3.1. Plonasluoksnės chromatografijos metodikos parinkimas
3.1.1. Ryškiklio parinkimas
Ieškant tinkamiausios plonasluoksnės chromatografijos metodikos, norint identifikuoti tiriamuosius junginius ant chromatografinės plokštelės, reikia pasirinkti tinkamą ryškinimo reagentą, kuris būtų tinkamas visų keturių junginių (nifedipino, propranololio, verapamilio ir diltiazemo) identifikavimui mišinyje. Atlikus eksperimentinius tyrimus, siekiant įvertinti, kuris ryškinimo būdas yra tinkamas visoms medžiagoms identifikuoti, buvo pasirinktas ryškinimas UV spinduliais (254 nm). Identifikuojant UV spinduliais (254 nm) yra aiškiai matomos pilkos spalvos (dėmės ryškumas priklauso nuo koncentracijos) visų nustatinėjamų junginių dėmės ant chromatografinės plokštelės (9 pav.). Ryškinimas jodo garais netinkamas, nes nifedipinas nebuvo identifikuotas (10 pav.)
9 pav. Nifedipino (NE1), propranololio (PE1), verapamilio (VE1), diltiazemo (DE1) dėmės ant chromatografinės plokštelės, apšvietus ją UV šviesa (254 nm)
10 pav. Propranololio (PE1), verapamilio
(VE1), diltiazemo (DE1) dėmės ant
chromatografinės plokštelės ryškinant jodo garais
3.1.2. Tirpiklių sistemos (TS) parinkimas
Atlikus mokslinės literatūros analizę [24, 49-53], nerasta duomenų apie plonasluoksnės chromatografijos metodiką, kurios pagalba vienu metu būtų įmanoma nustatyti nifedipiną, propranololį, verapamilį ir diltiazemą mišinyje. Todėl vykdant eksperimentinius tyrimus, modifikuojant ir išbandant skirtingas tirpiklių sistemas, keičiant tirpiklių santykį, buvo siekiama parinkti tokius tirpiklių mišinius, kurie galėtų atskirti visus junginius mišinyje. Nustatant tinkamiausias tirpiklių sistemas buvo siekiama, kad etaloninių tirpalų sulaikymo rodikliai (Rf) būtų skirtingi, o tiriamųjų medžiagų dėmės nepersidengtų. Atlikus eksperimentinius tyrimus ir palyginus gautas Rf reikšmes, buvo parinktos dvi tirpiklių sistemos, kurios buvo tinkamos junginių kokybiniam įvertinimui mišinyje (11 pav. ir 12 pav.).
11 pav. Sistema TS – 1 nifedipino (NE1), propranololio (PE1), verapamilio (VE1), diltiazemo (DE1) ir jų mišinio (NPVDE1) dėmės apšvietus UV šviesą (254 nm)
12 pav. Sistema TS–2 nifedipino (NE1), propranololio (PE1), verapamilio (VE1), diltiazemo (DE1) ir jų mišinio (NPVDE1) dėmės apšvietus UV šviesą (254 nm)
Bandymai kartoti penkis kartus. Buvo apskaičiuoti aritmetiniai gautų Rf reikšmių vidurkiai, standartiniai nuokrypiai (SD), santykinė paklaida (SE), pasikliautinasis intervalas (5 lentelė).
5 lentelė. Statistinis tiriamųjų junginių (nifedipino, propranololio, verapamilio, diltiazemo) Rf reikšmių vertinimas, naudojant TS – 1 ir TS – 2 tirpiklių sistemas
Nustatyta, kad abiejų tirpiklių sistemų atsikartojimo paklaidos neviršijo leistinos 0,05 ribos, todėl šios dvi tirpiklių sistemos yra tinkamos mišinyje esančių nifedipino, propranololio, verapamilio ir diltiazemo kokybiniam įvertinimui.
