other aerobic actinomycetes
approved standard [86]. Lo strumento è impostato per saggiare la sensibilità degli isolati di M. tuberculosis ai farmaci S, INH, RIF ed EMB [S 1,0 μg/ml, INH 0,1 μg/ml, RIF 1,0 μg/ml,
EMB 5,0 μg/ml (AST SIRE Test Kit, BD)] e PZA (100 μg/ml; AST Pyrazinamide Test Kit,
BD) a concentrazione critica. Nel caso in cui i ceppi siano risultati resistenti a INH, EMB e/o S è stato eseguito un secondo test utilizzando i suddetti farmaci a concentrazioni più elevate (INH 0,4 μg/ml, EMB 7,5 μg/ml, S 4,0 μg/ml) in accordo con le istruzioni del kit. È stato
utilizzato un tubo MGIT per ciascun antibiotico e un tubo come controllo positivo di crescita in assenza di antibiotico. Il tubo conteneva 0,8 ml di supplemento OADC (Oleic Acid
Dextrose Catalase, BD), 0,1 ml di antibiotico e 0,5 ml della coltura in terreno liquido positiva
per M. tuberculosis da 1-2 giorni. Il tubo di controllo, oltre al supplemento era privo di antibiotico e conteneva 0,5 ml della diluizione 1/100 della coltura batterica. I campioni sono stati incubati nel Bactect MGIT 960.
I risultati dell'antibiogramma, disponibili dopo 1-3 settimane a seconda del farmaco in esame, sono stati visualizzati tramite un programma che riporta le concentrazioni usate, i valori di crescita in unità (GU, Growth Unit) e il profilo di suscettibilità (S) o resistenza (R).
31 4.2.2 Preparazione dei campioni per le analisi molecolari
Tutte le analisi molecolari sono state effettuate su lisati batterici. Per la validazione del saggio HRM Real-Time PCR sono invece usati campioni di DNA estratto da colture batteriche. In entrambi i casi è stata utilizzata un’aliquota di 100µl di ciascun isolato cresciuto
su Middlebrook 7H11 agar (Becton Dickinson) e inattivata per 20 min a 85°C prima della lisi batterica. I campioni lisati sono stati ottenuti seguendo il protocollo di lisi meccanica previa centrifugazione per 5 min a 15300 x g ed eliminazione del surnatante. Il pellet è stato poi risospeso in 100 µl di TE 1x [10 mM Tris pH 8.0, 1 mM EDTA (TE Elution Buffer, Roche, Germania)] e trasferito in una nuova eppendorf contenente 40 mg di biglie di vetro (Sigma-Aldrich, USA). Le provette sono state poi sottoposte a lisi meccanica per 2 min a 30 Hz per un totale di 2 cicli utilizzando l’apparecchio Tissue Lyser (Qiagen, Retsch, Germania). I
campioni sono stati poi centrifugati per 5 min a 2150x g e il sovranatante è stato trasferito in una nuova eppendorf e conservato a -20°C fino al momento dell’uso.
Il DNA è stato estratto tramite lo strumento MagNA Pure LC© (Roche Diagnostics GmbH, Giappone), utilizzando il kit MagNA Pure LC DNA Isolation Kit III (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germania). Per ciascun campione, sono stati utilizzati 100 µl di lisato batterico che sono stati aggiunti a 130 µl di Bacterial Lysis Buffer (Roche Diagnostics GmbH) e 20 µl di proteinasi K (0,1 mg/ml). I campioni sono stati poi incubati per 10 min a 65°C, 10 min a 95°C e infine sottoposti a estrazione del DNA tramite lo strumento suddetto. La concentrazione del DNA di ciascun campione è stata determinata con il metodo fluorimetrico Quant-iT™ PicoGreen (Invitrogen, Milano, Italia). Tale metodo usa un colorante fluorescente che misura la quantità di DNA a doppio filamento (dsDNA) presente in un campione alla lunghezza d’onda di 260 nm.
