Protezione dall’apoptosi

14.2.1. Caratteristiche generali dell’apoptosi

Il termine apoptosi è stato proposto nel 1972 da Kerr (Kerr et al., 1972) a partire dal termine greco che significa “caduta delle foglie e dei petali dei fiori”, per indicare una forma di morte cellulare programmata. Si tratta di un processo ben distinto rispetto alla necrosi cellulare e in condizioni normali contribuisce al mantenimento del numero di cellule di un sistema.

Una cellula apoptotica, a differenza di quella necrotica, perde rapidamente volume, si condensa, si stacca dalle cellule vicine, si frammenta in una serie di “corpi apoptotici” ed espone sulla membrana dei componenti normalmente non presenti o poco espressi. Questi ultimi vengono riconosciuti dalle cellule fagocitiche vicine che inglobano la cellula morente. Dal momento che non si ha versamento del contenuto citosolico nel mezzo extracellulare, non si ha alcun processo flogistico secondario. Tutto il processo non dura che 1-2 h e colpisce poche cellule del tessuto, rendendone così difficoltosa l’identificazione (Golstein et al., 1991; Majno and Joris, 1995).

Nell’uomo i processi apoptotici sono coinvolti: nello sviluppo e nel mantenimento dell’omeostasi di tessuti e organi (Kerr et al., 1972), tra cui il sistema nervoso centrale (Naruse and Keino, 1995); nel turn- over cellulare (Wyllie et al., 1980); nello spegnimento delle risposte

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immunitarie (Chen et al., 1992). Inoltre l’apoptosi è implicata in

condizioni patologiche (Thompson, 1995), dove una sua

deregolazione può portare a: patologie associate ad un aumento della

sopravvivenza e della proliferazione cellulare (diminuzione

dell’apoptosi) quali i tumori; o a patologie caratterizzate da un eccesso di morte cellulare programmata, come le malattie virali o neurodegenerative (AIDS, malattia di Alzheimer, morbo di Parkinson, sclerosi laterale amiotrofica ecc.).

1.4.2.2. NO, eNOS ed apoptosi.

Un interessante aspetto della biologia della eNOS e del NO da essa prodotto è il ruolo nel controllo dell’apoptosi. Come riportato in letteratura il NO svolge un duplice ruolo nella modulazione del processo apoptotico: può infatti, in base alla sua forma, alla concentrazione e al tipo cellulare, sia promuovere che inibire la morte cellulare (Snyder, 1993). Se prodotto ad elevate concentrazioni (dell’ordine di 1-3 mM), il NO con i suoi derivati può avere effetti deleteri per tutte le funzioni cellulari, portando per esempio alla perdita di funzioni enzimatiche, all’alterazione dell’integrità di membrana e a mutazioni del DNA (Chung et al., 2001; Choi et al., 2002; Yung et al., 2004; Fabbri et al., 2005). Invece, a concentrazioni

più basse (nM - M), in vari sistemi il NO protegge le cellule da

morte apoptotica (Kim et al., 1999; Choi et al., 2002).

Per studiare il ruolo del NO nella regolazione dell’apoptosi, Bulotta et al. (2001) hanno utilizzato come modello cellulare cloni

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Hela-TetOff con espressione inducibile della eNOS; gli autori hanno osservato che l’induzione dell’enzima causa una parziale protezione dall’apoptosi indotta da TNF-α e hanno dimostrato che tale effetto è mediato da stimolazione della attività della eNOS dal TNF-α stesso. In un successivo lavoro, gli autori hanno analizzato la via tramite la quale il TNF-α stimola l’attività della eNOS, dimostrando che il pathway non dipende dal complesso Ca2+/CaM ma che comprende l’attivazione di N-SMasi (la SfingoMielinasi Neutra), la produzione di

ceramide, l’attivazione di di PI3K (Phosphatidylinositol 3’-kinase), di

Akt e quindi della eNOS (Barsacchi et al., 2003). Viene così a stabilirisi un circuito di feedback tra eNOS/NO e ceramide.

