4.1. I controlli interni
I controlli interni dei kit ELISA hanno mostrato dei valori di assorbanza tutti rientrati nei valori attesi, come mostato in tabella 12.
Il controllo positivo del kit ELISA DIA.PRO ha dato come risultato un “overflow”, ad indicare il superamento del valore massimo di assorbanza dello spettrofotometro utilizzato e non quantificabile in valore di
assorbanza.
Tabella 12 – Valori di Assorbanza (OD) dei controlli dei kit ELISA Kit ELISA Substrato
Bianco Controllo Negativo Controllo Cut-off Controllo Positivo Controllo Calibratore DRG® Malaria ELISA 0.025 0.064 0.522 0.567 1.675 NovaLisa 0.035 0.061 0.163 0.303 0.867 Euroimmun 0.090 0.921 0.311 DIA.PRO 0.056 0.123 ovf* 0.892 1.951 *overflow
4.2. Curve standard
Analizzando i grafici delle curve standard e considerando che:
- per il kit ELISA DRG® Malaria ELISA, solo lo standard 3 è overflow, lo
ST4 è maggiore dello ST3, il CV medio è pari al 6% con n°7 campioni validi;
- per il kit ELISA NovaLisa, lo ST1 è overflow, il CV medio è del 7% con n° 9 campioni validi;
- per il kit ELISA Euroimmun, lo ST1 è overflow, il CV medio è del 5% con n°8 campioni validi;
- per il kit ELISA DIA.PRO, ci sono n°5 standard overflow, il CV medio è del 10% con n°5 campioni validi;
- c'è una buona correlazione tra i valori di assorbanza (OD) e le unità di anticorpi/ml di standard per ogni curva costruita,
le curve standard dei kit ELISA DRG® Malaria ELISA e NovaLisa sono
abbatanza tipiche, quella del kit ELISA DIA.PRO è meno tipica ma considerando solo 5 punti, è accettabile.
Mentre, la curva per il kit ELISA Euroimmun risulta essere la migliore con il tipico andamento sigmoide.
Nel complesso, i test ELISA risultano validi.
Le figure 6, 7, 8 e 9 mostrano i grafici delle curve standard dei quattro kit ELISA saggiati, dove i valori degli OD sono in funzione del numero dello standard e quindi delle unità di anticorpi/ml.
Figura 7 – Curva Standard per il kit NovaLisa
Figura 8 – Curva Standard per il kit EUROIMMUN
4.3. Sensibilità
La sensibilità di ciascun test ELISA calcolata usando come test di
riferimento, da un lato l’emoscopia e dall’altro l’IFAT, è mostrata in tabella 13. In confronto all’emoscopia, la sensibilità varia dal 45,7% al 52,2%, mentre per l’IFAT dal 51,8% al 60,7%.
Questi livelli di sensibilità sono ritenuti insoddisfacenti per entrambi i confronti. Il kit ELISA, che mostra maggior sensibilità in entrambi i casi, è il kit DIA.PRO.
Tabella 13 – Sensibilità dei kit ELISA
4.4. Specificità
Tutti i sieri, appartenenti ad entrambi i gruppi di controlli negativi, hanno avuto esito negativo e la specificità calcolata è risultata del 100% per ogni kit ELISA.
4.5. Riproducibilità
4.5.1. Riproducibilità intra-laboratorio
Il coefficiente di variazione (CV) dei campioni testati in duplicato, all’interno del laboratorio (AOUP), ha superato la soglia del 20% per: - 2 campioni per il kit DRG® Malaria ELISA
- 1 campione per i kit NovaLisa - 1 campione per i kit Euroimmun
Test di riferimento
Sensibilità (%) DRG®
Malaria ELISA
NovaLisa Euroimmun DIA.PRO
Emoscopia (N=46)
50,0 50,0 45,7 52,2
- 6 campioni per il kit DIA.PRO
Il CV minimo è stato dello 0% per 2 campioni per il kit ELISA Euroimmun ed il CV massimo è stato del 42% per 1 campione per il kit Euroimmun. Nel complesso, il CV medio dei kit ELISA DRG® Malaria ELISA, NovaLisa ed Euroimmun è comparabile, mentre il più alto è quello del kit ELISA DIA.PRO. Quindi, i kit ELISA NovaLisa ed Euroimmun mostrano una
miglior riproducibilità intra-laboratorio, rispetto ai kit DRG® Malaria ELISA e DIA.PRO.
