4. MATERIALI E METOD
4.4. Metodi di caratterizzazione
4.4.4. Rilascio in vitro
Per determinare la cinetica di rilascio delle molecole nel tempo, le microsfere di PLGA vengono poste in una soluzione di PBS 1X. Per ogni
51
tempo sperimentale si quantifica, successivamente, quanto bioattivo viene rilasciato in relazione al tempo. L’esperimento viene svolto in triplo per avere maggiori informazioni sui dati e un ulteriore confronto.15 mg di microsfere liofilizzate aggiunte a 1.3 ml di una soluzione di PBS 1X (pH=7.4) a 37°C, 0.005% (w/v) PVA e sodio azide allo 0.01/ (w/v). Il tensioattivo è stato addizionato al mezzo permette una migliore dispersione delle microsfere; il sodio azide 0.01% (w/v) come agente batteriostatico.
Il mezzo viene mantenuto in agitazione (300 rpm) in un bagno termostatico (37°C). A tempi prefissati, i campioni vengono centrifugati, 1 ml del mezzo viene prelevato e, poi, sostituito con nuova soluzione di PBS. L’aliquota prelevata è destinata all’analisi spettrofotometrica per valutare la quantità complessiva della molecola rilasciata in un arco di tempo [79].
52
5. RISULTATI
Il successo di un DDS è fortemente influenzato dalle caratteristiche del polimero utilizzato nonché dalle proprietà delle microsfere sintetizzate. Un’approfondita conoscenza degli aspetti primari delle particelle spiegano, in seguito, le qualità secondarie.
Per prima cosa, utilizzando la tecnica dell’emulsione sia singola che doppia, sono state prodotte con successo microparticelle di PLGA vuote. Dunque, sono stati fatti due tentativi di incapsulamento con un colorante (CBB) e una proteina (BSA). Infine, si è tentato di incapsulare la molecola di interesse, il VPA. Tutte le formulazioni sono state caratterizzate dal punto di vista morfologico ed in termini di efficienza di incapsulamento e cinetiche di rilascio.
In questo lavoro di tesi sono state realizzate con il metodo della doppia emulsione (W/O/W):
microsfere di PLGA vuote;
microsfere di PLGA caricate con CBB; microsfere di PLGA caricate BSA.
Con il metodo della singola emulsione (O/W) sono state prodotte: microsfere di PLGA vuote;
microsfere di PLGA caricate con VPA;
Figura 30. Microsfere di PLGA caricate con quantità crescenti di CBB da sinistra verso
53
5.1. Analisi morfologica
Le microparticelle ottenute sono state analizzate tutte al SEM. Osservando la superficie si nota che le microsfere vuote mostrano una forma sferica uniformemente liscia. Le microsfere caricate con diverse concentrazioni di CBB sono caratterizzate da una superficie molto porosa e da una forma sferica e definita. Le microsfere caricate con la proteina BSA presentano una forma sferica, una morfologia per la maggior parte liscia.
54
(A) (B)
Figura 32. Microsfere di PLGA caricate con CBB (A) o con BSA (B).
Il protocollo di sintesi di microsfere con il metodo della singola emulsione O/W è stato utilizzato per l’incorporazione di farmaci idrofobi come il VPA. Sono stati testati due protocolli di sintesi: la morfologia e la distribuzione dei diametri risulta pressoché uguale. Tra i due è stata scelta la prima metodica in quanto consente di ottenere una resa maggiore. La prima cosa molto evidente, cambiando il processo e analizzando al SEM, è che se messe a confronto con le microsfere prodotte con la doppia emulsione presentano la stessa morfologia ma distribuzione dei diametri molto più bassa. La superficie delle sfere è liscia e la forma è prettamente sferoidale.
Figura 33. Microsfere in PLGA prodotte con la tecnica della singola emulsione con il
55
Figura 34. Microsfere in PLGA caricate con VPA.
5.2. Distribuzione dei diametri
I campioni analizzati al CILAS presentano microparticelle della grandezza di qualche micron. Analizzando i risultati, è possibile osservare che il diametro medio delle microsfere e la distribuzione dei diametri per il 90% sono di 43 µm, per il 10% sono di 10µm, per il 50% sono di 20 µm. Inoltre, si è notato che il caricamento con un maggior quantitativo di colorante non influisce sul diametro medio. La dimensione delle particelle non varia neanche nel caso delle microsfere caricate con BSA, mostrando come la molecola incorporata non influenza la distribuzione dei diametri. La larghezza della campana di distribuzione indicizzata con il valore di SPAN in ha sempre un valore inferiore a 2.
