Programmi per la dinamica molecolare

2.4.1 Introduzione ad Amber

Gli studi di dinamica molecolare sono stati condotti usando il software AMBER14. Questo in realtà è costituito da una suite di programmi che insieme permettono di effettuare simulazioni di dinamica molecolare, specialmente su biomolecole. La suite AMBER è costituita da due parti:

• AmberTools, un insieme di programmi per la rifinitura, ad esempio SANDER, e per la

simulazione PMEMD.

All’ interno di questa suite possono essere distinte tre categorie di programmi:

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• LEap: rappresenta il programma principale per la creazione dei file di input con le

coordinate e la topologia per le macromolecole;

• ANTECHAMBER fa parte della suite ANTECHAMBER, di cui è il programma

principale. Si usa per preparare i file di input di LEaP nel caso il sistema contenga molecole diverse da macromolecole;

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• SANDER acronimo di “Simulated Annealing with NMR-Derived Energy Restraints”, è il

programma di minimizzazione energetica e di dinamica molecolare. Questo programma è in grado di proporre una conformazione sufficientemente stabile, agendo sugli atomi spostandoli lungo il gradiente di energia per ottenere una struttura più rilassata. Per la dinamica molecolare integra le equazioni newtoniane di moto per generare configurazioni del sistema in esame. In questo modo la molecola è in grado di superare piccole barriere energetiche e quindi di assumere conformazioni non ottenibili con la minimizzazione ma ugualmente stabili. L’uso di SANDER porta a risultati più accurati rispetto al solo uso dei force field, in quanto il calcolo è caratterizzato da una maggiore finezza;

• PMED, acronimo di “Particle Mesh Ewald Molecular Dynamics”, è una versione di

SANDER che consente di lavorare più velocemente, inoltre rende possibile l’uso della GPU oltre alla CPU;

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• CPPTRAJ è un programma per l’analisi e l’elaborazione dei file di traiettoria output dei

processi di dinamica;

• MM-PBSA è uno script che automatizza l’analisi energetica di istantanee di una

simulazione di dinamica molecolare. Esistono due versioni di questo programma: il più datato MMPBSA.pi (scritto in Perl), ed il più recente MMPBSA.py (scritto in Python), generalmente più facile da configurare;

• UCSF CHIMERA (MD_movie) da interfaccia grafica permette di visualizzare il file di

traiettoria sotto forma di filmato;

• RMS prevede il calcolo dell’RMSD medio tra la pose del ligando durante l’ intera

dinamica e la sua pose iniziale, in altre parole quella proposta dal docking;

• Hbond è una funzionalità che calcola il numero di legami ad idrogeno instaurati o

mantenuti durante la simulazione di dinamica per ogni frame di residuo proteico.

2.4.2 Preparazione dei file di input

Le informazioni richieste dai programmi di simulazione (SANDER e PMEMD) sono:

• Le coordinate cartesiane di ciascun atomo del sistema, che saranno contenute in un file INPCRD. Nel caso di questo studio esse provengono dai raggi X. Il programma LEaP fornisce una piattaforma per lo svolgimento di alcune attività preparatorie di modellazione molecolare.

• La topologia, cioè il tipo di connessioni tra gli atomi, i nomi, gli atom-type, i residui e la carica; queste informazioni saranno trasmesse da un file PRMTOP.

I comandi, cioè tutte le opzioni procedurali ed i parametri forniti dall’ utente, vengono specificati con dei semplici file di testo nominati min.in per le minimizzazioni con SANDER e dyn.in per le dinamiche di PMEMD.

2.4.3 Preparazione dei file per tLEaP

Il primo passaggio da effettuare è la preparazione dei file. Nel file contente la proteina bisogna eliminare tutte le parti che vengono reputate irrilevanti per la simulazione. Esso deve essere salvato in formato PBD, mentre il ligando deve essere salvato in formato MOL2. Vanno inoltre eliminate tutte le molecole di acqua che non sono considerate rilevanti ed anche tutti gli idrogeni dalla proteina.