32 4.2.3 Antibiogramma tramite sequenziamento
L’analisi del profilo di suscettibilità ai farmaci attraverso sequenziamento è stata
eseguita su specifiche sequenze di DNA amplificate tramite PCR tradizionale a partire dai lisati batterici degli isolati di questo lavoro di tesi. Tali sequenze contengono le regioni dove sono state riscontrate le mutazioni più diffuse che conferiscono farmaco-resistenza, in particolare nei geni rpoB per RIF, katG e la regione del promotore di inhA per INH, embB per EMB e pncA per PZA. La mix di reazione aveva un volume finale di 25 µl di cui 2 µl di lisato batterico, 2,5 µl di tampone (10x Buffer for Dynazyme DNA Polymerase, Finnzymes, Milano, Italia), 1,5 µl di dNTPs 0,125 mM (EuroClone, Italia), 0,4 µl di DNA polimerasi (Finnenzymes), 2,5 µl di tartrazina (10x), 1 pmol di ciascun primer (TABELLA 3) e H2O fino
a 25 µl. I programmi di amplificazione utilizzati erano stati diversi per ogni analisi di farmaco-resistenza (TABELLA 4). Il prodotto dell’amplificazione della PCR è stato successivamente analizzato tramite elettroforesi su gel di agarosio 1,5% in TAE 1x (40 mM Tris pH 7.6, 20 mM di CH3COOH, 1 mM EDTA). Il prodotto della PCR è stato inviato alla
ditta GATC European Custom Sequencing Centre (Köln, Germania) per il sequenziamento tramite metodo Sanger [87]. I cromatogrammi ottenuti per ciascun campione sono stati analizzati tramite il programma BioEdit Sequence Alignment, verificati con NucleotideBlast (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov) e infine confrontati con la sequenza del ceppo selvaggio di riferimento H37Rv, utilizzando il programma Clustal Omega (http://www.ebi.ac.uk) (FIGURA 11).
4.2.4 Antibiogramma tramite High Resolution Melting (HRM) Real-Time PCR
I campioni sono stati saggiati tramite PCR Real-Time per poter determinare le curve di
melting. Le reazioni di PCR sono state effettuate in un volume finale di 20 µl contenente: 2 µl
33 Resolight (LightCycler480 High Resolution Melting Master Kit, Roche, Svizzera), 2 µl di
MgCl2, 1 µl di ciascun primer (TABELLA 5) e H2O fino a 20 µl. La mix è stata poi
distribuita in piastre da 96 pozzetti, che sono state inserite nel termociclatore LightCycler480 (Roche, Germania). Il programma di amplificazione prevedeva una fase di riscaldamento per 10 min a 95°C, seguito da 40 cicli di 10 sec a 95°C, 20 sec a 64°C e 20 sec a 72°C. Nella seconda fase è stata invece generata la curva di melting attraverso un programma di denaturazione graduale a 95°C per 1 min, seguito da raffreddamento a 40°C per 1 min e un ulteriore riscaldamento da 70° a 95°C ad una velocità di 25 acquisizioni/°C [84].
I dati derivati dalle curve di melting sono stati esportati in un file .txt che conteneva i valori di temperatura associati a quelli di fluorescenza per ogni singolo campione saggiato. Il file è stato inserito nel software di analisi programmato tramite linguaggio PythonTM (https://www.python.org/) secondo le operazioni matematiche descritte da Wittwer et al. [82]. I dati HRM raccolti presentavano un range di letture di fluorescenza iniziali (pre-melting) e finali (post-melting). Tali variazioni sono state eliminate per allineare e normalizzare i dati. Pertanto è stato analizzato solo l’intervallo di temperature compreso tra pre- e post-melting. Il
software consentiva inoltre di calcolare la differenza grafica derivata dai dati normalizzati. Questo è stato ottenuto sottraendo i dati di fluorescenza normalizzati del genotipo wild-type di controllo da quelli di ciascuno degli altri campioni esaminati. La posizione della curva di ciascun campione rispetto alla linea di base permetteva la distinzione dei campioni mutanti rispetto a quelli wild-type (FIGURA 12).
4.2.5 Analisi statistica e validazione del saggio HRM Real-Time PCR
Il saggio di HRM Real-Time PCR è stato validato secondo i parametri di valutazione intra- e inter-test [88]. Per effettuare i test di validazione è stato utilizzato il DNA proveniente da isolati che presentavano le mutazioni rilevate tramite sequenziamento in questo lavoro di tesi.
