VAISTŲ NUO HIPERTENZIJOS MIŠINIO ANALIZĖ KRAUJO PLAZMOJE CHROMATOGRAFINIAIS METODAIS

MEDICINOS AKADEMIJA FARMACIJOS FAKULTETAS

ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA

LUKAS VALINTĖLIS

VAISTŲ NUO HIPERTENZIJOS MIŠINIO ANALIZĖ KRAUJO

PLAZMOJE CHROMATOGRAFINIAIS METODAIS

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovė Doc. dr. Daiva Kazlauskienė

MEDICINOS AKADEMIJA FARMACIJOS FAKULTETAS

ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA

TVIRTINU:

Farmacijos fakulteto dekanas prof. dr. Vitalis Briedis Data:

VAISTŲ NUO HIPERTENZIJOS MIŠINIO ANALIZĖ KRAUJO

PLAZMOJE CHROMATOGRAFINIAIS METODAIS

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovė: Doc. dr. Daiva Kazlauskienė _________ _______

(Parašas) (Data)

Recenzentas Darbą atliko Magistrantas Data Lukas Valintėlis

Data

SANTRAUKA ... 5

SUMMARY ... 6

SANTRUMPOS ... 7

ĮVADAS ... 8

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 9

1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 10

1.1. Diltiazemo, verapamilio, nifedipino ir propranololio vartojimo paplitimas ... 10

1.1.1. Diltiazemo, verapamilio, nifedipino ir propranololio vartojimo paplitimas Lietuvoje ... 10

1.1.2. Diltiazemo, verapamilio, nifedipino, propranololio vartojimo paplitimas ir palyginimas su kitomis šalimis ... 11

1.2. Kalcio kanalų blokatorių ir beta adrenoreceptorių blokatorių apsinuodijimo statistika ... 14

1.3. Kalcio kanalų blokatorių ir beta adrenoreceptorių blokatorių farmakologinis poveikis ... 15

1.3.1. Diltiazemo, verapamilio ir nifedipino farmakologinis poveikis ... 15

1.3.2. Propranololio farmakologinis poveikis ... 16

1.4. Kalcio kanalų blokatorių ir beta adrenoreceptorių blokatorių fizikocheminės savybės ir farmakokinetika ... 16

1.4.1. Diltiazemo hidrochloridas ... 16

1.4.2. Verapamilio hidrochloridas ... 17

1.4.3. Nifedipinas ... 18

1.4.4. Propranololio hidrochloridas ... 19

1.5. Kalcio kanalų blokatorių ir beta adrenoreceptorių blokatorių toksiškumas ... 20

1.5.1. Diltiazemo, verapamilio ir nifedipino toksiškumas ... 20

1.5.2. Propranololio toksiškumas ... 21

1.6. Diltiazemo, verapamilio, nifedipino ir propranololio kokybinis vertinimas plonasluoksnės chromatografijos metodu ... 22

1.6.1.Plonasluoksnė chromatografija (PC) ... 22

1.6.2. Plonasluoksnės chromatografijos metodikos, tinkamos identifikuoti diltiazemą, verapamilį, nifedipiną ir propranololį ... 22

1.7. Diltiazemo, verapamilio, nifedipino ir propranololio kokybinis vertinimas ultraefektyviosios skysčių chromatografijos metodu ... 24

propranololį, verapamilį arba diltiazemą ... 24

2. EKSPERIMENTINĖ DALIS ... 26

2.1. Tyrimo objektas ... 26

2.2. Kokybinis vertinimas plonasluoksnės chromatografijos (PC) metodu ... 26

2.2.1. Etaloniniai tirpalai ... 26

2.2.2. Tiriamieji tirpalai ... 26

2.2.3. Kietafazės ekstrakcijos (KFE) iš kraujo plazmos metodika ... 27

2.2.4. Plonasluoksnės chromatografijos metodika ... 27

2.3. Kokybinis vertinimas ultraefektyviosios skysčių chromatografijos (UESC) metodu ... 28

2.3.1. Etaloniniai tirpalai ... 28

2.3.2. Tiriamieji tirpalai ... 28

2.3.3. Skysčių – skysčių ekstrakcijos (SSE) iš kraujo plazmos metodika ... 29

2.3.4. Ultraefektyviosios skysčių chromatografijos metodika ... 29

2.4. Duomenų apdorojimas ... 30

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 31

3.1. Plonasluoksnės chromatografijos metodikos parinkimas ... 31

3.1.1. Ryškiklio parinkimas ... 31

3.1.2. Tirpiklių sistemos (TS) parinkimas ... 32

3.2. Vaistinių preparatų analizė plonasluoksnės chromatografijos metodu ... 33

3.3. Ultraefektyviosios skysčių chromatografijos metodikos parinkimas ... 36

3.3.1. Ultraefektyviosios skysčių chromatografijos metodikos validacija ... 38

3.3.1.1. Specifiškumas ... 38

3.3.1.2. Rezultatų glaudumas ... 42

3.3.1.3. Tiesiškumas ir ribos ... 43

3.3.1.4. Aptikimo ir nustatymo ribos ... 44

3.4. Vaistų mišinio rezultatai po ekstrakcijos iš kraujo plazmos ... 43

4. IŠVADOS ... 45

5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 46

6. LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 47

MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO TEMA PASKELBTOS PRANEŠIMŲ TEZĖS ... 53

VAISTŲ NUO HIPERTENZIJOS MIŠINIO ANALIZĖ KRAUJO PLAZMOJE

CHROMATOGRAFINIAIS METODAIS

L. Valintėlio magistro baigiamasis darbas/ mokslinė vadovė Doc. dr. D. Kazlauskienė; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Farmacijos fakulteto, Analizinės ir toksikologinės chemijos katedra. – Kaunas, 2016.

Raktiniai žodžiai: diltiazemas, verapamilis, nifedipinas, propranololis, plonasluoksnė chromatografija, ultraefektyvioji skysčių chromatografija, validacija, ekstrakcija, kraujo plazma.

Darbo tikslas: Pritaikyti plonasluoksnės ir ultraefektyviosios skysčių chromatografijos metodus diltiazemo, verapamilio, nifedipino ir propranololio vaistų mišinio, išskirto iš kraujo plazmos, kokybiniam nustatymui.

Darbo uždaviniai: Parinkti tinkamiausią plonasluoksnės chromatografijos metodiką, kuri būtų tinkama diltiazemo, verapamilio, nifedipino ir propranololio vaistų mišinio komponentų atskyrimui ir kokybiniam įvertinimui. Validuoti pasirinktą ultraefektyviosios skysčių chromatografijos metodiką, kuri būtų tinkama diltiazemo, verapamilio, nifedipino ir propranololio vaistų mišinio komponentų atskyrimui, identifikavimui ir kiekybiniam įvertinimui. Išskirti antihipertenzinių vaistų mišinį iš kraujo plazmos ir atlikti kokybinį įvertinimą plonasluoksnės ir ultraefektyviosios skysčių chromatografijos metodais.

Tyrimo objektas: Kraujo plazmos mėginiai su vaistinėmis medžiagomis: diltiazemo hidrochloridu, verapamilio hidrochloridu, nifedipinu, propranololio hidrochloridu.

Metodai: plonasluoksnė chromatografija, ultraefektyvioji skysčių chromatografija, skysčių – skysčių ir kietafazė ekstrakcija.

THE ANALYSIS OF ANTIHYPERTENSIVES PHARMACEUTICALS

MIXTURE IN HUMAN PLASMA USING CHROMATOGRAPHIC METHODS

Lukas Valintėlis Master's thesis/ Scientific supervisor Doc. dr. Daiva Kazlauskienė; Lithuanian University of Health Sciences, Academy of Medicine, Faculty of Pharmacy, Analytical and Toxicological Chemistry Departament. Kaunas, 2016.

Key words: diltiazem, verapamil, nifedipine, propranolol, thin layer chromatography, ultra performance liquid chromatography, validation, extraction, blood plasma

Aim: To apply thin layer and ultra performance liquid chromatography methods for drug mixture of diltiazem, verapamil, nifedipine, propranolol, extracted from blood plasma for their qualitative determination.

Tasks: To choose the most appropriate thin layer chromatography methodology which will be capable to separate and qualitatively evaluate the drug mixture of diltiazem, verapamil, nifedipine and propranolol. To validate selected ultra performance liquid chromatography methodology which will be capapable to separate, identify and quantify drug mixture of diltiazem, verapamil, nifedipine and propranolol. To extract antihypertensive drugs mixture from blood plasma and perform qualitative assessment that has been carried out by thin layer and ultra performance liquid chromatography methods.

Object: Blood plasma samples with drug substances: diltiazem hydrochloride, verapamil hydrochloride, nifedipine, propranolol hydrochloride.

Methods: thin layer chromatography, ultra performance liquid chromatography, liquid – liquid extraction, solid phase extraction.

AKS – arterinis kraujo spaudimas

DDD – nustatyta paros vaisto dozė, kuri yra vaisto suvartojimo techninis vienetas ESC – efektyvioji skysčių chromatografija

ICH – tarptautinė harmonizavimo konferencija KFE – kietafazė ekstrakcija

KKB – kalcio kanalų blokatoriai PC – plonasluoksnė chromatografija Rf – sulaikymo rodiklis

R2 – koreliacijos koeficientas SSE – skysčių-skysčių ekstrakcija SN – standartinis nuokrypis

SSN – santykinis standartinis nuokrypis TS – tirpiklių sistema

UV – ultravioletinė šviesa

ĮVADAS

Lietuvoje 2015 metais kraujotakos sistemos ligos buvo pagrindinė priežastis, nuo kurios mirė daugiau nei pusė gyventojų, t.y., 56,5 % [1]. Dėl arterinės hipertenzijos Lietuvoje 2015 m. mirė 642 gyventojai [1]. Remiantis Valstybinės vaistų kontrolės tarnybos duomenimis, Lietuvoje, širdies ir kraujagyslių sistemą veikiantys medikamentai sudaro net 41 % visų vartojamų vaistų, tai yra plačiausiai vartojama vaistų grupė Lietuvoje [2]. Tais pačiais duomenimis 2011 – 2015 m. laikotarpiu vaistinių preparatų suvartojimas Lietuvoje per penkerius metus išaugo 20,1 % [2].