3.2. Vaistinių preparatų analizė plonasluoksnės chromatografijos metodu
Parinkus tinkamas tirpiklių sistemas ir medžiagų dėmių ryškinimo būdą, buvo tirti darbiniai nifedipino (N1), propranololio (P1), verapamilio (V1), diltiazemo (D1) ir jų mišinio (NPVD1) tirpalai, pagaminti iš vaistinių preparatų, įsigytų Lietuvos vaistinėse. Darbiniai tirpalai buvo lyginami su etaloniniais nifedipino (NE1), propranololio (PE1), verapamilio (VE1) ir diltiazemo (DE1) ir jų mišinio (NPVDE1) tirpalais. Analizė buvo atlikta naudojant TS – 1 ir TS – 2 sistemas, kaip ryškiklį naudojant UV spindulių lempą (254 nm) (13 pav. ir 14 pav.).
Tirpiklių sistema Tiriamoji medžiaga Rf
vidurkis Standartinis nuokrypis Paklaida Pasikliautinasis intervalas Etilo acetatas – metanolis – ledinė acto rūgštis (16:24:2) (TS – 1) Nifedipinas (NE1) 0,91 0,010 0,005 0,90 – 0,92 Propranololis (PE1) 0,62 0,007 0,003 0,61 – 0,63 Verapamilis (VE1) 0,45 0,007 0,003 0,44 – 0,45 Diltiazemas (DE1) 0,28 0,005 0,002 0,28 – 0,29 Acetonas – metanolis – ledinė acto rūgštis (16:30:1) (TS – 2) Nifedipinas (NE1) 0,93 0,005 0,002 0,92 – 0,93 Propranololis (PE1) 0,71 0,010 0,005 0,70 – 0,72 Verapamilis (VE1) 0,60 0,006 0,003 0,60 – 0,61 Diltiazemas (DE1) 0,43 0,007 0,003 0,42 – 0,43
13 pav. Sistema TS–1 atskirtos ir UV šviesa (254 nm) išryškintos etaloninių nifedipino (NE1), propranololio (PE1), verapamilio (VE1), diltiazemo (DE1), jų mišinio (NPVDE1) ir tiriamųjų
tirpalų N1, P1, V1, D1 ir jų mišinio (NPVD1) dėmės
14 pav. Sistema TS–2 atskirtos ir UV šviesa (254 nm) išryškintos etaloninių nifedipino (NE1), propranololio (PE1), verapamilio (VE1), diltiazemo (DE1), jų mišinio (NPVDE1) ir tiriamųjų
tirpalų N1, P1, V1, D1 ir jų mišinio (NPVD1) dėmės
Analizės metu nustatytos tiriamųjų medžiagų, išskirtų iš vaistinių preparatų, vidutinės Rf reikšmės atitiko pasikliautinuosius intervalus, nustatytus TS – 1 ir TS – 2 sistemose (6 lentelė). Remiantis gautais rezultatais, galima teigti, jog TS – 1 ir TS – 2 sistemos yra tinkamos nifedipino, propranololio, verapamilio ir diltiazemo mišinio analizei bei jų kokybiniam įvertinimui vaistiniuose preparatuose.
6 lentelė. Tiriamųjų medžiagų, išskirtų iš vaistinių preparatų, vidutinės Rf reikšmės ir pasikliautinasis intervalas naudojant TS–1 ir TS–2 tirpiklių sistemas
Tiriamasis mėginys TS – 1 vidutinė Rf reikšmė TS – 1 pasikliautinasis intervalas TS – 2 vidutinė Rf reikšmė TS – 2 pasikliautinasis intervalas Nifedipinas (N1) 0,91 0,90 – 0,92 0,93 0,92 – 0,93 Propranololis (P1) 0,62 0,61 – 0,63 0,71 0,70 – 0,72 Verapamilis (V1) 0,45 0,44 – 0,45 0,60 0,60 – 0,61 Diltiazemas (D1) 0,28 0,28 – 0,29 0,43 0,42 – 0,43
Remiantis etaloninių ir tiriamųjų medžiagų, išskirtų iš vaistinių preparatų, analizės rezultatais tirpiklių sistemos TS – 1 ir TS – 2 buvo panaudotos vaistų mišinio, išskirto iš kraujo plazmos, analizei. Tiriamųjų vaistinių preparatų mišinio kietafazė ekstrakcija iš kraujo plazmos buvo atlikta, pagal anksčiau aprašytą metodiką (2.2.3 skyrius). Ant chromatografinės plokštelės buvo užnešti etaloniniai ir vaistinių preparatų iš kraujo plazmos mišiniai. Analizė buvo atlikta naudojant TS – 1 ir TS – 2 sistemas, kaip ryškiklį naudojant UV spindulius (254 nm) (15 pav. ir 16 pav.).
