Protocollo sperimentale

La prima parte degli esperimenti è stata svolta sotto una cappa a flusso laminare, resa sterile con raggi UV per ridurre al minimo il rischio di contaminazione; per ciascuna procedura, inoltre, sono stati utilizzati sia strumenti asettici sottoposti a processo di sterilizzazione che materiale plastico monouso pre-sterilizzato. Per garantire la riproducibilità degli esperimenti è stato inoltre necessario attenersi a metodiche sperimentali validate e ripetibili.

3.3.1 Scongelamento

Lo scongelamento è un processo che deve essere eseguito molto velocemente per evitare che il DMSO a temperatura ambiente danneggi le cellule; una volta prelevato il criotubo dal dewar, si pone subito in ghiaccio e poi lo si immerge nel bagnomaria in modo da scongelare rapidamente la sospensione. A scongelamento avvenuto, si trasferisce il contenuto del criotubo in un falcone e vi si aggiungono circa 5-6 mL di

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mezzo di coltura precedentemente riscaldato a 37°C agitando continuamente per disperdere in modo uniforme le cellule nel nuovo mezzo; si centrifuga quindi la sospensione ottenuta per 5 minuti a 1100 rpm, si aspira il surnatante e si risospende il pellet in 3-4 mL di mezzo di coltura fresco.

La nuova sospensione viene infine trasferita in una fiasca da 75 cm2 (T75) e posta in incubatore a 37°C e 5% di CO2.

Nei giorni successivi allo scongelamento, fin quando le cellule non raggiungono la confluenza desiderata, il mezzo di coltura esaurito viene sostituito con quello nuovo ed eventuali residui o cellule morte in sospensione vengono asportati mediante lavaggi con PBS.

3.3.2 Piastratura

Le cellule crescono all’interno della fiasca fino ad occupare l’intera superficie disponibile e quando raggiungono una confluenza pari a circa l’80% possono essere staccate, contate e poi seminate nella piastra; per questo tipo di procedura sperimentale si utilizzano piastre adatte da 6. La piastratura è un protocollo che permette di ottenere un numero stabilito di cellule all’interno dei vari pozzetti, ciascuno dei quali viene poi trattato con le soluzioni delle sostanze a concentrazioni differenti secondo un planner prestabilito, così da confrontare l’effetto dei diversi trattamenti sullo stesso numero di cellule. Per staccare le cellule dalla base della fiasca

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si aspira il mezzo di coltura vecchio, si esegue un lavaggio con circa 5 mL di PBS e si aggiungono 3 mL di una soluzione di tripsina/EDTA; la tripsina è un enzima in grado di degradare le membrane cellulari e di staccare le cellule, che trovandosi sotto forma di aggregati permette l’eliminazione di questi ultimi mentre l’EDTA aumenta l’attività dell’enzima stesso chelando calcio e magnesio dalla superficie delle cellule. La fiasca viene posta per qualche minuto in incubatore prima di procedere al controllo dello stato di adesione cellulare al microscopio ottico; una volta che le cellule si sono staccate, si aggiungono 7-8 mL di mezzo di coltura per neutralizzare l’azione proteolitica della tripsina, evitando così sia un eventuale danneggiamento delle membrane cellulari sia la possibile formazione di nuovi agglomerati di cellule (cluster) dovuti ad una parziale fusione delle membrane. Successivamente, si trasferisce la sospensione cellulare in una provetta graduata da 15 ml (falcon) da cui vine prelevata un’aliquota per il conteggio cellulare.

Al termine della procedura, la piastra viene riposta nell’incubatore per consentire l’adesione delle cellule ai pozzetti seminati, mentre la sospensione cellulare in eccesso viene nuovamente trasferita in fiasca così da permettere alle cellule di crescere e di raggiungere nuovamente la confluenza per impostare eventuali nuovi esperimenti nei giorni successivi.

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3.4 Studio della vitalità e della proliferazione cellulare

Il Trypan blu (blu diammina, blu Niagara, blu vitale) è un derivato della toluidina con capacità colorante di tingere le cellule morte dei tessuti (Ehrlich e Shiga, 1904). Il suo nome deriva dalla sua capacità di uccidere tripanosomi, parassiti che provocano la malattia di Chagas, la malattia del sonno e la leishmaniosi in Africa.) Questo colorante è uno dei molti impiegati per valutare la vitalità cellulare per esclusione di assorbimento, in quanto il colore non in grado di penetrare nelle cellule vive che posseggono le membrane intatte. Il Trypan blu non è solito utilizzarsi per eseguire semplici conte di cellule, ma è necessario per distinguere tra le cellule morte (con la membrana distrutta) e le cellule vive (con membrana intatta). In questo metodo prima di essere osservate al microscopio con un Emocitometro Neubauer una sospensione di cellule è miscelata con una soluzione di 0,4% Trypan blue. Anche se il protocollo originale prevede l'utilizzo di una miscela isovolumetrica di sospensione cellulare e trypan blu (per esempio, 10 µL di sospensione cellulare e 10 µL di trypan blu), si può anche fare uso di altri tipi di diluizioni (in particolare per sospensioni cellulari altamente concentrate), a patto che si consideri il corrispondente fattore di diluizione nei calcoli finali.