Toks didelis širdies ir kraujagyslių sistemą veikiančių vaistų vartojimas yra susijęs ir su padidėjusio apsinuodijimo jais rizika. Ypač sunkūs yra apsinuodijimai beta adrenoreceptorių blokatoriais (propranololiu) ir kalcio kanalų blokatoriais (verapamiliu, mažiau – diltiazemu). Jiems tenka 65 % mirčių, kurias sukelia apsinuodijimai vaistais nuo širdies ir kraujagyslių ligų [3]. Šie apsinuodijimai yra galimi dėl neteisingai pavartotos vaisto dozės, galimo tyčinio perdozavimo, aplaidumo arba pasireiškusios vaistų sąveikos.

Apsinuodijimą sukėlusioms medžiagoms nustatyti reikalingi greiti, atrankūs ir efektyvūs analizės metodai, kurie iš kraujo plazmos gebėtų identifikuoti keletą medžiagų vienos analizės metu, taip toksikologinės laboratorijos darba taptų efektyvesnis. Tokiai analizei atlikti būtinas mėginio paruošimo etapas iš kraujo plazmos. Moksliniuose šaltiniuose galima rasti daug informacijos apie atskirų antihipertenzinių preparatų tyrimus, nustatymą kraujo plazmoje, tačiau duomenų apie jų nustatymą mišiniuose trūksta.

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI

Darbo tikslas: Pritaikyti plonasluoksnės ir ultraefektyviosios skysčių chromatografijos metodus diltiazemo, verapamilio, nifedipino ir propranololio vaistų mišinio, išskirto iš kraujo plazmos, kokybiniam nustatymui.

Darbo uždaviniai:

1. Parinkti tinkamiausią plonasluoksnės chromatografijos metodiką, kuri būtų tinkama diltiazemo, verapamilio, nifedipino ir propranololio vaistų mišinio komponentų atskyrimui ir kokybiniam įvertinimui.

2. Validuoti pasirinktą ultraefektyviosios skysčių chromatografijos metodiką, kuri būtų tinkama diltiazemo, verapamilio, nifedipino ir propranololio vaistų mišinio komponentų atskyrimui, identifikavimui ir kiekybiniam įvertinimui.

1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1. Diltiazemo, verapamilio, nifedipino ir propranololio vartojimo paplitimas

1.1.1. Diltiazemo, verapamilio, nifedipino ir propranololio vartojimo paplitimas

Lietuvoje

Remiantis pasaulio sveikatos organizacija (PSO), vaistų suvartojimui šalyje apskaičiuoti yra rekomenduojama naudoti tarptautiniu lygiu pripažintą Anatominę terapinę cheminę vaistų klasifikaciją ir nustatytų paros dozių (ATC/NPD) (angl. ATC/DDD) metodologiją. Tai leidžia įvertinti ir palyginti vaistų suvartojimą tarp skirtingų valstybių, vietovių, atskirų gydymo įstaigų, taip pat įvertinti vaistų skyrimo ir suvartojimo tendencijas [2,4]. Vaistų suvartojimas yra pateikiamas DDD (PSO nustatyta vidutinė terapinė dienos (paros) dozė) skaičiumi, tenkančiu 1000 gyventojų per vieną dieną [2,5]. Remiantis Valstybinės vaistų kontrolės tarnybos (VVKT) pateikta statistika, 2015 metais vaistinių preparatų suvartojimas Lietuvoje per penkerius metus išaugo nuo 885 DDD/1000 gyventojų/per dieną (2011m.) iki 1063 DDD/1000 gyventojų/per dieną (2015m.) [2]. Iš šių preparatų širdies ir kraujagyslių sistemą veikiančių vaistų (C) (pagal ATC klasifikaciją) suvartojimas 2015 m. siekė 439,557 DDD/1000gyv./per dieną. Tai yra labiausiai vartojama vaistų grupė Lietuvoje. Palyginus 2011-2015 m. laikotarpį, širdies ir kraujagyslių sistemą veikiančių vaistų suvartojimas padidėjo 17,69 %, su 2011m. buvusiu 373,159 DDD/1000gyv./per dieną suvartojimu [2].

Kalcio kanalų blokatoriai (KKB) pagal ATC klasifikaciją yra priskiriami C08 terapiniam pogrupiui. Bendras kalcio kanalų blokatorių suvartojimas 2015 m. siekė 32,231 DDD/1000gyv./per dieną, tačiau buvo 11 % mažesnis, jeigu lyginsime su 2011m. suvartotu 36,373 DDD/1000gyv./per dieną (1 lentelė). Diltiazemas pagal ATC klasifikaciją priskiriamas kalcio kanalų blokatoriams, selektyviems širdžiai (C08D). Diltiazemo suvartojimas Lietuvoje 2011 m. siekė 2,377 DDD/1000gyv./per dieną, tačiau lyginant su 2015m. pastebėtas diltiazemo vartojimo sumažėjimas 27,8% iki 1,716 DDD/1000gyv./per dieną (1 lentelė). Verapamilis taip pat yra priskiriamas kalcio kanalų blokatoriams, selektyviems širdžiai (C08D). Jo suvartojimas 2015 m. siekė 2,086 DDD/1000gyv./per dieną, o palyginus su 2011m. buvusiu 1,619 DDD/1000gyv./per dieną, matomas verapamilio vartojimo padidėjimas 24,1 %. Nifedipinas pagal ATC klasifikaciją priskiriamas kalcio kanalų blokatoriams, selektyviems kraujagyslėms (C08C). Nifedipino 2011 m. buvo suvartojama 0,186 DDD/1000gyv./per dieną (1 lentelė). Palyginus 2011m. ir 2015 m, buvo pastebėtas nedidelis nifedipino vartojimo sumažėjimas 8,6% iki 0,170 DDD/1000gyv./per dieną [2].

propranololio, kuris yra neselektyvus beta adrenoblokatorius (C07AA), suvartojimas 2015 m. buvo tik 0,229 DDD/1000gyv./per dieną. Vis dėl to propranololio suvartojimas padidėjo 148.9 % iki 0,092 DDD/1000gyv./per dieną [2].

Diltiazemo, verapamilio, nifedipino ir propranololio vaistų suvartojimas 2011-2015 metais pateikiamas ataskaitoje (1 lentelė).

1 lentelė. Diltiazemo, verapamilio, nifedipino ir propranololio vaistų suvartojimas Lietuvoje 2011 – 2015 metais (šaltinis: VVKT ataskaita apie vaistų suvartojimą 2015 metais) [2]

ATC

kodas Pavadinimas

DDD /1000 Lietuvos gyventojų/ per dieną 2011 metai 2012 metai 2013 metai 2014 metai 2015 metai

C08 Kalcio kanalų blokatoriai 36,373 37,884 36,871 36,120 32,231

C08C Kalcio kanalų blokatoriai, _{selektyvūs kraujagyslėms} 32,377 33,702 32,814 32,199 28,429

C08CA05 Nifedipinas (DDD 30 mg) 0,186 0,189 0,186 0,179 0,170

C08D Kalcio kanalų blokatoriai,

selektyvūs širdžiai 3,996 4,182 4,057 3,921 3,802

C08DA01 Verapamilis (DDD 0,24 g) 1,619 1,827 1,855 1,838 2,086

C08DB01 Diltiazemas (DDD 0,24 g) 2,377 2,355 2,202 2,083 1,716

C07 Beta adrenoblokatoriai 51,352 60,190 65,580 71,055 71,601

C07AA _{adrenoreceptorių blokatoriai} Neselektyvieji beta 0,092 0,133 0,161 0,201 0,229

C07AA05 Propranololis (DDD 16 g) 0,092 0,133 0,161 0,201 0,229

1.1.2. Diltiazemo, verapamilio, nifedipino, propranololio vartojimo paplitimas ir

palyginimas su kitomis šalimis

Tam, kad būtų įvertinti diltiazemo, propranololio, nifedipino ir verapamilio vaistinių preparatų vartojimo pokyčiai (2011 – 2015 m.) laikotarpiu, buvo išanalizuoti Latvijos (2011 – 2015m.), Estijos (2011 – 2015m.), Danijos (2011 – 2015m.) ir Norvegijos (2011 – 2015m.) vaistų suvartojimo ataskaitose pateikti duomenys, kurie buvo lyginami su Lietuvos (2011 – 2015 m.) pateiktais duomenimis.

DDD/1000gyv./per dieną (2015m.) [6]. Estijoje taip pat buvo pastebėtas diltiazemo vartojimo sumažėjimas nuo 2011m. buvusio 0,11 DDD/1000gyv./per dieną iki 0,09 DDD/1000gyv./per dieną 2015m. [7,8]. Danijoje diltiazemo vartojimo sumažėjimas 42 % iš visų lygintų šalių buvo didžiausias t.y nuo 2011m. buvusio 1,4 DDD/1000gyv./per dieną iki 2015m. 0,80 DDD/1000gyv./per dieną [9]. Norvegijoje taip pat sumažėjo 26,1 % iki 0,65 DDD/1000gyv./per dieną 2015 m [10]. Palyginus Baltijos šalių diltiazemo suvartojimą su Norvegijos ir Danijos diltiazemo suvartojimu 2011-2015m. laikotarpiu matome, kad visų šalių diltiazemo suvartojimas stabiliai mažėjo (1 pav.). Lietuva pagal diltiazemo suvartojimą buvo pirmoje vietoje iš visų lyginamų šalių, o Estija buvo paskutinėje vietoje.

1 pav. Diltiazemo suvartojimas išreikštas DDD/1000 gyv./dieną 2011 – 2015 metais

Baltijos šalyse propranololio suvartojimas Latvijoje 2015 m. siekė 0,35 DDD/1000gyv./per dieną, o Estijoje 0,50 DDD/1000gyv./per dieną (2 pav.) [6–8]. Lyginant su 2011 metų duomenimis, buvo pastebimas 2,8 % diltiazemo vartojimo sumažėjimas Latvijoje ir 25 % augimas Estijoje. Didžiausias propranololio vartojimo sumažėjimas matomas Norvegijoje. 2015 m. propranololio Norvegijoje buvo suvartota 39 % mažiau palyginus su 2011 m. kai jo buvo vartojama 0,81 DDD/1000gyv./per dieną [10]. Iš visų lygintų šalių Danijoje propranololio yra suvartojama daugiausiai t.y. 1,6 DDD/1000gyv./per dieną 2015m, vis dėlto buvo pastebėtas vartojimo sumažėjimas 5,9 % 2011-2015m. laikotarpiu [9]. Paveikslėlyje matoma, kad iš visų analizuojamų šalių Lietuvoje, Latvijoje, taip pat ir Estijoje propranololio yra suvartojama mažiausiai. Propranololio suvartojimo skirtumas tarp Danijos ir Lietuvos 2015m. siekia beveik 7 kartus.

