STUDI FUNZIONALI IN VITRO
RISULTATI Analisi morfometrica
La superficie di tessuto pancreatico studiata, una sezione per ciascun donatore, era comparabile nei due gruppi, aveva un’area di 21,32,2 mm2 (6,8-38,3 mm2) nei donatori
non-diabetici e 22,81,7 mm2 (9,1-33,8 mm2) nei soggetti con diabete di tipo 2. Il tessuto
adiposo intra-acinare aveva una superficie di 1,230,4 mm2, corrispondente al 5,41,9%
di tessuto pancreatico, nei controlli non-diabetici, e un’area di 1,540,31 mm2, corrispon-
dente al 6,81,2% della superficie studiata nei soggetti diabetici tipo 2. Nessuna diffe- renza è stata riscontrata tra i due gruppi, sia in termini di superficie di tessuto adiposo (p=0,387) che relativamente alla percentuale di tessuto adiposo intra-acinare (p=0,412) (tabella 2).
Tabella 2: Caratteristiche morfometriche delle sezioni pancreatiche studiate, e propor-
zione del contenuto di adiposo.
Superficie tessuto pancreatico (mm2)
Area tessuto adiposo (mm2)
Proporzione tessuto adiposo (%)
ND 21,3±2,2 1,23±0,4 5,4±1,9
DMT2 22,8±1,7 1,54±0,31 6,8±1,2
Valore di p 0,583 0,387 0,412
L’area insulino-positiva era 0,120,02 mm2 nei soggetti non-diabetici e 0,110,02 mm2
nei soggetti diabetici di tipo 2 (p=0,636); corrispondenti al 0,60,1 % e 0,50,1% di su- perficie di tessuto acinare, rispettivamente. Tra i due gruppi non è stata riscontrata al- cuna differenza (p=0,184).
L’area glucagone-positiva era 0,07±0,01 mm2, corrispondente al 0,3±0,1% di superficie
di tessuto acinare, nei soggetti non-diabetici e 0,06±0,01 mm2, corrispondente a
0,2±0,0% di superficie nei soggetti diabetici; anche in questo caso le differenze tra i gruppi non erano significative (p=0.391) per le aree glucagone-positive e per la percen- tuale di superficie glucagone-positiva (p=0.102). I rapporti tra le percentuale dell’area
insulino-positiva e glucagone-positiva, erano 2,1±0,3 nei soggetti non diabetici e 2,2±0,3 nei diabetici (p=0,476).
Caratteristiche del tessuto adiposo: numero degli adipociti, caratteristiche morfo- metriche e morfologiche
Il numero degli adipociti contati nel tessuto acinare era 198±56 nei soggetti non-diabetici e 183±39 nei soggetti diabetici (p=0,916); il loro numero per unità di superficie era 9±2 nei soggetti non diabetici e 8±1 nei diabetici (p=0,856). Le dimensioni degli adipociti, ottenute dal rapporto tra superficie di tessuto adiposo e numero di adipociti contati, sono risultati di 5457±563 m2 nei non-diabetici e 8890±934 m2 nei soggetti diabetici, la cui
differenza è risultata significativa (p<0,01).
Le caratteristiche morfologiche del tessuto adiposo sono state studiate valutando la di- stribuzione dei singoli adipociti e dei loro raggruppamenti, che è risultata essere 75±4% SA, 21±3% GA 2-5, 2±1% GA 6-10 e 2±1% GA >10 nei non-diabetici; e 74±2% SA, 21±2% GA 2-5, 2±1% GA 6-10 e 3±1% GA >10 nei soggetti diabetici, senza alcuna differenza tra i due gruppi. Anche la densità di distribuzione delle singole classi per mil- limetro quadro di tessuto non mostrava differenze: 2,7±0,5 per SA, 0,9±0,2 per GA 2-5 e 0,1±0,1 per GA 6-10 e per GA >10 nei soggetti non-diabetici; 2,9±0,5 SA, 0,9±0,2 GA 2-5 e 0,1±0,0 per GA 6-10 e GA >10 nei soggetti diabetici (tabella 3).
Tabella 3: Distribuzione delle quattro classi morfologiche in cui sono stati classificati i
raggruppamenti degli adipociti.
SA GA (2-5) GA (6-10) GA>10
n % n % n % n %
ND 2,7±0,5 75±4 0,9±0,2 21±3 0,1±0,1 2±1 0,1±0,1 2±1
Conteggio delle isole
Il conteggio delle isole, eseguito sulle sezioni di tessuto pancreatico di 11 soggetti non- diabetici e 15 soggetti diabetici ha rilevato un numero di isole per unità di superficie di 3,5±0,3 nei controlli non-diabetici e 2,2±0,2 nei soggetti diabetici (p<0,01).