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L' emocitometro è una diapositiva specializzata in cui una griglia viene incisa al laser. La sua costruzione permette di conoscere il volume di liquidi immessi sopra e sotto il vetrino. La griglia è fatta di nove quadrati di 1 mm^2 ciascuna (quadrato rosso nella figura sottostante). I 4 quadrati di 1 mm^2 situato in ogni angolo a loro volta hanno 16 quadrati di 0,0625 mm^2(verde). La casella centrale (1 mm^) è formata da 25 quadrati da 0,04 mm^2 (giallo). Questi quadrati a loro volta sono composti da altri quadrati di 0,0025 mm^2(blu). Data la profondità della camera di soli 0,1 millimetri, ognuna di queste unità corrisponde a volumi fissi conosciuti, come illustrato nella Figura 4

Figura 4: camera di conta Neubauer Procedimento per il conteggio

1. Inserimento dell'obiettivo 25x nel percorso ottico del microscopio nel campo illuminato.

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2. Stima del volume della sospensione cellulare da cui si prende l'aliquota da valutare.

3. Aggiunta μ90 L di 3. trypan blu 0,4% in una microprovetta PCR o un pozzetto di un multiplacca.

4. Omogeneizzazione della sospensione cellulare (in terreni di coltura o PBS) e aggiunta di 10 μl della stessa alla provetta / microplacca contenente trypan blu.

5. Miscelazione della sospensione cellulare con trypan blu pipettando da 5 a 8 volte.

6. Collocamento di 10 µl della miscela in ogni quadrato del emocitometro. 7. Disposizione dell'emocitometro sotto il microscopio e individuazione

del reticolo inciso.

8. Attesa di un assestamento delle cellule per 1-2 minuti e successivo conteggio.

9. Conteggio separato delle cellule blu (morte) e delle cellule bianche (vive), da osservare in ciascuna delle cornici considerate.

10. Il conteggio di cellule per ogni quadrante esterno dovrebbe variare da 20 a 50 celle, con un totale di cellule nei quattro quadranti 4x4 di 80-200 cellule. Le cellule localizzate nei margini esterni di ogni cella non si devono includere nel conteggio.

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11. Quando vi è una maggiore densità cellulare di 50 cellule per quadrante 4x4, si procederà a contare il quadrante centrale. Possono essere contate tutte le cellule di tutti i quadrati secondari o se si preferisce i 4 quadrati degli angoli e quello centrale.

12. Calcolo dei risultati:  Cellule per ml

Per quadrati 4x4: numero totale delle cellule vive ÷ numero quadrati 4x4

valutato × fattore di diluizione × 10.000.

 Per tutte i quadrati: numero totale centro delle cellule vive ÷ 100 (100% quadrati) × fattore di diluizione × 10.000.

 Per 5 quadrati centrali: numero totale delle cellule vive ÷ 20 (20% quadrati) × fattore di diluizione × 10.000.

 Cellule totali: cellule per ml x volume (ml) totale da cui sono state estratte le cellule da valutare.

 La vitalità cellulare: (%) (numero totale di cellule vive) ÷ (numero di cellule totale [vive + morte]) × 100

Per il conteggio delle cellule è stato utilizzato anche un metodo automatico.

La sospensione cellulare è stata miscelata con lo stesso volume di una soluzione di 0,4% Trypan Blu (Invitrogen) ed è stata caricata su una

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camera di conteggio di area nota. Sono stati analizzati numero di cellule e la vitalità delle colture cellulari utilizzando il contatore automatico

Countess® Automatic Cell Counter (Invitrogen). (Figura 5)

Figura 5: Countess® Automatic Cell Counter (Invitrogen).

Questa apparecchiatura utilizza il metodo di esclusione del Trypan Blue; si utilizza il colloide che viene introdotto all'interno delle cellule che presentano difetti nella membrana, in modo che si distingua tra cellule morte (contrassegnate con blu) quelle vive (senza blu) (Freshney 1987).