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5

Lietuva Latvija Estija Norvegija Danija

2 pav. Propranololio suvartojimas išreikštas DDD/1000 gyv./dieną 2011 – 2015 metais Palyginus Lietuvos, Latvijos, Estijos, Danijos ir Norvegijos nifedipino suvartojimą matyti, kad iš visų valstybių nifedipino daugiausiai yra suvartojama Norvegijoje t.y 8,78 DDD/1000gyv./per dieną 2015m (3 pav.) [10]. Norvegija buvo vienintelė analizuota šalis, kurioje nifedipino suvartojimas didėjo. Norvegijoje nifedipino suvartojimas palyginus su 2011m. buvusiu 7,69 DDD/1000gyv./per dieną padidėjo 14,2%. Tuo tarpu Latvijoje, Estijoje ir Danijoje nifedipino suvartojimas 2011-2015m. mažėjo. Latvijoje jis sumažėjo 29,3 % nuo 2011m. buvusio 1,50 DDD/1000gyv./per dieną iki 1,06 DDD/1000gyv./per dieną [6]. Estijoje sumažėjo 38,3 % nuo 2011m. buvusio 2,82 DDD/1000gyv./per dieną iki 1,74 DDD/1000gyv./per dieną [7,8]. Danijoje nifedipino 2011 metais buvo suvartojama 1,70 DDD/1000gyv./per dieną, o 2015 metais sumažėjo iki 1,30 DDD/1000gyv./per dieną [9]. Iš aptartų valstybių mažiausiais nifedipinas buvo vartojamas Lietuvoje – 0,17 DDD/1000gyv./per dieną (2015 m.).

3 pav. Nifedipino suvartojimas išreikštas DDD/1000 gyv./dieną 2011 – 2015 metais

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8

Lietuva Latvija Estija Norvegija Danija

2011 2012 2013 2014 2015 0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0

Lietuva Latvija Estija Norvegija Danija

Iš pateiktų Baltijos šalių, Norvegijos ir Estijos vaistų suvartojimo ataskaitų, matyti, kad verapamilio vartojimas Latvijoje sumažėjo 17,1 % nuo 0,41 DDD/1000gyv./per dieną 2011m. iki 0,34 DDD/1000gyv./per dieną (4 pav.) [6]. Estijoje verapamilio pokytis nebuvo žymus, 2011-2015m. laikotarpiu jis sumažėjo 4 % nuo 2011m. buvusio 2,24 DDD/1000gyv./per dieną [4,5]. Iš visų aptariamų šalių, Danijoje verapamilis yra vartojamas daugiausiai, tačiau ir ten yra pastebimas jo sumažėjimas 18,8% nuo 2011m. buvusio 3,20 DDD/1000gyv./per dieną 2011m [9]. Norvegijoje verapamilio suvartojimas taip pat sumažėjo 22,9 %, kai 2011m. buvo suvartojama 2,40 DDD/1000gyv./per dieną, o 2015m. 1,85 DDD/1000gyv./per dieną [10]. Lietuvoje verapamilio yra vartojama panašiai, kaip ir kitose valstybėse, išskyrus Latviją, kur verapamilio vartojama mažiausiai.

4 pav. Verapamilio suvartojimas išreikštas DDD/1000 gyv./dieną 2011 – 2015 metais

1.2. Kalcio kanalų blokatorių ir beta adrenoreceptorių blokatorių apsinuodijimo

statistika

Apsinuodijimai vaistiniais preparatais yra viena iš dažniausiai pasitaikančių apsinuodijimų priežasčių Lietuvoje ir pasaulyje. Remiantis 2007-2011 metais Lietuvoje atlikta apsinuodijimų analize, apsinuodijimai medikamentais 2011 m. sudarė 41,5 % visų nustatytų apsinuodijimo atvejų [11].

Įvertinus 2014 metų Amerikos nuodų kontrolės centro asociacijos duomenis, apsinuodijimai širdies ir kraujagyslių sistemą veikiančiais vaistais sudarė 6,08 % visų apsinuodijimo vaistinėmis medžiagomis atvejų, tai užemė ketvirtą vietą statistikoje. Tačiau ši vaistų grupė užemė antrą vietą statistikoje pagal visų mirčių dėl medikamentų perdozavimo atvejų (13,30 %), nusileisdami tik

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5

Lietuva Latvija Estija Norvegija Danija

sedatyvų/hipnotikų ir antipsichozinių vaistų kategorijai 13,77 % [12]. Remiantis tais pačiais statistikos duomenimis, 2014 m. buvo nustatyti 12 007 apsinuodijimai kalcio kanalų preparatais atvejai iš kurių 423 buvo vidutiniai apsinuodijimai, 89 sunkūs, o 20 baigėsi mirtimi [12]. Apsinuodijimai beta blokatoriais 2014 m. buvo užregistruoti 24 755 kartus iš jų 914 buvo vidutinio sunkumo, 89 sunkūs, o 14 baigėsi mirtimi [12].

Remiantis Jungtinių Amerikos Valstijų sveikatos departamento pateiktoje ataskaitoje į skubios pagalbos skyrių dėl nepageidaujamos reakcijos į vaistą dėl kalcio kanalų blokatorių vartojimo 2011 m. kreipėsi 31 479 žmogus, tai sudarė 1,4 % visų atvejų. Palyginimui 2005 m. kreipėsi 12 742 žmogus (padidėjo 143 %). Dėl beta adrenoblokatorių NRV 2011 m. kreipėsi 45 597 žmogus, tai sudarė 2,0 % visų NRV atvejų, o 2005 m. 24 669 žmogus (padidėjo 84,6 %) [13].

Kalcio kanalų blokatoriai ir beta adrenoreceptorių blokatoriai yra gerai žinomi pasaulyje vaistiniai preparatai, skirti gydyti arterinę hipertenziją, tačiau tai taip pat yra preparatai, kurie dažniausiai sukelia apsinuodijimus, vartojant vaistus nuo širdies ir kraujagyslių ligų [3,12,13].

1.3. Kalcio kanalų blokatorių ir beta adrenoreceptorių blokatorių farmakologinis

poveikis

1.3.1. Diltiazemo, verapamilio ir nifedipino farmakologinis poveikis

Kalcio kanalų blokatoriai (KKB) slopina L-tipo lėtuosius kalcio jonų kanalus, mažindami Ca2+ patekimą į miokardo ir kraujagyslių lygiųjų raumenų ląsteles. Atpalaiduodami kraujagyslių lygiuosius raumenis, KKB mažina arterinį kraujo spaudimą (AKS), tuomet širdis lengviau išstumia kraują į periferiją - sumažėja pokrūvis bei deguonies poreikis miokarde. Sumažėjus vainikinių kraujagyslių tonusui ir pasipriešinimui, pagerėja vainikinė kraujotaka, miokardo mityba, išnyksta vainikinių arterijų spazmas. KKB veikia ir miokardo skersaruožius raumenis, atpalaiduodami miokardą diastolėje ir pagerindami skilvelių prisipildymą krauju [14]. Kalcio kanalų blokatoriai pagal cheminę struktūrą skirstomi į tris grupes: benzotiazepinus (diltiazemas), fenilalkilaminus (verapamilis) ir dihidropiridinus (nifedipinas) [14].

Verapamilis taip pat yra KKB, selektyvus širdžiai [2]. Jis atpalaiduoja lygiuosius kraujagyslių raumenis, mažina bendrą periferinį pasipriešinimą, todėl sumažėja arterinis kraujo spaudimas [19]. Atpalaiduodamas širdies arterijas ir arterioles, verapamilis didina širdies aprūpinimą deguonimi, todėl yra tinkamas krūtinės anginos gydymui. Jis mažina širdies susitraukimų dažnį ir, veikdamas atrioventrikulinį mazgą, slopina jo laidumą [15,16] .

Nifedipinas yra kalcio kanalų blokatorius, selektyvus kraujagyslėms [2]. Nifedipinas labiau veikia kraujagyslių lygiųjų raumenų ląsteles, sukeldamas vazodilataciją ir kartu AKS sumažėjimą. Jis nemažina miokardo kontraktiliškumo bei AV laidumo, o sumažėjus AKS, gali išsivystyti reflektorinis širdies susitraukimų padažnėjimas. Pagrindinis nifedipino poveikis yra arterijų lygiųjų raumenų atpalaidavimas, tiek koronarinių, tiek periferinių, taip sumažinant periferinį pasipriešinimą [14–16].

1.3.2. Propranololio farmakologinis poveikis

Propranololis yra neselektyvaus poveikio beta adrenoblokatorius. Jis yra konkurencinio veikimo β1 ir β2 receptorių antagonistas. Propranololis, blokuodamas β1 adrenoreceptorius, mažina širdies susitraukimų dažnį ir jėgą, lėtina impulsų sklidimą laidžiąja širdies sistema ir mažina kraujo plazmos renino aktyvumą. Blokuodamas β2 adrenoreceptorius, gali padidinti lygiųjų raumenų, esančių bronchuose ir kraujagyslių sienelėse, tonusą [20,21].

1.4. Kalcio kanalų blokatorių ir beta adrenoreceptorių blokatorių fizikocheminės

savybės ir farmakokinetika

1.4.1. Diltiazemo hidrochloridas

Diltiazemas – tai selektyvus širdžiai kalcio kanalų blokarius, benzotiazepinų darinys [2,17]. Naudojamas hipertenzijai, lėtinės stabilios bei nestabilios krūtinės anginos gydymui [22,23]. Lietuvoje diltiazemas įregistruotas „Cardil“, „Diltiazem Lannacher“ pavadinimu, kaip pailginto atpalaidavimo tabletės [24].