15 pav. Sistema TS–1. Nifedipino (N), propranololio (P), verapamilio (V), diltiazemo (D) vaistų mišinys, išskirtas iš kraujo plazmos, ir nifedipino (NE1), propranololio (PE1), verapamilio (VE1), diltiazemo (DE1) etaloninis mišinys. Identifikuojama UV šviesa (254 nm)
16 pav. Sistema TS–2. Nifedipino (N), propranololio (P), verapamilio (V), diltiazemo (D) vaistų mišinys, išskirtas iš kraujo plazmos, ir nifedipino (NE1), propranololio (PE1), verapamilio (VE1), diltiazemo (DE1) etaloninis mišinys.
Analizės metu nustatyto tiriamojo vaistų mišinio, išskirto iš kraujo plazmos, vidutinės Rf reikšmės atitiko pasikliautinuosius intervalus, nustatytus TS – 1 ir TS – 2 tirpiklių sistemose (7 lentelė).
7 lentelė. Tiriamųjų medžiagų, išskirto iš kraujo plazmos, vidutinės Rf reikšmės naudojant TS – 1 ir TS – 2 tirpiklių sistemas
Remiantis gautais rezultatais, galima teigti, jog TS – 1 ir TS – 2 sistemos yra tinkamos nifedipino, propranololio, verapamilio ir diltiazemo vaistų mišinio, išskirto iš kraujo plazmos kokybiniam nustatymui.
3.3. Ultraefektyviosios skysčių chromatografijos metodikos parinkimas
Norint parinkti metodiką, kuri būtų tinkama propranololio, diltiazemo, verapamilio ir nifedipino mišinio išskirstymui ir identifikavimui, taip pat ir kraujo plazmoje esančių vaistų mišiniui nustatyti, pirmiausia atlikta išsami mokslinės literatūros šaltinių analizė [35,57-61]. Iš pradžių buvo atliktas mišinio nustatymas, pagal pasirinktą UESC metodiką [62], tačiau buvo nustatyta, kad gautų junginių chromatografinės smailės yra asimetriškos, todėl buvo nuspręsta modifikuoti UESC metodiką ir pritaikyti ją analizuojamo mišinio kokybinei analizei.
Modifikuojant UESC metodiką buvo keistos šios sąlygos: eliuentų sistemoje 0,1 % skruzdžių rūgštis pakeista į 0,05 % trifluoracto rūgštį, pakeistas eliuento gradientinis kitimas ir analizės trukmė, eliuento tėkmės greitis sumažintas iki 0,4 ml/min, kolonėlės temperatūrą sumažinta iki 25 °C. Junginių išskirstymas atliktas naudojant „ACQUITY UPLC BEH C18“ (2,1x50mm x 1,7 µm) chromatografinę kolonėlę, esant 230 nm šviesos bangos ilgiui. Modifikuoto metodo eliento sistema buvo sudaryta iš 0,05% trifluoracto rūgšties vandeninio tirpalo (eliuentas A) ir acetonitrilo (eliuentas B). Eliuavimo būdas – gradientinis. Gradientinis kitimas pateiktas 8 lentelėje. Nustatytas tėkmės greitis – 0,4 ml/min, injekcijos tūris – 1 μl. Kolonėlės temperatūra 25 °C.