Il ruolo prottettivo esercitato dalla eNOS nei confronti dell’apoptosi è stato osservato anche in cellule HUVEC, dove la morte cellulare è stata indotta da elevate concentrazioni di glucosio; l’utilizzo di inibitori (wortmannin e LY294002) e di mutanti negativi di PI3K ha dimostrato che la via di segnalazione coinvolta nell’attivazione della eNOS è quella PI3K-Akt (Ho et al., 2006).

Nel trattamento terapeutico dei tumori, considerato l’effetto antiapoptotico del NO prodotto dalla eNOS, l’inibizione specifica dell’enzima, da sola o in combinazione con agenti chemioterapici, potrebbe essere una valida opzione per stimolare l’apoptosi nelle cellule tumorali (Ying and Hofseth, 2007).

Il NO esercita gli effetti citoprotettivi attraverso la sua diretta o indiretta interazione con il macchinario apoptotico (Kim et al., 1999;

Choi et al., 2002; Manucha and Vallés, 2008). I meccanismi

biochimici proposti essere responsabili degli effetti antiapoptotici del NO sono (Fig. 12):

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Figura 12. Effetti antiapoptotici del NO. Il NO stimola l’attività

della sGC ed induce l’accumulo del secondo messaggero cGMP, il quale inibisce l’attivazione delle caspasi, esecutrici del programma apoptotico, e di Bad un fattore pro-apoptotico. IL NO, inoltre è in grado di S-nitrosilare la cisteina del sito attivo delle caspasi portando alla loro inattivazione. Questo fenomeno impedisce la degradazione della proteina antiapoptotica Bcl-2 ed il rilascio dal mitocondrio del citocromo c utile all’attivazione delle caspasi.

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-via cGMP: il NO, come detto, è in grado di stimolare l’attività della

GCs ed indurre l’accumulo del secondo messaggero cGMP. Come discusso nella sezione 1.4.1., il cGMP attiva i processi di estrusione

del Ca2+ , e poiché l’aumento di Ca2+ citosolico rappresenta un segnale

chiave per l’instaurazione del processo apoptotico, l’abbassamento del

Ca2+ intracellulare potrebbe di per sé avere un effetto anti-apoptotico.

E’ stato inoltre riportato che la caspasi 3, la principale caspasi “esecutrice” del processo apoptotico è inibita in modo cGMP-PKG- dipendente ma non è stato chiarito se l’azione di PKG sulla caspasi è diretta o indiretta (Kim et al., 1997).

-inibizione della produzione di ceramide: la produzione di ceramide

rafforza l’apoptosi indotta da TNF-α. Il NO mediante l’attivazione del c-GMP è in grado di inibire la produzione del ceramide bloccando il processo apoptotico (De Nadai et al., 2000; Bulotta et al., 2001).

-inibizione delle caspasi tramite S-nitrosilazione: tutte le caspasi

contengono una singola cisteina nel sito catalitico che è essenziale per la loro attività. Il tiolo della cisteina è suscettibile alle modificazioni redox e può essere S-nitrosilato in presenza di NO (Kim et al., 1997). La reazione della cisteina con il NO può prevenire efficacemente le attivazioni anomale delle caspasi. Il NO è in grado di S-nitrosilare la cisteina del sito attivo delle caspasi esecutrici del programma apoptotico portando alla loro inattivazione (Kim et al., 1997).

-inibizione del rilascio di citocromo c: il rilascio di citocromo c è un fattore essenziale nell’attivazione delle caspasi (Jiang and Wang, 2004) ed è notoriamente impedito dall’azione antiapoptotica della proteina Bcl-2. Poiché la stessa Bcl-2 è substrato delle caspasi, la S- nitrosilazione di quest’ultime previene l’inattivazione della funzione

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antiapoptotica di Bcl-2 e conseguentemente il rilascio di citocromo c nel citosol (Genaro et al., 1995).

-regolazione dell'espressione di geni antiapoptotici: il NO induce

l'espressione di geni citoprotettivi quali quelli codificanti per Hsp70 ed Hsp32, che proteggono gli epatociti dall'apoptosi indotta dal TNF-α e dallo stress ossidativo e nitrosativo (Kim et al., 1995).

1.4.3. Angiogenesi e migrazione