C22H26N2O4S, HCl = 451,0 [25]

5 pav. [26] IUPAC pavadinimas: [(2S,3S)-5-(2-Dimetilaminoetil)-2-(4metoksifenil)

Tai balti, bespalviai ir bekvapiai kristaliniai milteliai arba smulkūs kristalai. Lengvai tirpsta vandenyje, chloroforme, dichlormetane, skruzdžių rūgštyje ir metanolyje; ribotai tirpsta bevandeniame alkoholyje; praktiškai netirpsta eteryje. Lydymosi temperatūra 213 °C. Vartojamas hidrochlorido druskos pavidalu [25,26].

Diltiazemas, pavartotas peroraliai, greitai ir beveik visiškai absorbuojasi virškinamajame trakte (~90%), tačiau dėl intensyvaus metabolizmo kepenyse jo biologinis prieinamumas yra tik 40%. Diltiazemą vartojant su maistu, jo absorbcija nekinta [18,25]. Apie 70-80% diltiazemo jungiasi su kraujo plazmos baltymais [27]. Maksimali diltiazemo koncentracija plazmoje 179,8 ng/ml (Cmax) susidaro po vienkartinės prailginto veikimo 120 mg dozės ir yra pasiekiama per 2.3 val. (Tmax) nuo vaisto pavartojimo [28]. Diltiazemo poveikio trukmė vidutiniškai yra 4-8 val. 12 val. pailginto poveikio preparatui [22]. Pasiskirstymo tūris organizme – 11,1 L/kg, 14-23% diltiazemo yra laisvo vaisto serume [25,29]. Diltiazemas metabolizuojamas kepenyse, veikiant CYP3A4 [18]. Diltiazemas turi du aktyvius metabolitus: desacetildiltiazemas, kuris pasižymi 50 proc. diltiazemo aktyvumo ir N – metildiltiazemą – šie metabolitai pasižymi silpnesniu farmakologiniu poveikiu [30,31]. Diltiazemas ir jo metabolitai išsiskiria su tulžimi ir šlapimu, išmatomis ir taip pat gali būti rastas motinos piene. 2-4% pavartotos diltiazemo dozės išsiskiria nepakitęs su šlapimu [25]. Diltiazemo pusinės eliminacijos laikas – 4.9 val [28]. Esant kepenų nepakankamumui, diltiazemo pusinės eliminacijos laikas pailgėja, o pagyvenusiems pacientams gali pailgėti iki 10 val. Esant inkstų nepakankamumui nesikeičia [22]. Diltiazemo klirensas, 12-21 ml/min/kg pavartojus per os ir 16 ml/min/kg po IV injekcijos [25]. Terapinė diltiazemo koncentracija kraujyje svyruoja tarp 0,05-0,20 mg/l, serume tarp 0,05-0,4 mg/l [25].

1.4.2. Verapamilio hidrochloridas

Verapamilis yra selektyvus širdžiai kalcio kanalų blokatorius, fenilalkilamino darinys [2,17]. Verapamilis dažniausiai skiriamas arterinės hipertenzijos, stabiliosios ir nestabiliosios krūtinės anginos gydymui, supraventrikulinės tachikardijos gydymui ir profilaktikai bei skilvelių susitraukimų dažnio mažinimui, prieširdžių virpėjimui arba plazdėjimui gydyti [32,33]. Lietuvoje verapamilis įregistruotas „Isoptin retard“ ir „Verapamil-ratiopharm“ pavadinimu, kaip pailginto atpalaidavimo tabletės [24].

C27H38N2O4, HCl = 491.1 [26]

IUPAC pavadinimas 2-(3,4-Dimetoksifenil)-5- [2-(3,4-dimetoksifenil)etilmetilamino]-2-propan-2 ilpentanenitrilo

Verapamilis yra balti arba beveik balti kristaliniai milteliai. Tirpus vandenyje 1:20, etanolyje 1:25, chloroforme 1:1.5, metanolyje, praktiškai netirpus eteryje. Verapamilio lydymosi temperatūra 144 °C. Vartojamas hidrochlorido druskos pavidalu [25,26].

Verapamilis yra gerai absorbuojamas organizme, jo absorbcija yra daugiau nei 90 % [27]. Dėl didelio verapamilio ikisisteminio metabolizmo pirmojo prasiskverbimo per kepenis metu biologinis jo pasisavinimas yra tik 10-20 % [27]. Maistas mažai veikia verapamilio absorbciją [22]. Susijungimas su plazmos baltymais yra 90 %. Verapamilis plačiai pasiskirsto audiniuose, pasiskirstymo tūris organizme 3.8 l/kg [27]. Maksimali verapamilio koncentracija plazmoje 168,1 ±65,3 µg/l (Cmax) susidaro po vienkartinės pailginto atpalaidavimo 240 mg dozės ir pasiekiama po 4,8 val. (Tmax) nuo vaisto pavartojimo [34]. Verapamilio bioprieinamumas didėja, esant kepenų nepakankamumui, todėl gali reikėti mažinti dozę [19]. Verapamilio poveikio trukmė 6-8 val [22]. Verapamilis yra stipriai metabolizuojamas kepenyse, veikiant CYP3A4, CYP1A2, CYP2C. Pagrindinės metabolinės reakcijos yra N- ir O- dealkilinimas. Metabolinių reakcijų metu susidaro dvylika nustatytų metabolitų, tačiau iš jų tik norverapamilis yra biologiškai aktyvus metabolitas. Norverapamilio aktyvumas sudaro tik 20 % verapamilio aktyvumo [35,36]. Verapamilio pusinės eliminacijos laikas yra 2-7 val, norverapamilio 5-13 val. [25]. Esant kepenų nepakankamumui, verapamilio eliminacija padidėja iki 14-16 valandų, tačiau inkstų nepakankamumas verapamilio farmakokinetikos neveikia, seniems pacientams verapamilio eliminacija nežymiai padidėja [22]. Verapamilio klirensas yra 0,51-1 l/val/kg [27]. Apie 50 % suvartotos verapamilio dozės yra pašalinama per inkstus per 24 valandas, 70 % dozės per penkias dienas. Iki 16 % suvartotos vaisto dozės pašalinama su išmatomis ir 5% verapamilio yra pašalinama per inkstus kaip nemetabolizuotas vaistas [25]. Terapinė verapamilio koncentracija kraujo plazmoje svyruoja tarp 80-300 ng/ml [27].

1.4.3. Nifedipinas

Nifedipinas yra kalcio kanalų blokatorius, selektyvus kraujagyslėms, dihidropiridino darinys [2,37]. Nifedipinas skiriamas arterinės hipertenzijos gydymui, stabiliosios krūtinės anginos priepuolių profilaktikai [38]. Lietuvoje diltiazemas įregistruotas „Cordipin SR“ ir „Cordipin XL“ pavadinimu,

kaip pailginto atpalaidavimo tabletės [24]. C17H18N2O6 = 346.3 [25]

IUPAC pavadinimas Dimetil 1,4-dihidro-2,6-dimetil-4-(2-nitrofenil) pyridino- 3,5-dikarboksilatas [25]

Nifedipinas yra geltonos spalvos kristaliniai milteliai, praktiškai netirpus vandenyje, silpnai tirpus etanolyje, tirpus acetone, metanolyje ir chloroforme. Nifedipino lydymosi temperatūra yra 172-174 °C [25,26].

Nifedipinas yra greitai ir beveik visiškai absorbuojamas organizme. Sisteminis išgerto nifedipino bioprieinamumas yra 31 – 92 % dėl stipraus metabolizmo kepenyse [39]. Nifedipinas, vartojamas kartu su maistu, nežymiai keičia pirminį absorbcijos greitį, tačiau įtakos biologiniam prieinamumui neturi [40]. Apie 91-98% nifedipino jungiasi prie plazmos baltymų [40]. Maksimali nifedipino koncentracija plazmoje 57,2 ± 7.61 ng/ml (Cmax) susidaro po vienkartinės prailginto veikimo 30 mg dozės ir yra pasiekiama po 3.9 val. (Tmax) nuo vaisto pavartojimo [41]. Nifedipino poveikio trukmė svyruoja tarp 4-8 val. [22], pasiskirstymo tūris organizme apie 1,4-2,2 L/kg [42]. Plazmos klirensas apie 7 ml/min/kg [25]. Išgertas nifedipinas yra metabolizuojamas žarnų sienelėse ir kepenyse oksidacijos proceso metu į nitropiridiną ir kitus metabolitus. Iš organizmo nifedipinas pasišalina neaktyvaus nitropiridino metabolito pavidalu per inkstus 70-80% (per 24 val.) ir apie 5-15 % su tulžimi ir išmatomis (per 4 dienas). Nepakitusio nifedipino (mažiau nei 0,1%) aptinkama šlapime. Nifedipino metabolitai farmakologinio aktyvumo neturi [25,40]. Nifedipino pusinės eliminacijos trukmė yra 1-5 valandos, 10 val. prailginto poveikio tabletėms [22,42]. Esant kepenų nepakankamumui, pailgėja iki 7 val, seniems žmonėms 7-9 val., o esant inkstų nepakankamumui, - nesikeičia [22]. Terapinė nifedipino koncentracija plazmoje yra 25–100 ng/mL [40].

