4.2 Studio della specificità di azione dell’enzima HO-1 nella
4.3.4 Quantificazione di Bcl-W
L’espressione della proteina anti-apoptotica Bcl-W è stata quantificata mediante test ELISA nelle diverse regioni del cuore nei gruppi Sham, MI e MI-CoPP, a 16 h e 24 h. Anche in questo caso abbiamo scelto di presentare i dati relativi alla zona IZ in quanto essa rappresenta l’area
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più direttamente colpita dall’evento ischemico (Fig. 28). Inoltre, in queste fasi precoci la regione border (BZ) non era ancora ben definita anatomicamente.
Figura 28. Quantificazione di Bcl-W nei tre gruppi sperimentali ShamM, MI e MI-CoPP. I dati sono riferiti alla regione centrale dell’infarto (IZ). Nel gruppo Sham il termine IZ si riferisce all’area cardiaca corrispondente, ma non infartuata. (n=3 per ciascun gruppo sperimentale)
Dalla figura emerge un aumento significativo di espressione di Bcl-W nei gruppi MI e MI-CoPP rispetto al gruppo Sham (p<0,01 e p<0,05 vs. Sham, rispettivamente) a partire dalle 24 h. Negli animali infartuati, il trattamento con CoPP sembra determinare una ridotta espressione della proteina anti-apoptotica, anche se la differenza osservata non è significativa (p=0,06).
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Questo dato risulta inatteso rispetto al ruolo anti-apoptotico dell’enzima HO-1 descritto in letteratura. Poiché è noto che il processo apoptotico deriva dall’equilibrio tra attività pro- e anti-apoptotica, una possibile interpretazione del dato potrebbe essere che l’aumento di Bcl- W osservato nel modello MI a 24 h sia associato alla parallela maggiore attivazione del processo apoptotico. Viceversa nel modello MI-CoPP si denota una diminuzione di Bcl-W, probabilmente dovuta ad una riduzione netta del processo apoptotico, andando a evidenziare gli aspetti benefici dati dal trattamento con CoPP nell'espressione e attività di HO.
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5 DISCUSSIONE
I dati precedentemente acquisiti nel nostro laboratorio hanno evidenziato come l'induzione dell'HO-1 possa avere un ruolo positivo nel limitare il danno strutturale e funzionale del miocardio a 4 settimane dall’infarto (Kusmic et al, 2014). A differenza di quanto già presente e descritto in letteratura (Yet et al, 2001; Liu et al, 2006; Lakkisto et al, 2010, Wang et al, 2010), gli effetti benefici osservati erano ottenuti mediante la somministrazione di un induttore dell’enzima HO-1, la cobalto protoporfirina IX (CoPP) in tempi successivi anziché precedenti l’evento ischemico. Nell’ambito della ricerca traslazionale questo punto è molto importante perché rappresenta la condizione più simile allo scenario della pratica clinica, ovvero una terapia che possa essere applicata dopo l'occorrenza dell’evento ischemico e che possa modulare potenzialmente e favorevolmente il rimodellamento cardiaco post- infartuale.
Il lavoro svolto precedentemente mancava, tuttavia, di alcuni importanti esperimenti per una corretta interpretazione dei dati ottenuti. Il presente studio, quindi, si è proposto di colmare le precedenti lacune mediante 3 serie di esperimenti:
1) Determinazione del time-course dell’espressione e dell’attività enzimatica di HO-1 a seguito della somministrazione dell'induttore (CoPP). Questi esperimenti erano mirati ad una migliore definizione della tempistica di azione dell’enzima sui processi cellulari avviati dall’evento ischemico per comprendere meglio il modo in cui l’HO-1 possa svolgere
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il suo ruolo benefico. Questo tipo di analisi, condotta su un gruppo di animali di controllo, ha evidenziato un andamento comune nei due parametri che vede un significativo aumento a partire dalle 16 ore e maggiormente evidente a 24 ore dalla somministrazione.
2) Analisi della specificità dell’azione di HO-1 nel determinare gli effetti benefici osservati a lungo termine (4 settimane dopo l’infarto). Per chiarire questo importante punto abbiamo eseguito un esperimento di “perdita di funzione”, utilizzando un gruppo sperimentale di ratti infartuati aggiuntivo in cui contestualmente al trattamento con CoPP veniva somministrata anche la stagno mesoporfirina (SnMP), un potente inibitore dell’attività di HO. I risultati ottenuti indicano che l’inibizione dell’attività del sistema HO comporta la perdita degli effetti benefici osservati dopo trattamento con CoPP, deponendo a favore della specificità d’azione svolta da HO-1.
3) Analisi dell’effetto della sovra-espressione di HO-1 sull’apoptosi nelle fasi precoci post-infarto. A questo scopo abbiamo studiato gruppi sperimentali aggiuntivi sacrificati a tempi brevi successivi all’induzione dell’infarto (16 e 24 h). A differenza di quanto riportato in letteratura (Lakkisto et al, 2011), i risultati da noi ottenuti non hanno evidenziato alcun effetto significativo dell’attivazione dell’HO-1 sull’apoptosi ai tempi studiati.
Tuttavia, poiché l’andamento temporale dell’apoptosi a seguito di infarto acuto è ancora poco definito (Abbate et al 2002), potremmo non avere scelto la finestra temporale di analisi più appropriata e quindi
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non possiamo escludere risultati diversi da quelli ottenuti in tempi di analisi diversi.
D’altra parte, la ridotta area infartuale che si osserva a lungo termine (4 settimane) depone a favore della minore attivazione di meccanismi di morte cellulare (apoptosi e/o necrosi) nelle fasi precoci successive all’evento ischemico negli animali trattati con CoPP.
.
In conclusione, questo studio ha fornito l’evidenza sperimentale che la sovra-espressione di HO-1 iniziata in tempi successivi rispetto all’infarto e proseguita durante la fase di riparazione e la fase cronica è ancora in grado di ridurre la mortalità, l’area infartuale, la disfunzione ventricolare e il rimodellamento cardiaco. L’inibizione dell’attività dell’enzima sovra-espresso abolisce completamente gli effetti benefici, suggerendo la specificità dell’enzima nell’azione positiva sia a medio che a lungo termine.
In questa prospettiva, i risultati rappresentano una base di partenza per la ricerca di nuovi induttori farmacologici della sovra-espressione di HO-1 per una possibile applicazione clinica nell’uomo.
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