Tiriamasis mėginys TS – 1 vidutinė Rf reikšmė TS – 1 pasikliautinasis intervalas TS – 2 vidutinė Rf reikšmė TS – 2 pasikliautinasis intervalas Nifedipinas (N) 0,91 0,90 – 0,92 0,93 0,92 – 0,93 Propranololis (P) 0,63 0,61 – 0,63 0,72 0,70 – 0,72 Verapamilis (V) 0,45 0,44 – 0,45 0,61 0,60 – 0,61 Diltiazemas (D) 0,29 0,28 – 0,29 0,43 0,42 – 0,43
8 lentelė. Chromatografijai naudoto eliuento gradientinis kitimas Laikas (min) Eliuento tekėjimo greitis (ml/min) 0,05 % trifluoracto rūgštis (A) (proc.) Acetonitrilas (B) (proc.) 0 0,4 96 4 01:00 0,4 90 10 08:00 0,4 2 98 11:00 0,4 2 98 12:00 0,4 96 4
Atlikus chromatografinę analizę su etaloninių medžiagų mišiniu naudojant pasirinktą metodiką, gauti šie rezultatai: nustatyti etaloninių medžiagų sulaikymo laikai ir UV spektrai (17 pav.).
17 pav. Propranololio, diltiazemo, verapamilio ir nifedipino etaloninių medžiagų mišinio chromatograma su UV spektrais (junginių aptikimas atliktas esant 230 nm šviesos bangos ilgiui)
Modifikuotos metodikos tinkamumui, kokybiniams ir kiekybiniam tyrimams atlikti, įrodyti būtina atlikti metodikos validaciją.
3.3.1. Ultraefektyviosios skysčių chromatografijos metodikos validacija
Norint ultraefektyviosios skysčių chromatografijos metodiką taikyti tiriamųjų vaistų mišinio (propranololio, diltiazemo, verapamilio ir nifedipino) nustatymui iš kraujo plazmos, būtina įrodyti metodikos tinkamumą ją validuojant. Remiantis ICH (International Conference on Harmonisation) analitinių procedūrų validacijos gairėmis buvo pasirinkti ir įvertinti šie parametrai [66]:
1) Specifiškumas (angl. Specificity) 2) Rezultatų glaudumas (angl. Precision)
rezultatų pakartojamumas (angl. Repeatability)
rezultatų tarpinis preciziškumas (angl. Intermediate Precision) 3) Tiesiškumas (angl. Linearity)
4) Ribos (angl. Range)
aptikimo riba (angl. Limit of detection) nustatymo riba (angl. Limit of quantitation)
3.3.1.1. Specifiškumas
Metodikos specifiškumas yra gebėjimas vienareikšmiškai nustatyti analitės buvimą [66]. Norint įvertinti pasirinktos metodikos specifiškumą buvo chromatografuojamas tiriamųjų medžiagų tirpiklio mėginys (eliuentas), tiriamasis mėginys (tiriamųjų vaistų mišinio ekstraktas iš kraujo plazmos), kraujo plazmos matricos mėginys (ekstraktas iš kraujo plazmos be vaistų mišinio), etaloninis palyginamasis mėginys (etaloninis mišinys). Junginių įvertinimas atliktas prie 230 nm šviesos bangos ilgio. Gautos chromatogramos pateikiamos 18 pav.
18 pav. a. Eliuentas, b. Tiriamojo vaistų mišinio ekstraktas iš kraujo plazmos, c. Kraujo plazmos matricos mėginys d. Etaloninis mišinys (junginių aptikimas atliktas prie 230 nm bangos ilgio)
Iš pateiktos chromatogramos matyti, kad tirpiklis, kuris naudojamas kaip gradientinė eliuentų sistema (18 pav. a.), netrukdo vaistinių medžiagų nustatymui. O atlikus kraujo plazmos matricos mėginio (be tiriamųjų junginių mišinio) chromatografinį nustatymą (18 pav. c.), nustatyta, jog nėra smailių, kurios galėtų trukdyti vaistinių medžiagų analizei (nėra matricos efekto). Lyginant etaloninio mišinio (18 pav. d.) ir tiriamojo vaistų mišinio, išskirto iš kraujo plazmos, (18 pav. b.) smailes pagal sulaikymo laikus matyti, kad jos sutampa.