I risultati sono riassunti in tabella 14.
Tabella 14 - Riproducibilità intra-laboratorio (CV%) dei quattro kit ELISA
DRG®
Malaria
ELISA NovaLisa Euroimmun DIA.PRO
N CV>20% 2 1 1 6 N Totale 15 17 17 15 % CV>20% 13% 6% 6% 40% CV medio 11% 8% 8% 18%
N= numero dei campioni
Mentre, la concordanza tra gli esiti positivo/negativo, in termini di percentuale, dei sieri testati in duplicato, all’interno del laboratorio (AOUP), è stata del:
- 90% per la coppia di kit DRG® Malaria ELISA e Euroimmun; - 90% per la coppia di kit DRG® Malaria ELISA e NovaLisa; - 80% per la coppia di kit DRG® Malaria ELISA e DIA.PRO; - 80% per la coppia di kit Euroimmun e DIA.PRO;
- 65% per la coppia di kit NovaLisa e DIA.PRO.
Ed il coefficiente di Kappa di Cohen, è stato, per la coppia di kit ELISA: - DRG® Malaria ELISA - Euroimmun K= 0.80;
- DRG® Malaria ELISA - NovaLisa K= 0.80; - DRG® Malaria ELISA - DIA.PRO K= 0.60; - Euroimmun e DIA.PRO k=0.60;
- Euroimmun e NovaLisa k=0.84;
- NovaLisa e DIA.PRO k=0.23 (vedi tab.15).
In base ai criteri interpretativi del kappa di Cohen della tabella 11, la concordanza è:
eccellente per la coppia di kit Euroimmun–NovaLisa;
buona per le coppie di kit DRG® Malaria ELISA–Euroimmun e DRG® Malaria ELISA;
moderata per le coppie di kit DRG® Malaria ELISA - DIA.PRO e Euroimmun e DIA.PRO;
modesta per la coppia di kit NovaLisa e DIA.PRO.
Nel complesso, questo risultato ci mostra, ulteriormente, una miglior riproducibilità intra-laboratorio dei kit Euroimmun–NovaLisa rispetto agli altri kit ELISA.
Tabella 15 – Concordanza intra-laboratorio dei kit ELISA DRG® Malaria – NovaLisa DRG® Malaria – Euroimmun DRG® Malaria – DIA.PRO Euroimmun -NovaLisa NovaLisa – DIA.PRO Euroimmun– DIA.PRO N° risultati concordi 18 18 16 14 14 18 N° risultati discordi 2 2 4 2 6 2 N° Totale 20 20 20 20 20 20 Concordanza 90% 90% 80% 93% 65% 80% Kappa di Cohen 0.80 0.80 0.60 0.84 0.23 0.60
4.5.2. Riproducibilità inter-laboratorio
Il coefficiente di variazione (CV) dei 10 sieri a titolo noto IFAT, analizzati nei due Laboratori (AOUP e Negrar) ha superato la soglia del 20% per: - 6 campioni per il kit ELISA DRG® Malaria ELISA
- 9 campione per i kit ELISA NovaLisa - 5 campione per i kit ELISA Euroimmun - 10 campioni per il kit ELISA DIA.PRO
Il CV minimo è stato dello 0% per 1 campioni per il kit ELISA Euroimmun ed il CV massimo è stato del 102% per 1 campione per il kit Euroimmun. Il CV medio del kit Euroimmun è il più basso tra quelli degli altri kit ELISA. Nel complesso, i kit ELISA saggiati mostrano una riproducibilità inter-
laboratorio non soddisfacente, sebbene, il kit Euroimmun sia il kit con più campioni con CV≤20%.