1.4.4. Propranololio hidrochloridas

Propranololis yra neselektyvaus poveikio beta adrenoreceptorių blokatorius [2]. Propranololiu yra gydoma arterinė hipertenzija, krūtinės angina [20,43]. Lietuvoje propranololis įregistruotas „Propranolol Actavis“ pavadinimu kaip plėvele dengtos tabletės. [24]

C16H21NO2, HCl = 295.8 [26]

IUPAC pavadinimas 1-naftalen-1-iloksi-3-(propan-2-ilamino) propan-2-olio hidrochloridas [25]

8 pav. [26]

Propranololis beveik visiškai rezorbuojasi žarnyne, tačiau netenka didelės aktyvumo dalies dėl stipraus metabolizmo pirmojo prasiskverbimo per kepenis metu. Propranololio biopasisavinimas yra tik 30%, tačiau daug baltymų turintis maistas gali padidinti biopasisavinimą 50 proc [20,25]. Propranololis su kraujo plazmos baltymais jungiasi apie 90-95 proc. Pasiskirstymo tūris organizme yra 3.9 L/kg. Propranololis yra ypač lipofilinis, todėl gali pereiti hematoencefalinį barjerą ir placentą, taip pat patekti į motinos pieną [20,25]. Propranololis greitai pasiskirsto po visą organizmą, didžiausi kiekiai randami plaučiuose, kepenyse, inkstuose, smegenyse ir širdyje [25]. Maksimali vaisto koncentracija plazmoje 31,8 ± 2,6 ng/ml (Cmax), susidaranti po vienkartinės 20 mg dozės pasiekiama po 2,5 ± 1 val. (Tmax) nuo vaisto pavartojimo [44]. Propranololis gali padidinti nifedipino Cmax 64% ir AUC 79%, tačiau neveikia verapamilio farmakokinetikos [20]. Propranololis yra stipriai metabolizuojamas kepenyse, kurio metu susidaro biologiškai aktyvus metabolitas 4-hidroksipropranololis. Kiti susidarę metabolitai norpropranololis ir α-naftoksi-2,3-propilenglikolis pasižymi mažu biologiniu aktyvumu [20,25]. Propranololio pusinės eliminacijos trukmė maždaug 3– 6 val., pailginto atpalaidavimo vaisto formos – 12 valandų. Propranololio metabolitai ir nedidelis nepakitusio propranololio kiekis išsiskiria į šlapimą. Po vienos peroraliai pavartotos propranololio dozės, 84-92% propranololio pasišalina iš organizmo per 48 valandas kartu su šlapimu [20,25]. Propranololio klirensas 10-20 ml/min/kg [25]. Mažiau nei 0,5 % yra pašalinamas nepasikeitęs propranololis kartu su šlapimu. Apie 20% propranololio dozės yra eliminuojama kartu su šlapimu glukoronido pavidalu [45]. Terapinė propranololio kraujo plazmos koncentracija svyruoja tarp 0,05- 0,1 mg/l [25].

1.5. Kalcio kanalų blokatorių ir beta adrenoreceptorių blokatorių toksiškumas

1.5.1. Diltiazemo, verapamilio ir nifedipino toksiškumas

atsiranda pykinimas, vėmimas, žarnų nepraeinamumo reiškiniai. [37,46]. Perdozavus greitai veikiančių KKB, apsinuodijimo poveikis pasireiškia po 2-3 val., ilgai veikiančių – po 6-15 val. KKB stipriai jungiasi su plazmos baltymais, turi didelį pasiskirstymo tūrį organizme ir yra metabolizuojami kepenyse. Didėjant apsinuodijimo dozei, KKB klirensas mažėja, todėl pailgėja pusinės eliminacijos laikas [37,46].

Diltiazemo toksinė dozė suaugusiam žmogui yra 2 g. Apsinuodijimas diltiazemu atsiranda, kai koncentracija serume yra 0,8 mg/l, o esant 2-6mg/l ištinka mirtis [25].

Verapamilio toksinis efektas dažniausiai pasireiškia po 1-5 val. išgėrus per os. Toksinis poveikis atsiranda, išgėrus 1 g verapamilio, hipotenzija ir šokas nuo 2 g. Mirtis gali ištikti ir pavartojus 1,4-2,8 g [47]. Buvo nustatytas verapamilio perdozavimo atvejis, pavartojus 3,2 g verapamilio. Tuomet verapamilio koncentracija kraujo plazmoje siekė 2,2 mg/l [25].

Nifedipinas paprastai yra gerai toleruojamas organizme, tačiau yra užfiksuoti jo perdozavimo atvejai, kai buvo pavartota 30 prailginto poveikio nifedipino tablečių po 20 mg, plazmos koncentracija organizme po 10 val. buvo 0,604 mg/l [25].

1.5.2. Propranololio toksiškumas

Apsinuodijus propranololiu, pagrinde yra pažeidžiama širdies ir kraujagyslių sistema ir CNS. Būdingiausi apsinuodijimo požymiai – hipotenzija ir bradikardija dėl β1 adrenoreceptorių blokavimo. Atsiranda atrioventrikulinio mazgo blokada, širdies nepakankamumas, kardiogeninis šokas. Gali sutrikti kvėpavimas, pasireikšti bronchų spazmas dėl β2 adrenoreceptorių blokavimo. Toksinis poveikis CNS (koma ir konvulsijos) dėl didelio propranololio lipofiliškumo. Toksinis propranololio poveikis atsiranda po 1-2 valandų [20,37,45].

1.6. Diltiazemo, verapamilio, nifedipino ir propranololio kokybinis vertinimas

plonasluoksnės chromatografijos metodu

1.6.1. Plonasluoksnė chromatografija (PC)

Chromatografijos rūšis, kai judančioji fazė (vienas tirpiklis ar jų mišinys) juda plonu nejudančios fazės (sorbento) sluoksniu, padengtu ant inertinio paviršiaus, vadinama plonasluoksne chromatografija. Tai - adsorbcinė plokštuminė skysčių chromatografija. Veikiamas adsorbcinių jėgų, eliuentas (tirpiklis) kyla chromatografine plokštele, kartu skirtingu greičiu keldamas tiriamąsias medžiagas. Tiriamųjų medžiagų atsiskyrimas vyksta dėl skirtingo jų afiniteto mobilios ir stacionarios fazių atžvilgiu [48].

Plonasluoksnė chromatografija yra vienas iš plačiausiai naudojamų kokybinės junginių analizės metodų. Kad metodas pažangus ir plačiai naudojamas, rodo ir tai, jog tarp daugelio junginių identifikavimo metodų, aprašytų farmakopėjose, yra ir plonasluoksnė chromatografija [48,49]. Ji yra paprasta, lengvai atliekama, plačiai pritaikoma, greita ir atranki, galima pasiekti tikslų mišinių išskirstymą bei itin tikslų medžiagų identifikavimą [48,49]. PC naudojama organiniams ir bioorganiniams junginiams atskirti, identifikuoti, valyti, juos ekstrahavus iš vaistinių preparatų, biologinių skysčių, įvairių kitų medžiagų [48].

Analizei dažniausiai naudojamos aliuminio, stiklo ar plastiko plokštelės, padengtos plonu (100–250µm) sorbento sluoksniu. Sorbentai gali būti įvairūs, populiariausias yra silikagelis, taip pat gali būti naudojamas aliuminio oksidas, celiuliozė, magnio oksidas, magnio silikatas, celitas, sefadeksas. Norint medžiagas aptikti ultravioletine šviesa (UV), į sorbentą yra įterpiamas fluorescencinis indikatorius, pvz., mangano aktyvintas cinko silikatas, kuris verčia plokštelę florescuoti. Plokštelių ryškinimui gali būti naudojama ultravioletinė šviesa arba cheminiai reagentai [48,50,51].

1.6.2. Plonasluoksnės chromatografijos metodikos, tinkamos identifikuoti

diltiazemą, verapamilį, nifedipiną ir propranololį

fiziko-cheminėmis savybėmis – dažniausiai tam tikras vaistinių medžiagų grupes, pavyzdžiui, kalcio kanalų blokatorių junginius ar beta adreno blokatorius. Pateikiama informacija apie mokslinėje literatūroje aprašytas plonasluoksnės chromatografijos metodikas, kurios galėtų būti pritaikytos kokybiškai vertinant nifedipiną, verapamilį, diltiazemą arba propranololį (2 lentelė).

2 lentelė. Plonasluoksnės chromatografijos tirpiklių sistemos taikomos diltiazemo, verapamilio nifedipino ir propranololio kokybinei analizei

Tirpiklių sistema Diltiazemo Rf reikšmė Verapamilio Rf reikšmė Nifedipino

Rf reikšmė Propranololio _{Rf reikšmė} N-heksanas: etilo acetatas:

acetonas (6:3:2) [52] - - 0,55 -

Trichlormetanas: etilo acetatas:

cikloheksanas (19:2:2) [53] - - 0.31 -

Toluenas: metanolis: acetonas:

acto rūgštis (70: 20: 5: 5) [54] - 0,27 - -

Izopropranololis: etilo acetatas: amonio hidroksidas (1:8,5:0.5 [55]

- - - 0.52

Trichlormetanas: etilo acetatas:

cikloheksanas (19:2:2) [56] - - - 0.18

Metanolis: koncentruotas amonio

hidroksidas (100:1,5) [25] - 0.59 0.68 0.5

Cikloheksanas: toluenas:

dietilaminas (75:15:10) [25] - 0.23 0.01 0.06

Trichlormetanas: metanolis

(90:10) [25] - 0.7 0.65 0.1

Etilo acetatas: metanolis: koncentruotas amonio hidroksidas (85:10:5) [25]

0.56 0.73 0.71 0.49

Acetonas [25] - 0.42 0.68 0.07

Metanolis: n-butanolis (60:40) ir 0,1 mol/l natrio bromido tirpale [25] - 0.61 - 0.79 Trichlormetanas:cikloheksanas: acto rūgštis (4:4:2) [25] - - - 0,05 Trichlormetanas : metanolis : propiono rūgštis (72:18:10) [25] - - - 0,49

analizei atlikti, todėl prieita išvada, jog mišinio tyrimams tinkamiausia tirpiklių sistema bus ieškoma eksperimentiškai.

1.7. Diltiazemo, verapamilio, nifedipino ir propranololio kokybinis vertinimas

ultraefektyviosios skysčių chromatografijos metodu

1.7.1. Ultraefektyvioji skysčių chromatografija (UESC)

Efektyvioji skysčių chromatografija (ESC) – tai fiziko-cheminis analizės metodas, kurio metu mėginio komponentai pasiskirsto tarp judriosios ir nejudriosios fazės. ESC gali būti taikoma kokybiniam ir kiekybiniam vaistinių medžiagų nustatymui biologinėse terpėse. Judriosios fazės sudėtis parenkama tokia, kad galėtų atskirti kuo daugiau skirtingų organinių junginių. Eliuento sudėtis ir santykis gali būti keičiamas chromatografavimo metu, tokiu būdu pagerinant junginių atskyrimą [25,57].