Caratterizzazione morfometrica delle isole
La caratterizzazione morfometrica delle isole è stata eseguita sulle sezioni pancreatiche di 3 controlli non-diabetici e tre soggetti con diabete, per lo studio sono state valutate da 6 a 11 isole per ciascun donatore. L’area insulare è risultata 2.483,4±502,6 μm2 nei sog-
getti non-diabetici e 10.716,6±5.145,5 μm2 nei soggetti diabetici (p=0,136). Le percen-
tuali di superficie insulare insulino-positiva e glucagone-positiva sono risultate 80,3±3,3% e 12,8±2,8% nei soggetti non-diabetici; e 56,7±4,3% e 21,4±3,6% nei sog- getti diabetici, con una differenza significativa tra i due gruppi per quanto riguarda la superficie insulare insulino-positiva (p<0.05), mentre per la superficie glucagone-positiva non è stata riscontrata alcuna una differenza (p=0.202).
Dati di funzione
La funzionalità β-cellulare è stata studiata valutando il rilascio insulinico in risposta a glucosio 3,3 e 16,7 mM, alla glibenclamide 100 M e all’arginina 20 mM. Lo studio ha evidenziato che i due gruppi non differivano tra loro per quanto riguarda il rilascio insuli- nico in risposta a glucosio 3,3 mM e 16,7 mM, e alla arginina 20 mM; mentre si osservava una significativa riduzione del rilascio insulinico in risposta a glibenclamide 100 M (p=0,046) (tabella 4)
Tabella 4: Rilascio insulinico in risposta al glucosio 3,3 e 16,7 mM, glibenclamide 100
Me arginina 20 mM.
Rilascio insulinico (μU/isola /minuto) Valore di p Soggetti non-diabetici
(n=13)
Soggetti diabetici di tipo 2 (n=13)
Glucosio 3,3 mM 0,03±0,01 0,03±0,01 0,272
Glucosio 16,7 mM 0,11±0,05 0,07±0,04 0,088
Glibenclamide 100 M 0,10±0,04 0,07±0,03 0,046
Arginina 20 mM 0,07±0,04 0,07±0,03 0,706
L’indice di stimolo (IS), che fornisce informazioni circa la sensibilità della β-cellula ai di- versi secretagoghi, ha evidenziato una significativa riduzione della risposta a glucosio 16,7 mM e glibenclamide 100 M nel gruppo dei soggetti diabetici rispetto ai non-diabe- tici, con p<0,01 per entrambe le condizioni. Mentre non è stata riscontrata alcuna diffe- renza relativamente allo stimolo con all’arginina (tabella 5).
Tabella 5: Indice di stimolo in risposta al glucosio 16,7 mM, glibenclamide 100 µM e
arginina 20 mM.
Indice di stimolo Valore di p
Soggetti non-diabetici (n=13)
Soggetti diabetici di tipo 2 (n=13)
Glucosio 16,7 mM 3,6±1,1 2,1±0,8 <0,01
Glibenclamide 100 M 3,6±1,5 2,0±0,6 <0,01
Discussione
Il DMT2 è una malattia complessa, caratterizzata da una riduzione della massa funzio- nale beta-cellulare (53) a cui risulta frequentemente associata la deposizione ectopica e la disfunzione del tessuto adiposo (8). Tra gli organi interessati dalla deposizione ecto- pica di grasso vi è il pancreas, osservazione documentata dalla analisi istologica del tessuto e caratterizzata dalla presenza di adipociti distribuiti tra le cellule esocrine (54- 55). Studi autoptici condotti sul pancreas in toto hanno riportato che il grasso pancreatico si caratterizza anche per la presenza di aree di infiltrazione intralobulare o perilobulare (55), o per la presenza di grasso infiltrante e dissecante le isole (56).