I risultati sono riassunti in tabella 16.
Tabella 16 – Riproducibilità inter-laboratorio (CV%) dei kit ELISA
N= numero dei campioni
La concordanza tra gli esiti positivo/negativo dei 10 sieri IFAT, testati con i quattro diversi kit ELISA nei due Laboratori (AOUP e CMT di Negrar), è stata del:
DRG®
Malaria
ELISA NovaLisa Euroimmun DIA.PRO
N CV>20% 6 9 5 10 N Totale 10 10 10 10 % CV>20% 60% 90% 50% 100% CV medio 36% 53% 33% 47%
- 100% per il kit ELISA Euroimmun;
- 80% per i kit DRG® Malaria ELISA e kit ELISA NovaLisa; - 70% per il kit ELISA DIA.PRO. (vedi tab.17)
Mentre, il coefficiente kappa di Cohen è risultato uguale a: - 1 per il kit Euroimmun
- 0.62 per il kit DRG® Malaria ELISA - 0.60 per il kit NovaLisa
- 0.44 per il kit DIA.PRO
In base ai criteri interpretativi del kappa di Cohen della tabella 11, il kit ELISA Euroimmun, rispetto agli altri kit ELISA testati, mostra un’eccellente concordanza tra gli esiti positivo/negativo dei sieri analizzati nei due
laboratori.
Tabella 17 – Concordanza inter-laboratorio (AOUP-CMT di Negrar) tra i kit ELISA
Campione CONCORDANZA
ID DRG® NovaLisa Euroimmun DIA.PRO
3589 si si si si 3028 si si si si 1795 si si si no 3414 no no si no 16 si no si no 4307 si si si si 2106 si si si si 3451 no si si si 2375 si si si no 1090 si si si si N° Concordi 8 8 10 7 Concordanza 80% 80% 100% 70% Kappa di Cohen 0.62 0.60 1 0.44
4.6. Confronto dei risultati dei diversi kit ELISA 4.6.1. Correlazione (R2) tra indici
Sulla base dei seguenti risultati dei coefficienti di correlazione R2 tra gli
indici della coppia di kit ELISA:
- DRG® Malaria ed Euroimmun con R2 = 0.22
- DRG® Malaria e NovaLisa con R2 = 0.75
- DRG® Malaria e DIA.PRO con R2 = 0.10
- NovaLisa e Euroimmun con R2 = 0.23
- NovaLisa e DIA.PRO con R2 = 0.08
- Euroimmun e DIA.PRO con R2 = 0.02
la correlazione tra indici è:
alta tra DRG® Malaria ELISA e NovaLisa
bassa tra DRG® Malaria ELISA ed Euroimmun, tra NovaLisa ed Euroimmun
assente tra DIA.PRO e tutti gli altri kit ELISA. Questa correlazione è illustrata nei grafici da 2 a 7.
Alla luce di questi risultati, l’esito dello screening del donatore di sangue potrebbe essere diverso a seconda del kit ELISA utilizzato, come descritto nel prossimo paragrafo.
Grafico 3 – Correlazione tra i kit DRG® Malaria ELISA ed Euroimmun
Grafico 4 – Correlazione tra i kit DRG® Malaria ELISA e DIA.PRO
Grafico 5 – Correlazione tra i kit NovaLisa ed Euroimmun
Grafico 6 – Correlazione tra i kit NovaLisa e DIA.PRO
Grafico 7 – Correlazione tra i kit Euroimmun e DIA.PRO
4.6.2. Concordanza tra gli esiti
I risultati ottenuti dall’esecuzione dei quattro saggi eseguiti su 37 sieri dei donatori di sangue sono stati:
- 13 positivi, 23 negativi e 1 dubbio per il kit DRG® Malaria ELISA - 28 positivi, 5 negativi e 4 dubbi per il kit NovaLisa
- 13 positivi, 22 negativi, 1 dubbio e 1 ovf per il kit Euroimmun - 11 positivi, 25 negativi e 1 dubbio per il kit DIA.PRO
La percentuale degli esiti positivi è stata del: - 35% per il kit DRG® Malaria ELISA
- 76% per il kit NovaLisa - 36% per il kit Euroimmun - 30% per il kit DIA.PRO
Un totale di 14 sieri sono stati identificati come positivi da tutti i kit ELISA; altri 3 sieri sono stati identificati come positivi da tutti i kit ELISA, ad
eccezione del kit DRG® Malaria ELISA, che sembra essere, quindi, meno sensibile.