Chromatografinės sistemos efektyvumo didinimas yra bene ryškiausia ESC vystymo kryptis, todėl 2003 m buvo pristatyta ultraefektyvioji skysčių chromatografija (UESC). Jos privalumas yra tas, kad naudojami dešimtimis kartų didesni slėgiai, kuriems veikiant gerėja skiriamoji geba ir efektyvumas. Būtent aparatūra ir buvo pagrindinė problema, ribojusi slėgio didinimą. Taip pat sorbentų dalelių dydis buvo sumažintas iki 1,7 µm. Palyginus UESC ir ESC metodus to paties ilgio kolonėlėmis buvo nustatyta, kad sorbento dalelių dydžio sumažinimas iki 1,7 μm, padidina chromatografinės sistemos efektyvumą ~3 kartus, atrankumą pagerina ~1,7 karto, o nustatymo jautrumą padidina ~2 kartus. UESC metodas plačiai naudojamas daugelyje analizės sričių ( farmacijos, biotechnologijų, maisto, toksikologijos), kokybiniam ir kiekybiniam medžiagų įvertinimui [49,58,59].

1.7.2. Ultraefektyviosios skysčių chromatografijos metodikos, tinkamos

identifikuoti nifedipiną, propranololį, verapamilį arba diltiazemą

3 lentelė. Nifedipinui, propranololiui, verapamiliui, diltiazemui taikytų ESC ir UESC metodikų apžvalga

Preparatas Kolonėlė Mobili fazė Tėkmės

greitis Detektorius Šaltinis

Diltiazemas 50×4.6mm; 1.8μm; Zorbax SB-Phenyl 0,01% trifluoracto rūgštis: acetonitrilas (40:60) 1,6 ml/min UV 238 nm. [60] Diltiazemas Hiber, 250-4.6 RP-18 column acetonitrilas: metanolis: vanduo (30:20:50) 1 ml/min UV 230 nm [61] Nifedipinas Propranololis, Verapamilis, Diltiazemas Agilent Zorbax Eclipse Plus C-18 0,1% skruzdžių rūgšties vandenyje : 0,1% skruzdžių rūgšties acetonitrile 1 ml/min Masių spektrometr inis [62] Propranololis Purospher® STAR RP-18 160 ml vandens: 180 ml metanolio: 70ml acetonitrilo: 2,5ml acto r: 125 µl trietilamino 0,5 ml/min UV 291 nm [63] Nifedipinas Waters Acquity UPLC BEH C 18

4 mmol amonio acetato vandenyje: acetonitrilas (15: 85) 0,25 ml/min Masių spektrometr inis [64] Verapamilis Lichrospher 60 RP 0.025 mol/L KH2PO4 : acetonitrilas (60:40) 1 ml/min Fotodiodų matricos 200 nm [33]

2.

EKSPERIMENTINĖ DALIS

2.1. Tyrimo objektas

Tyrimo objektas – kraujo plazmos mėginiai su vaistinėmis medžiagomis: diltiazemo hidrochloridu, verapamilio hidrochloridu, nifedipinu, propranololio hidrochloridu.

Kraujo plazmos mėginiai be donoro identifikavimo ženklų gauti iš Lietuvos sveikatos mokslų universiteto ligoninės Kauno klinikų Kraujo centro (Bioetikos centro pritarimas Nr. BEC – FF – 20, (Priedas nr. 1).

2.2. Kokybinis vertinimas plonasluoksnės chromatografijos (PC) metodu

2.2.1. Etaloniniai tirpalai

Etaloniniai tirpalai ruošti, naudojant jų standartus. Nifedipinas (Acros organics, Belgija), propranololis (Acros organics, Belgija), verapamilis (Acros organics, Belgija) ir diltiazemas (Acros organics, Belgija) buvo tirpinami metanolyje. Tokiu būdu gauti etaloniniai nifedipino (NE1), propranololio (PE1), verapamilio (VE1) ir diltiazemo (DE1) 0,3 mg/ml koncentracijos tirpalai. Etaloninių medžiagų mišinys buvo paruoštas sumaišius po 1 ml etaloninių tirpalų, tokiu būdu gautas etaloninis medžiagų mišinio tirpalas (NPVDE1).

2.2.2. Tiriamieji tirpalai

Tiriamieji tirpalai ruošiami iš Lietuvoje registruotų vaistinių preparatų. Nifedipino darbinis tirpalas (N1) iš „Cordipin XL“ 40 mg tablečių, propranololio darbinis tirpalas (P1) iš „Propranolol Actavis“ 40 mg tablečių, verapamilio darbinis tirpalas (V1) iš „Verapamil-ratiopharm“ 80 mg tablečių, diltiazemo darbinis tirpalas (D1) iš „Diltiazem Lannacher“ 180 mg tablečių.

verapamilio 0,3 ml ir praskiedžiant iki 8 ml; iš diltiazemo 0,15 ml ir praskiedžiant iki 9 ml. Tirpalai filtruojami pro „FRISENETTE Q-Max® syringe filter“ (0,22 μm) membraninį filtrą. Gauti metanoliniai tirpalai ir pagamintas jų mišinys (NPVD1), paimant iš kiekvieno tirpalo po 1 ml. Pagaminti tirpalai ir jų mišinys bus panaudoti, identifikuojant vaistus plonasluoksnės chromatografijos metodu, taip pat atliekant vaistų mišinio kietafazę ekstrakciją iš kraujo plazmos.

2.2.3. Kietafazės ekstrakcijos (KFE) iš kraujo plazmos metodika

Mėgintuvėlyje iki sauso likučio išdžiovinamas 200 ul nifedipino, propranololio, verapamilio ir diltiazemo (NPVD1) tiriamojo tirpalo mišinio (naudojant azoto srovę). Gautas sausas likutis ištirpinamas 250 µl kraujo plazmos ir 5 min sonifikuojamas ultragarso vonelėje.

Kietafazė ekstrakcija (KFE) atliekama su 1 cm3

30 mg Oasis HLB atvirkščių fazių ekstrakcijos kolonėle (Waters, JAV). Kolonėlė paruošiama darbui suaktyvinant sorbentą: per jį leidžiant 1 ml metanolio, vėliau 1 ml išgryninto vandens. Vakuuminiu siurbliu nustatytas tekėjimo greitis - 1 lašas per 4 sekundes. Įleidžiamas plazmos mėginys su vaistinių medžiagų mišiniu. Kolonėlė plaunama 2 ml išgrynintu vandeniu ir 2 min. džiovinama sauso oro srove. Tiriamųjų medžiagų išplovimui iš sorbento pilama 2 ml metanolio, kuris renkamas į sausą, švarų mėgintuvėlį. Surinkta ištrauka džiovinama šildant 40˚C temperatūroje ir naudojant azoto srovę iki sauso likučio. Sausas likutis tirpinamas 1 ml metanolio ir 1 minutę sonifikuojamas. Gautas NPVD tirpalas naudotas atliekant identifikavimą plonasluoksnės chromatografijos metodu [65].

2.2.4. Plonasluoksnės chromatografijos metodika

Įranga. Antihipertenzinių vaistų mišiniui identifikuoti naudotos chromatografinės plokštelės, kurios buvo padengtos silikagelio sorbcine mase, matmenys 20 x 20 cm (TLC Silica gel 60 F254 glass plates; Sigma – Aldrich, Vokietija). Chromatografinis tyrimas buvo atliktas, naudojant „CAMAG Twin Chamber“ 20 x 20 cm kameras. Mėginiai ant chromatografinės plokštelės užnešami naudojant pusiau automatinį mėginių užnešėją „CAMAG Linomat 5“, kuris mėginius užneša suformuodamas brūkšnelio pavidalo dėmę. Tiriamuosiuose mišiniuose esančių vaistinių medžiagų dėmių sulaikymo rodiklio (Rf) reikšmės yra nustatomos naudojantis vizualizavimo prietaisu „CAMAG TLC Visualizer“ bei programine įranga „VideoScan“.

Ryškiklis. Chromatografinių plokštelių ryškinimui naudojama UV spinduliuotė (254 nm). Analizė. Tiriamieji tirpalai iš tablečių ir kraujo plazmos užnešami ant chromatografinės plokštelės. Šalia užnešamas etaloninių junginių mišinys. Plokštelė perkeliama į chromatografinę kamerą su atitinkamomis tirpiklių sistemomis. Tirpiklių sistemai pakilus 10 cm, plokštelė džiovinama ir identifikuojama ryškinant UV spinduliuote (254 nm). Apskaičiuojamas jų sulaikymo rodiklio (Rf) reikšmės, kurios lyginamos su etaloninių tirpalų Rf reikšmėmis.

2.3. Kokybinis vertinimas ultraefektyviosios skysčių chromatografijos (UESC)

metodu

2.3.1. Etaloniniai tirpalai

Etaloniniai tirpalai ruošti, naudojant nifedipino (Acros organics, Belgija), propranololio (Acros organics, Belgija), verapamilio (Acros organics, Belgija) ir diltiazemo (Acros organics, Belgija) standartines medžiagas, kurios buvo tirpinamos metanolyje. Gauti etaloniniai nifedipino (NE2), propranololio (PE2), verapamilio (VE2), diltiazemo (DE2) 0,1 mg/ml koncentracijos tirpalai. Etaloninių medžiagų mišinys buvo paruoštas, sumaišius po 1 ml etaloninių tirpalų, tokiu būdu gautas etaloninis medžiagų mišinio tirpalas (PDVNE2).

2.3.2. Tiriamieji tirpalai

ekstrakciją iš kraujo plazmos ir identifikuojant junginius ultraefektyviosios skysčių chromatografijos metodu.