E’ utile conoscere alcune convenzioni adottate dal programma per definire alcuni stati particolari:

• L’ istidina può esistere in tre forme: due forme vedono un solo protone, la terza invece è

con due protoni. Il file PDB deve specificare la scelta dell’utente. Il termine predefinito nei file PDB è “His”; se invece si desidera invertire la provocazione il nome deve essere modificato in “HID”, mentre con il termine “HIP” si produrrà la forma completamente protonata.

• La cisteina può esistere in forma libera o come parte di un ponte disolfuro. Nel file PDB

il nome “CYS” rappresenta una cisteina libera, mentre la presenza di un ponte è codificata dal termine “CYX”.

• Gli stati di protonazione di aspartato, glutammato e lisina possono essere cambiati

sostituendo i seguenti nomi “ASH”, “GLH” e “LYN”.

Quando la simulazione interessa un complesso ligando-recettore è necessario effettuare il calcolo della carica totale del ligando usando il programma ANTECHAMBER, fornendogli come input il file del solo ligando estratto dal complesso.

Il programma PARMCHK permette di creare il file contenente i parametri di simulazione relativi al ligando, a partire dall’ output di Antechamber.

Il comando è il seguente:

2.4.4 tLEaP

Una volta creati i parametri relativi al ligando è possibile effettuare l’elaborazione del complesso proteina-ligando attraverso tLEaP.

Innanzitutto vengono caricati i force field su cui verranno basati i calcoli di dinamica, il file dei parametri del ligando e quello contenente le coordinate della sola proteina estratta dal complesso. A questo punto deve essere calcolata la carica totale della proteina in modo tale da poterla neutralizzare con l’aggiunta di un opportuno numero di ioni sodio (Na+) o cloruro (Cl-), a seconda del valore e del segno della carica rilevata.

Successivamente è necessario creare un box d’ acqua che circondi la proteina. Come risultato dell’elaborazione del complesso proteina-ligando viene creato un file contenente le coordinate dell’intero complesso (file.inpcrd) ed un file contenente tutti i relativi parametri (file.prmtop): questi sono file fondamentali per la realizzazione di tutte le simulazioni di dinamica molecolare.

Questi passaggi sono stati automatizzati con uno script in modo tale da poter usare tLEaP per generare tutti i parametri in automatico:

# carica il general amber force field:

• tleap -f $AMBERHOME/dat/leap/leaprc.ff14SB source leaprc.gaff

# carica i parametri del ligando e degli ioni usati per la creazione del complesso: • fmod = loadamberparams nai.frcmod

fmod 1 = loadamberparams frcmod.zhk

fmod 2 = loadamberparams /usr/local/amber14/dat/leap/parm/frcmod.ionsjc_tip 3P

# per caricare la proteina senza idrogeni in PDB, il ligando in formato MOL2: • prot = loadpdb < prot.pdb >

lig = loadmol2 < lig.mol2 >

# creazione del complesso:

# aggiunta del solvente (TIP3PBOX è l’acqua) in un box di 20 Å:

• solvatebox complex TIP3BOX 20

# mostra la carica del complesso ed aggiunge ioni per azzerare la carica (Cl- se positiva,

Na+ se negativa):

• charge complex

addions complex Cl- 0 < oppure Na+ 0 >

# salvataggio dei parametri:

• saveamberparm complex file.prmtop file.inpcrd

Se si vuole convertire i file input nel formato PDB, in modo da poterli leggerle con programmi grafici e controllare che tutto sia stato creato correttamente, è possibile farlo attraverso il seguente comando da terminale:

• ambpdb -p complex.prmtop < complex.inpcrd > complex.pdb

2.4.5 SANDER

SANDER fornisce un accesso diretto ai diversi force field per le proteine e gli acidi nucleici, supporta inoltre modelli per la gestione dell’acqua e di molti altri solventi organici.

In questo lavoro è stato effettuato solo una minimizzazione in cui vengono bloccati i carboni in alfa in modo da minimizzare il ligando e le catene laterali.