Taip pat buvo užregistruoti etaloninių ir tiriamųjų medžiagų smailių UV absorbcijos spektrai, ir palyginti su literatūroje pateiktais etaloninių medžiagų UV šviesos sugerties spektrais (8 lentelė). Buvo nustatyta, kad jie sutampa, todėl galima daryti išvadą, kad pasirinktos UESC metodikos specifiškumas tenkina visus reikalavimus.
8 lentelė. A – Propranololio, diltiazemo, verapamilio ir nifedipino literatūroje pateikti UV absorbcijos spektrai; B – UV absorbcijos spektrai gauti išmatavus fotodiodų matricos detektorium
[25] Jungi
nys
A Literatūroje pateikti etaloniniai UV absorbcijos spektrai
B Gauti išmatavus fotodiodų matricos detektoriumi Pr op ran olol is Diltiaz em as Ve rap amili s Nife d ip in as
3.3.1.2. Rezultatų glaudumas
Analitinės metodikos rezultatų glaudumas – rezultatų artumas, gaunamas atliekant matavimų seriją, kai yra naudojamas tas pats mėginys, vienodomis analizės sąlygomis [66]. Glaudumas yra įvertintas: pakartojamumu ir tarpiniu preciziškumu. Pakartojamumas yra apskaičiuojamas tą pačią dieną viena po kitos atliekant 6 pakartojimus, tomis pačiomis analizės sąlygomis, naudojant tą patį vaistinių medžiagų etalonų mišinį. Vėliau yra apskaičiuojamas variacijos koeficientas, kitaip vadinamas santykiniu standartiniu nuokrypiu (SSN), kuris išreiškiamas procentais, smailės plotui ir sulaikymo laikui. Jis turi būti ne didesnis kaip 5 proc (9 lentelė).
Tarpinis preciziškumas yra įvertinamas analizuojant tiriamąją analitę 3 dienas iš eilės, atliekant po 6 injekcijas, ankščiau aprašytomis sąlygomis. Iš gautų duomenų apskaičiuojami SSN smailės plotui ir sulaikymo trukmei (9 lentelė).
9 lentelė. Metodikos rezultatų glaudumo įvertinimas
Preparatas
Pakartojamumas Tarpinis preciziškumas
SSN smailės plotui (proc.) SSN sulaikymo laikui (proc.) SSN smailės plotui (proc.) SSN sulaikymo laikui (proc.) Propranololis 1,2 0,2 1,4 0,3 Diltiazemas 0,6 0,1 0,7 0,3 Verapamilis 1,6 0,1 1,8 0,3 Nifedipinas 1,2 0,1 1,3 0,2
Pagal gautus rezultatus matome, kad analičių pakartojamumas SSN smailės plotui skiriasi. Propranololio yra 1,2 proc., diltiazemo 0,6 proc., verapamilio 1,6 proc., nifedipino 1,2 proc. Tarpinis preciziškumas SSN smailės plotui yra didesnis. Propranololio 1,4 proc., diltiazemo 0,7 proc., verapamilio 1,8 proc., nifedipino 1,3 proc. Analičių pakartojamumas SSN sulaikymo laikui skiriasi nedaug. Propranololio 0,2 proc., diltiazemo, verapamilio, nifedipino 0,1 proc. Tarpinis preciziškumo SSN sulaikymo laikui yra didesnis. Propranololio, diltiazemo, verapamilio 0,3 proc., nifedipino 0,2 proc.
