Progettazione saggio Real-Time PCR

I primer e le sonde per qPCR per i target mitocondriali e il controllo positivo interno (IPC) sono stati tratti dalla letteratura [7-20-57]. I primer e le sonde per i target nucleari sono stati progettati ex novo per questo studio. Nel saggio sono presenti due diverse sonde che amplificano due frammenti di lunghezza differente del mtDNA.

Il target mitocondriale corto è lungo 69bp e si localizza all’interno del gene MT-ND1 che codifica per la proteina NADH-ubichinone ossidoreduttasi catena 1. Questo gene, che all’interno del DNA mitocondriale si trova in posizione 3307-4263, produce una proteina composta da 318 aminoacidi. La subunità ND-1 fa parte del dominio idrofobico del Complesso I, immerso nella membrana mitocondriale interna ed è costituito da sette subunità (ND1-6 e 4L). Le subunità ND1 e ND2 sono comprese nel subcomplesso alfa che si trova nell’interfaccia tra il dominio idrofilico e il dominio idrofobico.

Il target mitocondriale lungo è costituito da 143bp e si localizza sul gene Mt-ATP8 che codifica per una subunità di ATP sintasi mitocondriale. Questo gene si trova nel mtDNA in posizione 8366-8572 e fa parte del complesso V responsabile della fase finale della fosforilazione ossidativa nella catena di trasporto degli elettroni.

Il controllo positivo interno (IPC,70bp) è introdotto nel saggio per monitorare i potenziali inibitori presenti nell’estratto di DNA. A tale scopo un oligonucleotide artificiale è stato progettato come descritto nel lavoro [20].

La determinazione del DNA mitocondriale è ottenuta tramite l’amplificazione di un genoma mitocondriale sintetico progettato per il sistema mtND1 (sonda mitocondriale corta) secondo quanto riportato nel precedente studio [57].

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Per la quantificazione del DNA nucleare è stato selezionato come target il gene RNU2 (RNA, U2 small nuclear 1), poichè caratterizzato da regioni conservate tra i primati e organizzato con una ripetizione in tandem (˞6 Kb ciascuna) sul braccio lungo del cromosoma 17. L’utilizzo di un gene multicopia, rispetto ad uno a singola copia permette non solo di ottenere una quantizzazione più efficiente ma anche di risolvere il problema di una possibile variazione presente nella sequenza nella regione di attacco dei primer.

Per la progettazione dei primer e delle sonde per i due target nucleari è stato utilizzato il software Primer3Plus v.2.4.2 (https://primer3plus.com/cgi-bin/dev/primer3plus.cgi) [58], uno specifico software online che permette di ottenere una serie di primer e sonde disegnati per la sequenza desiderata. La sequenza di riferimento del gene RNU2 è stata scaricata da Gene Bank (accession number: L37793.1) dal sito National Center for Biotechnology information (NCBI) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Per il disegno dei primer sono stati curati in particolar modo parametri quali la Tm con valori compresi tra 57-63°C, con differenza di temperatura tra le coppie dei primers di 2-3°C e di massimo 5°C tra i primers all’interno della multiplex. La lunghezza è stata contenuta tra 18 e 27 nucleotidi, con un intervallo di percentuale GC tra 20-80%. Le potenziali sequenze di primer e sonde sono state confrontate con le sequenze disponibili sul sito web del NCBI utilizzando il Basic Local Alignment Search Tool (BLASTn, (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Lo scopo di questo confronto era identificare ed evitare omologie involontarie di primer e/o sonde a genomi non bersaglio che potrebbero portare a reattività incrociate indesiderate, permettendo di individuare in questo modo sequenze altamente conservate e specifiche per il target di interesse.

Inoltre è importante che le sequenze dei primers e probe non siano complementari tra loro e che abbiano una lunghezza e un rapporto GC simile, questo per evitare la formazione di dimeri che porterebbero alla formazione di prodotti di estensione aspecifici e per garantire la stessa temperatura di annealing. La valutazione dei dimeri e degli hairpin è stata fatta tramite sia il software Autodimer (https://www-s.nist.gov/dnaAnalysis/primerToolsPage.do) [59] e sia tramite il software Multiple Primer Analyzer (https://www.thermofisher.com/it/en/home/brands/thermo-

scientific/molecular-biology/molecular-biology-learning-center/molecular-biology-48

resource-library/thermo-scientific-web-tools/multiple-primer-analyzer.html, Thermo Fisher Scientific).

Tutte le sequenze dei primer e probe scelti per il saggio qPCR sono riportate nella tabella 1 insieme alle sequenze dell’oligonucleotide sintetico dell’IPC e del genoma sintetico mitocondriale riportate nella tabella 2. Nella tabella 1 sono riportati i dye e quencher utilizzati per le diverse sonde, scelti in base ai canali di letture dello strumento Rotor-Gene Corbett 6000 (Qiagen) tali da non creare una sovrapposizione della fluorescenza di due diversi target nello stesso canale, alterando così il risultato di quantizzazione.

Localizzazione

Gene Sequenze primer e probe Taglia

amplicone (bp) Ref.

MtND1

F_5’-CCC TAA AAC CCG CCA CAT CT-3’

69bp [20-57]

R_ 5’-GAG CGA TGG TGA GAG CTA AGG T-3’

Probe _ 5’-VIC-CCA TCA CCC TCT ACA TC-MGBNFQ

Mt-ATP8 (mt143bp)

F_5’-CCA CTG TAA AGC TAA CTT AGC ATT AAC C-3’

143bp [7-57]

R_ 5’-GTG ATG AGG AAT AGT GTA AGG AGT ATG G-3’

Probe _ 5’-FAM-CCA ACA CCT CTT TAC AGT GAA-MGBNFQ

RNU2 (nuRNU2_181bp)

F_ 5’-GTG TGG ACT CTG GTG ACC TG-3’

181bp NA

R_ 5’-CTC AGC TAT CAC CTC TGC CG-3’

Probe _5’-Quasar 705-TCC CAG GGC CAC CCG TAA CT-BHQ-2

RNU2 (nuRNU2_71bp)

F_5’-TCT CGC TGT TCA ACT CCC AC-3’

71bp NA

R_ 5’-GCA AAC TGA CAC AGG AAG CG-3’

Probe _ 5’-ROX-AGG AGC GAG AAC ATG CGG TGT-BHQ-2 IPC

F_5’-ATC AGC TTA GCG TGC AGT CA-3’

70bp [20]

R_ 5’-TCT TCG TCG TAA CGG TGA GC-3’

Probe _ 5’-Cy5-GTT GCA CTA CTT CAG CGT CCC A-BHQ-2

Tab.1. Sequenze primer e sonde utilizzate per lo studio. In grassetto sono indicati i dye e i quencher utilizzati per le diverse sonde.

Concentrazione

finale Sequenze primer e probe Ref.

OLIGO IPC 0.001 nM 5'-ATC AGC TTA GCG TGC AGT CAG ATA ATG TTG CAC TAC

F_5'-GAG CGA TGG TGA GAG CTA AGG TCG GGG CGG TGA TGT AGA GGG TGA TGG TAG ATG TGG CGG GTT TTA GGG-3' R_ 5'-CCC TAA AAC CCG CCA CAT CTA CCA TCA CCC TCT ACA [20]

TCA CCG CCC CGA CCT TAG CTC TCA CCA TCG CTC-3' Tab.2. Sequenze dell’oligonucleotide sintetico dell’IPC e del genoma sintetico mitocondriale.

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