2.3.3. Skysčių – skysčių ekstrakcijos (SSE) iš kraujo plazmos metodika

Mėgintuvėlyje iki sauso likučio išdžiovinama 200 ul PDVN2 nifedipino, propranololio, verapamilio ir diltiazemo tiriamojo tirpalo mišinio (naudojant azoto srovę). Gautas sausas likutis tirpinamas 250 µl kraujo plazmoje ir 5 min sonifikuojamas ultragarso vonelėje. Kraujo plazmos baltymai nusodinami ant jau paruošto plazmos mėginio (250 µl) užpilant 1,25 ml acetonitrilo ir 1 minutę maišant vibracine maišykle „MS2 Minishaker, IKA“. Mėginys centrifuguojamas 5 minutes, 4000 apsisukimų per minutę greičiu naudojant „Centurion Scientific C2 series“ centrifugą. Centrifugavimo metu plazma bei kitos dalelės nusėda mėgintuvėlio apačioje, o viršuje esantis vandeninis sluoksnis atskiriamas ir naudojant azoto srovę išdžiovinamas iki sauso likučio. Tirpiname 1 ml vandens ir pilama 2 ml trichlormetano, ekstrahuojama dalomajame piltuve 5 min. Dalomasis piltuvas švelniai vartomas. Po to paliekama nusistovėti 5 min, kol atsiskiria tirpiklių sluoksniai. Trichlormetano sluoksnis su tiriamosiomis medžiagomis atsargiai atskiriamas į švarų mėgintuvėlį. Ekstrakcija trichlormetanu kartojama dar du kartus. Surinktas ekstraktas išgarinamas iki sauso likučio, naudojant azoto srovę. Sausas likutis tirpinamas 1 ml metanolio ir 1 minutę sonifikuojamas. Analogiškai paruošiamas „tuščias“ plazmos mėginys be vaistinių medžiagų. Taip paruoštas ir išvalytas kraujo plazmos mėginys yra naudojamas atliekant analizę ultraefektyviosios skysčių chromatografijos metodu.

2.3.4. Ultraefektyviosios skysčių chromatografijos metodika

Įranga. Vaistinių medžiagų nustatymui panaudotas ultraefektyvusis skysčių chromatografas (UESC) „Waters ACQUITY H UPLC“ su fotodiodų matricos detektoriumi „ACQUITY UPLC PDA eλ“. Naudota chromatografinė kolonėlė „ACQUITY UPLC BEH C18 2,1x50mm (Waters)“, sorbento dalelių dydis 1,7 µm.

Tirpikliai. Chromatografavimui buvo naudotas išgrynintas vanduo, pagamintas „Milipore“ (JAV) vandens gryninimo sistema, 0,05 % trifluoracto rūgšties vandeninis tirpalas ir acetonitrilas. Etaloninių ir tiriamųjų tirpalų ruošimui buvo naudojamas metanolis.

Nustatytas tėkmės greitis – 0,4 ml/min, injekcijos tūris – 1 μl. Kolonėlės temperatūra 25 °C. Junginių detekcija atliekama 230 nm šviesos bangų ilgyje.

4 lentelė. Chromatografijai naudoto eliuento gradientinis kitimas

Laikas (min) Eliuento tekėjimo greitis (ml/min) 0,05 % trifluoracto rūgštis (A) (proc.) Acetonitrilas (B) (proc.) 0 0,4 96 4 01:00 0,4 90 10 08:00 0,4 2 98 11:00 0,4 2 98 12:00 0,4 96 4

2.4. Duomenų apdorojimas

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS

3.1. Plonasluoksnės chromatografijos metodikos parinkimas

3.1.1. Ryškiklio parinkimas

Ieškant tinkamiausios plonasluoksnės chromatografijos metodikos, norint identifikuoti tiriamuosius junginius ant chromatografinės plokštelės, reikia pasirinkti tinkamą ryškinimo reagentą, kuris būtų tinkamas visų keturių junginių (nifedipino, propranololio, verapamilio ir diltiazemo) identifikavimui mišinyje. Atlikus eksperimentinius tyrimus, siekiant įvertinti, kuris ryškinimo būdas yra tinkamas visoms medžiagoms identifikuoti, buvo pasirinktas ryškinimas UV spinduliais (254 nm). Identifikuojant UV spinduliais (254 nm) yra aiškiai matomos pilkos spalvos (dėmės ryškumas priklauso nuo koncentracijos) visų nustatinėjamų junginių dėmės ant chromatografinės plokštelės (9 pav.). Ryškinimas jodo garais netinkamas, nes nifedipinas nebuvo identifikuotas (10 pav.)

9 pav. Nifedipino (NE1), propranololio (PE1), verapamilio (VE1), diltiazemo (DE1) dėmės ant chromatografinės plokštelės, apšvietus ją UV šviesa (254 nm)

10 pav. Propranololio (PE1), verapamilio

(VE1), diltiazemo (DE1) dėmės ant

3.1.2. Tirpiklių sistemos (TS) parinkimas

Atlikus mokslinės literatūros analizę [24, 49-53], nerasta duomenų apie plonasluoksnės chromatografijos metodiką, kurios pagalba vienu metu būtų įmanoma nustatyti nifedipiną, propranololį, verapamilį ir diltiazemą mišinyje. Todėl vykdant eksperimentinius tyrimus, modifikuojant ir išbandant skirtingas tirpiklių sistemas, keičiant tirpiklių santykį, buvo siekiama parinkti tokius tirpiklių mišinius, kurie galėtų atskirti visus junginius mišinyje. Nustatant tinkamiausias tirpiklių sistemas buvo siekiama, kad etaloninių tirpalų sulaikymo rodikliai (Rf) būtų skirtingi, o tiriamųjų medžiagų dėmės nepersidengtų. Atlikus eksperimentinius tyrimus ir palyginus gautas Rf reikšmes, buvo parinktos dvi tirpiklių sistemos, kurios buvo tinkamos junginių kokybiniam įvertinimui mišinyje (11 pav. ir 12 pav.).

11 pav. Sistema TS – 1 nifedipino (NE1), propranololio (PE1), verapamilio (VE1), diltiazemo (DE1) ir jų mišinio (NPVDE1) dėmės apšvietus UV šviesą (254 nm)

12 pav. Sistema TS–2 nifedipino (NE1), propranololio (PE1), verapamilio (VE1), diltiazemo (DE1) ir jų mišinio (NPVDE1) dėmės apšvietus UV šviesą (254 nm)

5 lentelė. Statistinis tiriamųjų junginių (nifedipino, propranololio, verapamilio, diltiazemo) Rf

reikšmių vertinimas, naudojant TS – 1 ir TS – 2 tirpiklių sistemas

Nustatyta, kad abiejų tirpiklių sistemų atsikartojimo paklaidos neviršijo leistinos 0,05 ribos, todėl šios dvi tirpiklių sistemos yra tinkamos mišinyje esančių nifedipino, propranololio, verapamilio ir diltiazemo kokybiniam įvertinimui.

3.2. Vaistinių preparatų analizė plonasluoksnės chromatografijos metodu

Parinkus tinkamas tirpiklių sistemas ir medžiagų dėmių ryškinimo būdą, buvo tirti darbiniai nifedipino (N1), propranololio (P1), verapamilio (V1), diltiazemo (D1) ir jų mišinio (NPVD1) tirpalai, pagaminti iš vaistinių preparatų, įsigytų Lietuvos vaistinėse. Darbiniai tirpalai buvo lyginami su etaloniniais nifedipino (NE1), propranololio (PE1), verapamilio (VE1) ir diltiazemo (DE1) ir jų mišinio (NPVDE1) tirpalais. Analizė buvo atlikta naudojant TS – 1 ir TS – 2 sistemas, kaip ryškiklį naudojant UV spindulių lempą (254 nm) (13 pav. ir 14 pav.).

Tirpiklių sistema Tiriamoji _medžiaga Rf

13 pav. Sistema TS–1 atskirtos ir UV šviesa (254 nm) išryškintos etaloninių nifedipino (NE1), propranololio (PE1), verapamilio (VE1), diltiazemo (DE1), jų mišinio (NPVDE1) ir tiriamųjų

tirpalų N1, P1, V1, D1 ir jų mišinio (NPVD1) dėmės

14 pav. Sistema TS–2 atskirtos ir UV šviesa (254 nm) išryškintos etaloninių nifedipino (NE1), propranololio (PE1), verapamilio (VE1), diltiazemo (DE1), jų mišinio (NPVDE1) ir tiriamųjų

tirpalų N1, P1, V1, D1 ir jų mišinio (NPVD1) dėmės

6 lentelė. Tiriamųjų medžiagų, išskirtų iš vaistinių preparatų, vidutinės Rf reikšmės ir

pasikliautinasis intervalas naudojant TS–1 ir TS–2 tirpiklių sistemas

Tiriamasis mėginys TS – 1 vidutinė Rf reikšmė TS – 1 pasikliautinasis intervalas TS – 2 vidutinė Rf reikšmė TS – 2 pasikliautinasis intervalas Nifedipinas (N1) 0,91 0,90 – 0,92 0,93 0,92 – 0,93 Propranololis (P1) 0,62 0,61 – 0,63 0,71 0,70 – 0,72 Verapamilis (V1) 0,45 0,44 – 0,45 0,60 0,60 – 0,61 Diltiazemas (D1) 0,28 0,28 – 0,29 0,43 0,42 – 0,43

Remiantis etaloninių ir tiriamųjų medžiagų, išskirtų iš vaistinių preparatų, analizės rezultatais tirpiklių sistemos TS – 1 ir TS – 2 buvo panaudotos vaistų mišinio, išskirto iš kraujo plazmos, analizei. Tiriamųjų vaistinių preparatų mišinio kietafazė ekstrakcija iš kraujo plazmos buvo atlikta, pagal anksčiau aprašytą metodiką (2.2.3 skyrius). Ant chromatografinės plokštelės buvo užnešti etaloniniai ir vaistinių preparatų iš kraujo plazmos mišiniai. Analizė buvo atlikta naudojant TS – 1 ir TS – 2 sistemas, kaip ryškiklį naudojant UV spindulius (254 nm) (15 pav. ir 16 pav.).

15 pav. Sistema TS–1. Nifedipino (N), propranololio (P), verapamilio (V), diltiazemo (D) vaistų mišinys, išskirtas iš kraujo plazmos, ir nifedipino (NE1), propranololio (PE1), verapamilio (VE1), diltiazemo (DE1) etaloninis mišinys. Identifikuojama UV šviesa (254 nm)

16 pav. Sistema TS–2. Nifedipino (N), propranololio (P), verapamilio (V), diltiazemo (D) vaistų mišinys, išskirtas iš kraujo plazmos, ir nifedipino (NE1), propranololio (PE1), verapamilio (VE1), diltiazemo (DE1) etaloninis mišinys.

Analizės metu nustatyto tiriamojo vaistų mišinio, išskirto iš kraujo plazmos, vidutinės Rf reikšmės atitiko pasikliautinuosius intervalus, nustatytus TS – 1 ir TS – 2 tirpiklių sistemose (7 lentelė).