Apibendrinus gautus rezultatus matome, kad rezultatų pakartojamumas atitinka keliamus reikalavimus, nes SSN sulaikymo laikui ir smailės plotui procentinė išraiška neviršija nustatytos ribos (≤5 proc.). Gauti tarpinio preciziškumo rezultatai atitinka keliamus reikalavimus, nes SSN sulaikymo laikui ir smailės plotui neviršija normos ribos (≤10 proc.). Remiantis šiais kriterijais metodas yra tinkamas pasirinktų vaistinių medžiagų nustatymui.
3.3.1.3. Tiesiškumas ir ribos
Nustatytose ribose tiesiškumas nusako smailės ploto tiesinę priklausomybę nuo analitės koncentracijos [66]. Tiesiškumas įvertintas kalibravimo kreivės metodu (19-22 pav.). Etaloninių medžiagų propranololio, diltiazemo, verapamilio kalibraciniai grafikai yra sudaryti 0,1 – 0,003125 mg/ml ribose, o nifedipino kalibracinis grafikas sudarytas 0,1 – 0,00625 mg/ml ribose. Nustatomas koreliacijos koeficientas R2, kurio reikšmė turi būti ne mažesnė kaip 0,98 (10 lentelė).
10 lentelė. Propranololio, diltiazemo, verapamilio ir nifedipino kalibracinių kreivių charakteristikos Preparatas Sulaikymo laikas (min) Koreliacijos koeficientas R2 Kalibracinės kreivės lygtis Tiesiškumo ribos (mg/ml) Propranololis 4,105 0,9991 y = 2,87∙106 x – 8,72∙103 0,1 – 0,003125 mg/ml Diltiazemas 4,416 0,9995 y = 7,07∙106 x – 1,95∙104 0,1 – 0,003125 mg/ml Verapamilis 4,770 0,9999 y = 4,63∙106 x – 9,83∙103 0,1 – 0,003125 mg/ml Nifedipinas 5,117 0,9992 y = 1,70∙106 x – 3,69∙104 0,1 – 0,00625 mg/ml
Propranololio, diltiazemo, verapamilio, nifedipino kalibraciniai grafikai (19-22 pav.) įrodo, kad analizuotame koncentracijų intervale smailės ploto priklausomybė nuo medžiagos koncentracijos yra tiesiška. Etaloninių medžiagų koreliacijos koeficiento reikšmės yra didesnės nei 0,99 ir artimos 1 (propranololio 0,9991; diltiazemo 0,9995; verapamilio 0,9999; nifedipino 0,9992). Galima daryti išvadą, kad UESC metodikos tiesiškumas atitinka visus keliamus reikalavimus. Pagal šį parametrą UESC taip pat yra tinkama kiekybiniam pasirinktų vaistinių medžiagų tyrimui.
19 pav. Propranololio kalibracinė kreivė, kurios lygtis y = 2,87∙106x – 8,72∙103
20 pav. Diltiazemo kalibracinė kreivė, kurioslygtis y = 7,07∙106x – 1,95∙104
21 pav. Verapamilio kalibracinė kreivė, kurios lygtis y = 4,63∙106x – 9,83∙103
22 pav. Nifedipino kalibracinė kreivė, kurios lygtis y = 1,70∙106x – 3,69∙104
3.3.1.4. Aptikimo ir nustatymo ribos
Aptikimo riba – tai mažiausias analitės kiekis mėginyje, kuris gali būti aptinkamas, bet nebūtinai tiksliai nustatomas kiekybiškai. Nustatymo riba – tai mažiausias analitės kiekis mėginyje, kuris gali būti kiekybiškai įvertinamas tiksliai ir teisingai [66]. Propranololio, diltiazemo, verapamilio ir nifedipino aptikimo ir nustatymo ribos vertinamos, lyginant analitės smailės aukštį su bazinės linijos triukšmu. Junginių aptikimo riba yra nustatoma, kai smailės aukščio ir bazinės linijos triukšmo
santykis yra 3:1, o nustatymo riba įvertinama, kai smailės aukščio ir bazinės linijos triukšmo santykis – 10:1 [66].
