RAS e BRAF

3.1.1 Via di signalling di RAS/RAF/MAPK

EGFR è un recettore tirosin-chinasico appartenente alla famiglia degli Erb (di cui

riconosciamo 4 membri, ovvero Erb1, Erb2, Erb3 ed Erb4); quando i ligandi interagiscono con EGFR, la struttura del recettore si modifica, causando l’autofosforilazione della parte intracellulare del recettore, attraverso la sua attività tirosin-chinasica. 209 Questo determina l’attivazione della proteina Ras; in particolare l’attività biologica di Ras è controllata da un ciclo GDP/GTP regolato dalle Guanine Nucleotide Exchange Factors (GEFs, di cui fa parte la proteina Sos), le quali promuovono la formazione della forma attivata, legante GTP, di Ras; le GTPase Activating Protein (GAPs), invece, accelerano l’intrinseca attività GTPasica di Ras, con formazione della forma inattiva, legante GDP, della proteina. 210

Una volta attivato, Ras trasmette il suo segnale a valle attraverso una cascata di proteine citoplasmatiche, tra cui la Serina/Treonina chinasi Raf, che è stata individuata come effettore critico della funzione dello stesso Ras. 211 _{L’attivazione di questa proteina è garantita da} fosforilazioni multiple che si realizzano a livello dei suoi due principali siti di fosforilazione; alterazioni di questi siti, con attivazione eccessiva ed incontrollata di Raf, sono alla base di processi cellulari che guidano la cancerogenesi.

Raf a sua volta fosforila una serie di proteine chinasi, le MAPK, capaci di traslocare nel nucleo e promuovere la trascrizione di geni che consentiranno alla cellula di rispondere al segnale iniziale. In particolare vengono fosforilati fattori di trascrizione che determinano la produzione di nuovi mRNA che codificano per proteine che coordinano un’ampia varietà di risposte cellulari coinvolte nella regolazione del ciclo cellulare, nella proliferazione e

differenziazione cellulare, nella sopravvivenza, nell’apoptosi e in molti altri processi cellulari. 212

3.1.2 Alterazioni di RAS e BRAF nel CCR

Sia per quanto riguarda RAS che BRAF, mutazioni geniche “attivanti” costitutivamente queste proteine determinano una stimolazione continua delle tappe molecolari a valle di Ras e Raf, in particolare la via delle MAPK. Si determina quindi una spinta proliferativa

indipendente dal legame del fattore di crescita con EGFR, assumendo così un ruolo chiave nella cancerogenesi del CCR. 213

RAS

La famiglia delle proteine Ras comprende un gruppo di proteine monomeriche associate alla membrana plasmatica, caratterizzate da un peso molecolare di 21 kDa e da un’attività GTPasica intrinseca; in particolare abbiamo tre geni (HRAS, KRAS e NRAS) che codificano per 4 proteine (HRas, NRas, KRas4A e KRas4B) 214, che, come abbiamo visto, trasducono il segnale da recettori di membrana verso altre proteine intracellulari.

KRAS e HRAS sono stati per primi identificati grazie agli studi di Kirsten e di Harvey sul

virus causa del sarcoma murino 215 _{e, successivamente, nelle cellule cancerose umane.} 216 _La scoperta di NRAS è avvenuta alcuni anni dopo nelle cellule umane di neuroblastoma. 217 Le mutazioni fino ad ora maggiormente descritte nel CCR sono mutazioni somatiche puntiformi di KRAS a carico dei codoni 12 e 13 dell’esone 2 e dei codoni 56/61 e 117/146 rispettivamente dell’esone 3 e 4. Tali mutazioni hanno una diversa frequenza; il più frequente nel CCR è la sostituzione di una base nucleotidica guanina con un’adenina (transizione G>A) oppure con una timina (trasversione G>T) sul codone 12. 218

Le mutazioni di HRAS sono trascurabili, mentre quelle di NRAS si riscontrano nel 3-5% dei CCR, più frequentemente localizzate nel codone 61 (60%). 219

BRAF

Il gene BRAF è situato sul cromosoma 7 in posizione 7q34. In seguito ad un complesso fenomeno di splicing alternativo si originano diverse molecole di mRNA matura, la cui traduzione condurrà a tre isoforme alternative di RAF, ovvero A-Raf, B-Raf e C-Raf. BRAF, la forma che ci interessa maggiormente nello studio del CCR, codifica per una serina/treonina chinasi che agisce come effettore a valle rispetto a KRas. 220

Nonostante siano state descritte numerose (più di 40) mutazioni del dominio chinasico di

BRAF, la più comune è la sostituzione GTG-GAG in posizione 1799 dell’esone 15, che risulta

nella mutazione dell’aminoacido V600E, ovvero una sostituzione dell’aminoacido Valina (V) con un Acido Glutammico (E); l’inserimento del glutammato conferisce una carica negativa in grado di mimare la fosforilazione dei residui di treonina 599 e serina 602, conducendo quindi all’attivazione della proteina BRAF indipendentemente dal controllo cellulare. La “forza” di BRAF è che non solo attiva la via delle MAPK, con aumento della crescita cellulare e della proliferazione, ma agisce anche su altri processi cellulari, come la migrazione, l’apoptosi (attraverso la regolazione di BCL-2) e la sopravvivenza cellulare (attraverso la via HIPPO). Per questo, non è una sorpresa che BRAF è stata ritrovata

costitutivamente attivata da una mutazione nel 15% di tutti i tipi di tumore umano conosciuti. 221

3.1.3 Considerazioni cliniche/predittive/prognostiche

Considerando il ruolo che Ras e Raf hanno nella cellula e l’importanza di una loro mutazione nel processo di cancerogenesi, sono state studiate le caratteristiche cliniche, predittive e prognostiche che queste mutazioni determinano.