56
Figura 35. Esempio di istogramma che risulta dall’elaborazione dei dati fatti sulle microsfere
in PLGA.
Tabella 1. Valori dei diametri medi delle PLGA-µS vuote, caricate con CBB e BSA prodotte
con il metodo della doppia emulsione.
Tabella 2. Valori dei diametri medi e distribuzione delle microsfere caricate con VPA
prodotte con il metodo della singola emulsione.
PLGA-μS D10(μm) D50(μm) D90(μm) Dm(μm) SPAN Vuote 1,2 4,7 6,8 5,7 1,19 1 mg VPA 1,3 4,2 7,2 4,6 1,14 20 mg VPA 1,0 5,3 6,5 4,2 1,03 50 mg VPA 1,3 4,5 7,5 4,4 1,37
5.3. Efficienza di incapsulamento
La determinazione delle quantità CBB e BSA incapsulate nelle microparticelle è stata effettuata mediante estrazione con acetonitrile che degrada il polimerico rilasciando le biomolecole e, di seguito, sono state
PLGA-μS D10(μm) D50(μm) D90(μm) Dm(μm) SPAN vuote 10,74 22,7 41,8 24,54 1,37 6 μg CBB 10,77 23, 92 46,67 26,39 1,50 60 μg CBB 13,09 25,62 46,22 27,7 1,30 300 μg CBB 10,52 21,80 39,70 23,54 1,34 600 μg CBB 8,57 17,24 31,14 18,55 1,31 500 μg BSA 11,10 22,60 43,10 25,10 1,40
57
determinate le relative concentrazioni spettrofotometricamente.
Andando ad analizzare le microsfere con il CBB, si è osservato che ogni analita presentava una diversa concentrazione di colorante e i dati ottenuti hanno permesso di evidenziare alcuni aspetti significativi. Le microparticelle caricate con 6 µg di CBB hanno un’efficienza quasi del 100%, quelle con 60 µg ne hanno incapsulato il 75% durante la sintesi,indicando che il sistema è adatto ad incorporare efficacemente il principio attivo. Invece, quelle caricate con 300 µg hanno un’efficienza quasi del 50% mentre le microsfere caricate con 600 µg hanno incorporato solo il 27%. Osservando i dati si intuisce che esiste un limite oltre il quale non si può incorporare ulteriore colorante, infatti, le prove di efficienza di caricamento hanno dato buoni risultati con le microsfere caricate con una quantità iniziale di 6 e 60 µg ma per quelle caricate con 300 µg e 600 µg non hanno avuto un’efficienza buona ovvero entrambi al di sotto del 50%.
Tabella 3. Efficienza di incapsulamento in relazione al [CBB].
CBB iniziale (μg) CBB incorporato (μg) EE (%)
6 6.0 ± 0.6 93 ± 10
60 45 ± 12 75 ± 20
300 142 ± 22 47 ± 8
600 165 ± 22 27 ± 4
Figura 36. All’aumentare del quantitativo di CBB diminuisce l’efficienza di incapsulamento.
0 20 40 60 80 100 120 6 µg 60 µg 300 µg 600 µg E .E . [ % ]
58
Analizzando le microsfere caricate con la BSA si è visto che l’efficienza è quasi del 50 %. Durante la sintesi si è caricato alla fase acquosa o fase dispersa che sarà addizionata alla fase disperdente di PLGA e DCM inizialmente 500 µg di BSA ma durante il procedimento è stato incorporato la metà del quantitativo utilizzato di proteina.
Tabella 4. EE% delle microsfere caricate con la proteina BSA.
BSA iniziale (μg) BSA incorporato (μg) EE%
500 240±12 48±2
In tutti i casi analizzati, l’efficienza di incapsulamento di VPA risulta davvero molto bassa. Probabilmente il motivo di valori così bassi può essere dovuto alla non adeguatezza del sistema utilizzato oppure ad una non adeguatezza del metodo spettrofotometrico scelto per la quantificazione del farmaco in soluzione. Tale seconda prospettiva indirizza studi futuri verso analisi di quantificazione differenti come la spettrometria di massa (HPLC- MS o GC-MS).