2.4.5.1 Minimizzazione

Per effettuare una minimizzazione e/o una simulazione di dinamica molecolare con AMBER14 sono necessari i file.inpcrd e .prmtop di input ed un file contenente i parametri relativi al calcolo.

Imin: permette di scegliere se effettuare la minimizzazione o meno (valore = 1 si, valore = 0 no). Parametro usato 1.

Maxcyc: numero complessivo di cicli di minimizzazione. Parametro usato 5000.

Ncyc: numero di cicli di minimizzazione preliminari (effettuati con un force field meno severo). Parametro usato 1000.

Ntb: permette di scegliere se effettuare la minimizzazione a volume o a pressione costante (valore = 1 volume costante, valore = 2 pressione costante). Parametro usato 1.

Ntr: da attivare se si vuole impostare dei constraints (valore = 1 sì, valore = 0 no). Parametro usato 1.

Cut: permette di impostare la zona entro cui considerare gli atomi non legati. Parametro usato 10.

Drms: gradiente di energia in Kcal/mol. Se lo impostiamo uguale a 1 il suo valore è di -4 Kcal/mol.

Il calcolo della minimizzazione del complesso viene fatto attraverso la linea di comando ed anche in questo caso può essere creato uno script:

• setenv mp “/usr/local/amber14/bin/mpirun -n (n processori)”

setenv sn “/usr/local/amber14/bin/sander.MPI” $mp $sn -O -i min1-in -o min1.out -c complesso.inpcrd -p complesso.prmtop -r complesso.rst -ref complesso.inpcrd < /dev/null

Dove troviamo nelle prime due righe di codice un richiamo al programma SANDER per effettuare la minimizzazione, -i e -o come file di input e output, il complesso .inpcrd e .prmtop sono i file creati attraverso il tLEaP ed il file .rst è un file di coordinate di output che servirà per la futura dinamica molecolare.

2.4.6 PMEMD

Questo programma è l’ideale per le simulazioni di dinamica molecolare di grandi sistemi solvatati per lunghi periodi di tempo. Come nelle minimizzazioni, anche nelle dinamiche è possibile impostare dei constraints, che permettono di mantenere fisse le coordinate di alcuni atomi degli elementi analizzati. E’ possibile effettuare la simulazione mantenendo costante il volume o la pressione del sistema; la temperatura può essere fatta variare progressivamente oppure mantenuta ad un valore stabilito. In base alle condizioni scelte è necessario impostare parametri diversi con informazioni compatibili alla scelta effettuata. Normalmente si mira a realizzare una dinamica molecolare ad una temperatura e pressione costanti. I primi step di simulazione sono però condotti a basse temperature, poiché è necessario innanzitutto fornire calore al sistema, ed in queste condizioni il calcolo della pressione del sistema è abbastanza inaccurato: la scelta di effettuare questa prima fase di riscaldamento a pressione costante può quindi comportare dei problemi. Per questo motivo la fase iniziale della simulazione, in cui la temperatura del sistema viene fatta passare da 0 °K a 300 °K, viene condotta a volume costante. Una volta che il sistema si è equilibrato ed ha raggiunto una temperatura stabile intorno a 300 °K è possibile passare a fasi successive di simulazione da condurre a pressione e temperatura costanti.

La durata di una simulazione di dinamica viene impostata specificando il numero di step da effettuare, ciascuno della durata di 0.002 ps.

La dinamica è stata strutturata in tre fasi per un totale di 20 ns:

• dyn1.in: ha una durata di 0,5 ns. Questa è la fase di riscaldamento nella quale, come detto prima, viene fornita energia al sistema. Questa prima parte è effettuata mantenendo bloccati tutti i carboni alfa in modo da diminuire i tempi di esecuzione e lasciare che il sistema si assesti senza sconvolgerne troppo la struttura;

• dyn2.in: ha una durata di 3 ns; anche in questa fase vengono mantenuti bloccati tutti i carboni alfa;

• dyn3.in: ha una durata di 16,5 ns. Questa fase finale viene condotta lasciando l’intero complesso libero di muoversi.