CARATTERISTICHE PREDITTIVE/PROGNOSTICHE

Per quanto riguarda KRAS, è stato dimostrato che, nel mCCR, la mutazione del codone 12 o 13 dell’esone 2 rappresenta un importante biomarker predittivo di resistenza agli anticorpi anti-EGFR; pazienti con KRAS mutato, inoltre, mostrano una Objective Response Rate (ORR), una Progression-Free Survival (PFS) e una Overall Survival (OS) diminuiti, in confronto ai pazienti wild-type. 222 Considerando queste evidenze, la European Medicines Agency e successivamente la US Food and Drug Administration hanno limitato l’uso degli Ac anti-EGFR ai pazienti KRAS wild-type.

Tuttavia, la mutazione di KRAS spiega solo circa il 30-40% dei pazienti non responsivi alla terapia.

Questo ha suggerito un possibile ruolo di altre mutazioni di RAS, mutazioni di BRAF e altri geni codificanti per proteine appartenenti alla via di trasduzione del segnale EGFR/Ras/Raf in grado di determinare resistenza a Cetuximab e Panitumumab.

Nello studio Prime (Douillard et al, Nejm) è stata valutata l’efficacia dell’aggiunta di panitumumab alla prima linea con FOLFOX in 639 pazienti con mCCR senza mutazioni dell’esone 2 di KRAS, ma con altre mutazioni di RAS: codoni 3 e 4 di KRAS e codoni 2,3 e 4 di NRAS. È emerso non solo un potere predittivo negativo rispetto all’efficacia dell’aggiunta di panitumumab alla prima linea con FOLFOX, ma addirittura che l’aggiunta di panitumumab aveva un effetto detrimentale. Sulla scorta di questi risultati, EMA e FDA hanno

ulteriormente ristretto l’utilizzo degli anticorpi anti-EGFR ai pazienti RAS wt, rendendo mandatoria la valutazione non solo dell’esone 2 di KRAS ma anche degli esoni 3 e 4 di KRAS e degli esoni 2, 3 e 4 di NRAS per la prescrizione di questi farmaci.

Nel 2009, uno studio italiano pubblicato sul British Journal of Cancer, ha dimostrato che 8 pazienti con mutazioni dell’esone 3 (codone 61) e dell’esone 4 (codone 146) di KRAS (presenti nell’1-4% dei CCR) erano resistenti al trattamento con chemioterapia più Cetuximab; lo stesso per i 13 pazienti che presentavano mutazione V600E di BRAF,

confrontati coi RAS/BRAF wt (considerando come KRAS wt solo i pazienti con i codoni 12 e 13 wt). Inoltre, tutti e 21 i pazienti dimostravano un peggiore outcome in termini di PFS e OS. 181, 183

Riguardo a questo concetto è dimostrato che l’utilizzo in seconda linea o successive linee di trattamento di un Ac anti-EGFR in pazienti BRAF mutati (V600E) non determini alcun beneficio, mentre non è chiaro se possa ottenerlo in prima linea. 180, 181, 223 Andando però a valutare il beneficio clinico dell’aggiunta degli anti-EGFR in prima linea in questi pazienti, è evidente come questo sia minimo, sia in termini di PFS che di OS. 187 Per questo motivo, nella pratica clinica, si tende comunque a non utilizzare in prima linea un anti-EGFR in pazienti BRAF mutati.

I pazienti BRAF mutati presentano inoltre una prognosi pessima, con durate di sopravvivenza attorno ai 12 mesi. Vista l’aggressività intrinseca di questi tumori, e i risultati incoraggianti

pazienti in grado di ricevere un trattamento più impegnativo è la tripletta FOLFOXIRI in associazione a bevacizumab. Nuove strategie target, che prevedono l’utilizzo di BRAF, EGFR e MEK-inibitori sono attualmente in studio con risultati preliminari interessanti in termini di risposte obiettive, che appaiono tuttavia, purtroppo, piuttosto fugaci e poco durature.

CARATTERISTICHE CLINICHE

• KRAS: i tumori KRAS mutati sono stati associati ad alcune caratteristiche cliniche, quali la localizzazione primaria del tumore al colon destro e il verificarsi più frequentemente di metastasi polmonari ed encefaliche rispetto a quelle epatiche. 224 • BRAF: i tumori BRAF mutati si verificano più frequentemente nei pazienti anziani,

nelle donne e nel colon destro; hanno più frequentemente istotipo mucinoso, microsatelliti instabili e frequenti metastasi linfonodali e peritoneali. 185, 193, 195