Il nostro studio ha valutato, mediante analisi morfometrica (50) e morfologica, il conte- nuto e le caratteristiche del tessuto adiposo intra-acinare in sezioni di tessuto pancrea- tico ottenute da 13 soggetti non-diabetici e 15 soggetti con DMT2, i due gruppi erano comparabili per età, genere, IMC. L’analisi non ha evidenziato alcuna differenza nel con- tenuto di grasso tra soggetti con DMT2 e controlli non diabetici, sebbene il contenuto di grasso fosse di poco superiore nei DMT2 (6,81,2%) rispetto ai non diabetici (5,41,9%); questo in accordo con quanto precedentemente rilevato mediante analisi istologica e strumentale in uno studio che, come il nostro, ha valutato popolazioni con caratteristiche cliniche (età, genere, IMC) omogenee (58). Analogamente al contenuto di tessuto adi- poso, i due gruppi non differivano per il numero di adipociti, espresso per unità di super- ficie. Entrambi i parametri mostravano però una notevole variabilità tra i vari soggetti nell’ambito di ciascun gruppo, interessando maggiormente i controlli e contrariamente a quanto riportato in uno studio in cui la variabilità del contenuto adiposo aumentava al decrescere della tolleranza glucidica (59). Nel nostro studio, omogenea tra i due gruppi è risultata anche la distribuzione degli adipociti nelle quattro classi morfologiche, in cui arbitrariamente sono stati suddivisi, allo scopo di individuare una qualche variante bio- logica che potesse correlare con la presenza o meno dello stato diabetico. La caratteri- stica morfologica risultata diversa tra i due gruppi è stata la dimensione dell’adipocita,
significativamente più elevata nei DMT2 (8890±934 m2) rispetto ai non diabetici
(5457±563 m2; p<0,01). Questa sembra essere una caratteristica della condizione dia-
betica, osservata già nel tessuto adiposo viscerale e sottocutaneo di soggetti affetti da DMT2 rispetto ai controlli non diabetici (59), e confermata con questo studio nel tessuto pancreatico. L’ipertrofia dell’adipocita costituisce l’epifenomeno di un sovraccarico lipi- dico, si associa ad ipossia (60), è l’elemento caratterizzante la disfunzione del tessuto adiposo (8) e comporta un cambiamento del fenotipo biologico dell’adipocita stesso (61). Tutto questo potrebbe avere un effetto negativo sulla funzione beta cellulare con diversi possibili meccanismi, non esplorati nel nostro studio. Il rilascio di acidi grassi liberi e/o di adipochine regolatorie (leptina, apelina, resistina, RBP4), venendo rispettivamente cap- tati e metabolizzati dalle beta cellule (10), o agendo con meccanismo paracrino e/o en- docrino, potrebbe influenzare negativamente la funzione beta cellulare (62, 63). A questo potrebbe aggiungersi il rilascio di citochine pro-infiammatorie e il richiamo di cellule pro- infiammatorie anche a livello pancreatico, con conseguente rilascio da parte di queste cellule di citochine e/o chemochine con effetto citostatico sulla funzione beta cellulare (64).
Il nostro studio, ha inoltre valutato le caratteristiche morfometriche delle isole pancreati- che e le caratteristiche funzionali delle beta cellule. Le aree insulino-positiva e gluca- gone-positiva erano comparabili nei due gruppi, contrariamente a quanto osservato da altri autori che hanno invece descritto una riduzione dell’area insulino-positiva nel pan- creas di soggetti DMT2 rispetto ai controlli non diabetici (33,65), e talora solo differenze minori tra i due gruppi (66-68). In accordo con altri studi (31,69), nei soggetti DMT2 è stata invece riscontrata una riduzione del numero di isole per unità di superficie, di circa il 40% rispetto ai controlli non diabetici, condizione che si associava ad un aumento di dimensioni delle stesse nella popolazione diabetica, sebbene la differenza non fosse
statisticamente significatività. Di rilievo è il riscontro nei DMT2 di una percentuale di su- perficie insulare insulino-positiva (56,7±4,3%) significativamente ridotta rispetto a quella dei soggetti non diabetici (80,3±3,3%; p<0,05). La discrepanza tra i dati morfometrici ottenuti nel nostro studio e quelli di altri autori necessitano un approfondimento; tuttavia è interessante notare che nelle isole di soggetti diabetici la quota di cellule non-insulino positive e non-glucagone positive risulta essere superiore (circa 23%) rispetto alle isole di soggetti non-diabetici (circa 8%). Questa quota di cellule non-insulino positive e non- glucagone positive è verosimilmente in parte dovuta alla presenza di cellule endocrine (somatostatina-positive, PP-positive, che rappresentano rispettivamente l’1% e meno del 2% delle cellule insulari), per le quali non è stata fatta la colorazione specifica, ma in gran parte potrebbe trattarsi di cellule endocrine degranulate (48) o dediffrenziate (70). La valutazione della funzionalità beta cellulare ha evidenziato una compromissione del rilascio insulinico in risposta a glucosio e alla glibenclamide. E’ verosimile che nella con- dizione diabetica diversi fattori, oltre al danno da acidi grassi (10,11), possano intervenire nella determinazione del danno funzionale. D’altra parte, gli studi che hanno correlato il contenuto di grasso nel pancreas con la funzione della beta cellula in vivo, in un caso hanno evidenziato una correlazione negativa tra contenuto di grasso e i parametri della funzione beta cellulare in soggetti con alterazioni del metabolismo glucidico (71), e in un altro caso è stata invece riscontrata una correlazione negativa tra contenuto di grasso e funzione beta cellullare nei soggetti non diabetici, piuttosto che nel gruppo dei DMT2 (72).
Per una completa comprensione del possibile coinvolgimento del tessuto adiposo intra- parenchimale nella eziopatogenesi e/o evoluzione della malattia diabetica di tipo 2, ulte- riori approfondimenti sono necessari. La valutazione della presenza e del tipo di even- tuali cellule infiammatorie infiltranti potrebbe contribuire alla determinazione del danno funzionale beta cellulare, come anche e non meno rilevante, lo studio del secretoma degli adipociti (73), sia quelli presenti nel pancreas di soggetti non diabetici che quelli
nel pancreas di soggetti con DMT2, allo scopo di identificare ed eventualmente contra- stare l’effetto di molecole specificatamente sintetizzate e rilasciate dagli adipociti pan- creatici ipertrofici.
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