7 lentelė. Tiriamųjų medžiagų, išskirto iš kraujo plazmos, vidutinės Rf reikšmės naudojant

TS – 1 ir TS – 2 tirpiklių sistemas

Remiantis gautais rezultatais, galima teigti, jog TS – 1 ir TS – 2 sistemos yra tinkamos nifedipino, propranololio, verapamilio ir diltiazemo vaistų mišinio, išskirto iš kraujo plazmos kokybiniam nustatymui.

3.3. Ultraefektyviosios skysčių chromatografijos metodikos parinkimas

Norint parinkti metodiką, kuri būtų tinkama propranololio, diltiazemo, verapamilio ir nifedipino mišinio išskirstymui ir identifikavimui, taip pat ir kraujo plazmoje esančių vaistų mišiniui nustatyti, pirmiausia atlikta išsami mokslinės literatūros šaltinių analizė [35,57-61]. Iš pradžių buvo atliktas mišinio nustatymas, pagal pasirinktą UESC metodiką [62], tačiau buvo nustatyta, kad gautų junginių chromatografinės smailės yra asimetriškos, todėl buvo nuspręsta modifikuoti UESC metodiką ir pritaikyti ją analizuojamo mišinio kokybinei analizei.

Modifikuojant UESC metodiką buvo keistos šios sąlygos: eliuentų sistemoje 0,1 % skruzdžių rūgštis pakeista į 0,05 % trifluoracto rūgštį, pakeistas eliuento gradientinis kitimas ir analizės trukmė, eliuento tėkmės greitis sumažintas iki 0,4 ml/min, kolonėlės temperatūrą sumažinta iki 25 °C. Junginių išskirstymas atliktas naudojant „ACQUITY UPLC BEH C18“ (2,1x50mm x 1,7 µm) chromatografinę kolonėlę, esant 230 nm šviesos bangos ilgiui. Modifikuoto metodo eliento sistema buvo sudaryta iš 0,05% trifluoracto rūgšties vandeninio tirpalo (eliuentas A) ir acetonitrilo (eliuentas B). Eliuavimo būdas – gradientinis. Gradientinis kitimas pateiktas 8 lentelėje. Nustatytas tėkmės greitis – 0,4 ml/min, injekcijos tūris – 1 μl. Kolonėlės temperatūra 25 °C.

8 lentelė. Chromatografijai naudoto eliuento gradientinis kitimas Laikas (min) Eliuento tekėjimo greitis (ml/min) 0,05 % trifluoracto rūgštis (A) (proc.) Acetonitrilas (B) (proc.) 0 0,4 96 4 01:00 0,4 90 10 08:00 0,4 2 98 11:00 0,4 2 98 12:00 0,4 96 4

Atlikus chromatografinę analizę su etaloninių medžiagų mišiniu naudojant pasirinktą metodiką, gauti šie rezultatai: nustatyti etaloninių medžiagų sulaikymo laikai ir UV spektrai (17 pav.).

17 pav. Propranololio, diltiazemo, verapamilio ir nifedipino etaloninių medžiagų mišinio chromatograma su UV spektrais (junginių aptikimas atliktas esant 230 nm šviesos bangos ilgiui)

3.3.1. Ultraefektyviosios skysčių chromatografijos metodikos validacija

Norint ultraefektyviosios skysčių chromatografijos metodiką taikyti tiriamųjų vaistų mišinio (propranololio, diltiazemo, verapamilio ir nifedipino) nustatymui iš kraujo plazmos, būtina įrodyti metodikos tinkamumą ją validuojant. Remiantis ICH (International Conference on Harmonisation) analitinių procedūrų validacijos gairėmis buvo pasirinkti ir įvertinti šie parametrai [66]:

1) Specifiškumas (angl. Specificity) 2) Rezultatų glaudumas (angl. Precision)

 rezultatų pakartojamumas (angl. Repeatability)

 rezultatų tarpinis preciziškumas (angl. Intermediate Precision) 3) Tiesiškumas (angl. Linearity)

4) Ribos (angl. Range)

 aptikimo riba (angl. Limit of detection)  nustatymo riba (angl. Limit of quantitation)

3.3.1.1. Specifiškumas

Metodikos specifiškumas yra gebėjimas vienareikšmiškai nustatyti analitės buvimą [66]. Norint įvertinti pasirinktos metodikos specifiškumą buvo chromatografuojamas tiriamųjų medžiagų tirpiklio mėginys (eliuentas), tiriamasis mėginys (tiriamųjų vaistų mišinio ekstraktas iš kraujo plazmos), kraujo plazmos matricos mėginys (ekstraktas iš kraujo plazmos be vaistų mišinio), etaloninis palyginamasis mėginys (etaloninis mišinys). Junginių įvertinimas atliktas prie 230 nm šviesos bangos ilgio. Gautos chromatogramos pateikiamos 18 pav.

Iš pateiktos chromatogramos matyti, kad tirpiklis, kuris naudojamas kaip gradientinė eliuentų sistema (18 pav. a.), netrukdo vaistinių medžiagų nustatymui. O atlikus kraujo plazmos matricos mėginio (be tiriamųjų junginių mišinio) chromatografinį nustatymą (18 pav. c.), nustatyta, jog nėra smailių, kurios galėtų trukdyti vaistinių medžiagų analizei (nėra matricos efekto). Lyginant etaloninio mišinio (18 pav. d.) ir tiriamojo vaistų mišinio, išskirto iš kraujo plazmos, (18 pav. b.) smailes pagal sulaikymo laikus matyti, kad jos sutampa.

Taip pat buvo užregistruoti etaloninių ir tiriamųjų medžiagų smailių UV absorbcijos spektrai, ir palyginti su literatūroje pateiktais etaloninių medžiagų UV šviesos sugerties spektrais (8 lentelė). Buvo nustatyta, kad jie sutampa, todėl galima daryti išvadą, kad pasirinktos UESC metodikos specifiškumas tenkina visus reikalavimus.

8 lentelė. A – Propranololio, diltiazemo, verapamilio ir nifedipino literatūroje pateikti UV absorbcijos spektrai; B – UV absorbcijos spektrai gauti išmatavus fotodiodų matricos detektorium

[25] Jungi

nys

A Literatūroje pateikti etaloniniai UV absorbcijos spektrai

3.3.1.2. Rezultatų glaudumas

Analitinės metodikos rezultatų glaudumas – rezultatų artumas, gaunamas atliekant matavimų seriją, kai yra naudojamas tas pats mėginys, vienodomis analizės sąlygomis [66]. Glaudumas yra įvertintas: pakartojamumu ir tarpiniu preciziškumu. Pakartojamumas yra apskaičiuojamas tą pačią dieną viena po kitos atliekant 6 pakartojimus, tomis pačiomis analizės sąlygomis, naudojant tą patį vaistinių medžiagų etalonų mišinį. Vėliau yra apskaičiuojamas variacijos koeficientas, kitaip vadinamas santykiniu standartiniu nuokrypiu (SSN), kuris išreiškiamas procentais, smailės plotui ir sulaikymo laikui. Jis turi būti ne didesnis kaip 5 proc (9 lentelė).

Tarpinis preciziškumas yra įvertinamas analizuojant tiriamąją analitę 3 dienas iš eilės, atliekant po 6 injekcijas, ankščiau aprašytomis sąlygomis. Iš gautų duomenų apskaičiuojami SSN smailės plotui ir sulaikymo trukmei (9 lentelė).

9 lentelė. Metodikos rezultatų glaudumo įvertinimas

Preparatas

Pakartojamumas Tarpinis preciziškumas

SSN smailės plotui (proc.) SSN sulaikymo laikui (proc.) SSN smailės plotui (proc.) SSN sulaikymo laikui (proc.) Propranololis _{1,2 0,2 1,4 0,3} Diltiazemas _{0,6 0,1 0,7 0,3} Verapamilis _{1,6 0,1 1,8 0,3} Nifedipinas _{1,2 0,1 1,3 0,2}

Pagal gautus rezultatus matome, kad analičių pakartojamumas SSN smailės plotui skiriasi. Propranololio yra 1,2 proc., diltiazemo 0,6 proc., verapamilio 1,6 proc., nifedipino 1,2 proc. Tarpinis preciziškumas SSN smailės plotui yra didesnis. Propranololio 1,4 proc., diltiazemo 0,7 proc., verapamilio 1,8 proc., nifedipino 1,3 proc. Analičių pakartojamumas SSN sulaikymo laikui skiriasi nedaug. Propranololio 0,2 proc., diltiazemo, verapamilio, nifedipino 0,1 proc. Tarpinis preciziškumo SSN sulaikymo laikui yra didesnis. Propranololio, diltiazemo, verapamilio 0,3 proc., nifedipino 0,2 proc.

3.3.1.3. Tiesiškumas ir ribos

Nustatytose ribose tiesiškumas nusako smailės ploto tiesinę priklausomybę nuo analitės koncentracijos [66]. Tiesiškumas įvertintas kalibravimo kreivės metodu (19-22 pav.). Etaloninių medžiagų propranololio, diltiazemo, verapamilio kalibraciniai grafikai yra sudaryti 0,1 – 0,003125 mg/ml ribose, o nifedipino kalibracinis grafikas sudarytas 0,1 – 0,00625 mg/ml ribose. Nustatomas koreliacijos koeficientas R2, kurio reikšmė turi būti ne mažesnė kaip 0,98 (10 lentelė).

10 lentelė. Propranololio, diltiazemo, verapamilio ir nifedipino kalibracinių kreivių charakteristikos Preparatas Sulaikymo laikas (min) Koreliacijos koeficientas R2 Kalibracinės kreivės lygtis Tiesiškumo ribos (mg/ml) Propranololis 4,105 0,9991 y = 2,87∙10 6 x – 8,72∙103 0,1 – 0,003125 mg/ml Diltiazemas 4,416 0,9995 y = 7,07∙10 6 x – 1,95∙104 0,1 – 0,003125 mg/ml Verapamilis 4,770 0,9999 y = 4,63∙10 6 x – 9,83∙103 0,1 – 0,003125 mg/ml Nifedipinas 5,117 0,9992 y = 1,70∙10 6 x – 3,69∙104 0,1 – 0,00625 mg/ml