Un totale di 4 sieri sono stati identificati come negativi da tutti i kit ELISA, altri 12 sieri sono stati identificati come negativi da tutti i kit ELISA, ad eccezione del kit ELISA NovaLisa, che sembra essere meno specifico. Inoltre, 10 sieri hanno dato esiti molto diversi per i quattro kit ELISA. Ma, tutti sono risultati positivi con il kit NovaLisa.
Da questi dati, il kit ELISA NovaLisa risulta essere il saggio che dà più esiti positivi anche rispetto al kit DRG® Malaria, nonostante la buona
correlazione tra gli indici, e questo sembra dipendere dal fatto che il cut- off di NovaLisa è più basso (0.223 invece di 0.545). E ciò pone una riflessione sull’impatto del cut-off sull’esito dell’esame.
Inoltre, la concordanza tra gli esiti positivo/negativo, in termini di percentuale, dei sieri dei donatori (N=37 o 43), è stata del:
- 58% per la coppia di kit DRG® Malaria ELISA e NovaLisa - 76% per la coppia di kit DRG® Malaria ELISA e Euroimmun; - 84% per la coppia di kit DRG® Malaria ELISA e DIA.PRO; - 62% per la coppia di kit NovaLisa e Euroimmun;
- 56% per la coppia di kit NovaLisa e DIA.PRO - 84% per la coppia di kit Euroimmun eDIA.PRO.
Mentre, il coefficiente di Kappa di Cohen, è stato, per la coppia di kit ELISA:
- DRG® Malaria ELISA e NovaLisa k=0.27 - DRG® Malaria ELISA e Euroimmun k=0.48 - DRG® Malaria ELISA e DIA.PRO k=0.65 - NovaLisa e Euroimmun k=0.33
- NovaLisa e DIA.PRO k=0.25 - Euroimmun e DIA.PRO k= 0.65
In base ai criteri interpretativi del kappa di Cohen della tabella 11, la concordanza è:
- buona per le coppie di kit DRG® Malaria - DIA.PRO e Euroimmun - DIA.PRO;
- moderata per la coppia di kit DRG® Malaria ELISA e Euroimmun; - modesta per le restanti coppie di kit ELISA.
La concordanza complessiva tra gli esiti positivo/negativo tra i quattro kit ELISA è mostrata nella tabella 19.
Tabella 19 – Concordanza tra i kit ELISA nei sieri dei donatori di sangue
DRG® Malaria – NovaLisa DRG® Malaria – Euroimmun DRG® Malaria – DIA.PRO NovaLisa – Euroimmun NovaLisa – DIA.PRO Euroimmun –DIA.PRO N° risultati concordi 25 28 36 23 24 31 N° risultati discordi 18 9 7 14 19 6 N° Totale 43 37 43 37 43 37 Concordanza 58% 76% 84% 62% 56% 84% Kappa di Cohen 0.27 0.48 0.65 0.33 0.25 0.65
4.7. Corrispondenza tra indice ELISA e titolo IFAT
E’ stata verificata l'associazione tra l'indice ELISA di ciascuno dei 4 kit e il titolo IFAT ed è stato osservato, sia graficamente (vedi grafici 12-15) sia statisticamente (regressione lineare, dati non mostrati), che esiste una certa associazione tra i due parametri misurati. Ma, questa associazione non è sufficientemente forte da determinare una corrispondenza che permetta di assegnare un indice ELISA ad un determinato titolo IFAT.
Grafico 12 - Boxplot del kit DRG® Malaria ELISA
Grafico 14 - Boxplot del kit ELISA NovaLisa