Propranololio, diltiazemo, verapamilio ir nifedipino aptikimo ir nustatymo ribų rezultatai yra pateikiami 11 lentelėje.
11 lentelė. Propranololio, diltiazemo, verapamilio, nifedipino aptikimo ir nustatymo ribos
Preparatas Aptikimo riba μg/ml Nustatymo riba µg/ml
Propranololis 0,21 0,71
Diltiazemas 0,84 2,8
Verapamilis 3,2 10,6
Nifedipinas 1,8 5,9
Gauti rezultatai parodė, kad tirtų junginių aptikimo ir nustatymo ribos skiriasi. Mažiausios aptikimo ir nustatymo ribos yra propranololio, o didžiausios – verapamilio.
Įvertinus pasirinktas validacijos charakteristikas ir remiantis gautais rezultatais, galima daryti išvadą, kad UESC metodika yra tinkama propranololio, diltiazemo, verapamilio ir nifedipino vaistų mišiniui identifikuoti ir atlikti kiekybinį nustatymą. Validuota UESC metodika bus taikoma propranololio, diltiazemo, verapamilio ir nifedipino vaistų mišinio kokybiniam nustatymui po ekstrakcijos iš kraujo plazmos.
3.4. Vaistų mišinio rezultatai po ekstrakcijos iš kraujo plazmos
Buvo atlikta tiriamųjų vaistų mišinio (propranololio, diltiazemo, verapamilio, nifedipino) ekstrakcija iš kraujo plazmos, junginiai identifikuoti pagal etaloninių junginių mišinio validuotą UESC metodiką. Pateikiamos gautos chromatogramos (23 pav. A), taip pat pateikiama tridimencinė vaistų mišinio, po ekstrakcijos iš kraujo plazmos, fotodiodų matricos detektoriaus chromatograma (23 pav. B). Tiriamųjų vaistinių medžiagų identifikavimas buvo atliktas palyginamuoju metodu. Buvo lyginama etaloninių junginių mišinio ir tiriamųjų vaistų mišinio, išskirto iš kraujo plazmos, analičių smailės pagal sulaikymo laikus (12 lentelė) ir UV šviesos absorbcijos spektrus (8 lentelė). UV spektras matuojamas prie 230 nm šviesos bangos ilgio.
23 pav. A a. Etaloninių junginių mišinys, b. Tiriamųjų vaistų mišinys, išskirtas iš kraujo plazmos. B Tridimencinė vaistų mišinio, išskirto iš kraujo plazmos, chromatograma
12 lentelė. Propranololio, diltiazemo, verapamilio, nifedipino etaloninių medžiagų mišinio ir tiriamųjų vaistų mišinio, išskirto iš kraujo plazmos, komponentų smailių sulaikymo laikas (min)
Chromatograma Propranololis (min) Diltiazemas (min) Verapamilis (min) Nifedipinas (min) Tiriamųjų vaistų mišinys,
išskirtas iš kraujo plazmos. (23 pav. A a. )
4,116 4,428 4,780 5,147
Etaloninių junginių mišinys
(23 pav. A b.) 4,105 4,416 4,770 5,117
Remiantis gautais rezultatais, buvo nustatyta, kad propranololio, diltiazemo, verapamilio ir nifedipino etaloninių medžiagų mišinio ir tiriamųjų vaistų mišinio, išskirto iš kraujo plazmos, komponentų UV šviesos absorbcijos spektrai ir junginių analičių smailės pagal sulaikymo laikus sutampa. Dėl to galima teigti, kad tiriamosios medžiagos atitinka standartines medžiagas. Ši metodika yra tinkama propranololio, diltiazemo, verapamilio ir nifedipino vaistų mišinio išskirstymui ir identifikavimui iš kraujo plazmos.