Tabella 5. Efficienza di incapsulamento di VPA nelle microsfere in PLGA.
VPA iniziale (mg) VPA incorporato (mg) EE %
1 0.200 2.0%
20 0.110 0.5%
50 0.180 0.4%
5.4. Rilascio in vitro
Dallo studio del rilascio in vitro si conferma la tipica cinetica caratterizzata da un burst release iniziale seguita da una fase di rilascio più lenta che si completa in 4 giorni (100% di rilascio).
Le microparticelle di PLGA caricate con 6 µg di CBB hanno un rilascio quasi immediato e completo già dal primo giorno rispetto alle altre microsfere
59
che hanno un rilascio proporzionale e graduale al quantitativo di CBB caricato. Il rilascio, è di 30 µg per le microsfere caricate con 300 µg di CBB e di 40 µg da quelle con 600 µg di CBB già dal primo giorno. Dal secondo giorno entrambi hanno un rilascio quasi dell’80 µg in quanto la quantità incapsulata è pressocché simile.
Figura 37. Cinetiche di rilascio delle microsfere caricate con diverse [CBB]
Le microsfere caricate con la proteina BSA mostrano subito il burst
release di circa il 40% del totale e già dal primo giorno si osserva un rilascio
superiore all’80%. Dal secondo fino al quarto giorno si ha il rilascio completo della biomolecola.
Figura 38. Rilascio in vitro della BSA dalle microsfere.
0 20 40 60 80 100 0 1 2 3 4 cum ul at ive re le as e [ug ] T [g] 300 µg 600 µg 60 µg 6 µg
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6. CONCLUSIONI
La prima parte di questo lavoro di tesi ha riguardato la messa a punto e l’ottimizzazione di un protocollo di sintesi di microsfere in PLGA con la tecnica dell’emulsione singola olio/acqua (O/W) e doppia acqua/olio/acqua (W/O/W). Inizialmente, la funzionalità di tale carrier è stata testata mediante l’incorporazione di due sostanze modello, il colorante Coomassie Brilliant Blue R 250 (CBB) e la proteina Albumina Sierica Bovina (BSA), con la tecnica della doppia emulsione. Successivamente, il sistema di delivery, prodotto con la tecnica della singola emulsione, è stato ottimizzato per l’incapsulamento della molecola scelta, il VPA. A tal fine è stata condotta una caratterizzazione funzionale mediante lo studio morfologico, dell’efficienza di incapsulamento e della cinetica di rilascio. Dai risultati ottenuti si evince che tutti i sistemi prodotti presentano una morfologia sferica e una distribuzione dei diametri mediamente omogenea, nell’ordine di poche decine di micron. Purtroppo, risultati non soddisfacenti si sono ottenuti riguardo l‘efficienza di incapsulamento di VPA, valutata attraverso un metodo colorimetrico.
Risulta dunque necessario indagare circa l’efficienza di incapsulamento mediante tecniche più avanzate e sensibili come l’HPLC-MS o la GC-MS.
La strategia adottata prevede la veicolazione di VPA in microsfere di PLGA in modo tale da realizzare un sistema di rilascio controllato nel tempo che protegga il farmaco dai fenomeni degradativi fisiologici. La realizzazione e l’ottimizzazione di tale formulazione permetterebbe di ottenere dei DDS che siano in grado di rallentare la senescenza cellulare in vitro.
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RINGRAZIAMENTI
Ringrazio l’Ingegnere Luca Salvatore ed il Professore Alessandro Sannino per la disponibilità dimostratami e per avermi dato l’opportunità di svolgere questa esperienza presso l’Università del Salento.
Un ringraziamento speciale alla Dottoressa Nunzia Gallo e alla Dottoressa Maria Lucia Natali che mi hanno seguita e supportata durante tutto il percorso, consigliandomi e guidandomi nel lavoro svolto.
Non posso non menzionare la Professoressa Clementina Manera che mi ha sostenuta nella realizzazione del progetto di tesi.
Grazie ai miei genitori e a mio marito per aver compreso e condiviso con me ogni forzo e momento di difficoltà.
Infine, vorrei dedicare questo piccolo traguardo a mio figlio che ha contribuito a darmi la forza per concludere il mio percorso universitario.