UNIVERSITA’ DI PISA
Dipartimento di Ricerca Traslazionale e delle Nuove Tecnologie in Medicina e Chirurgia
Scuola di Specializzazione in Microbiologia e Virologia
Tesi di Specializzazione
"Screening dei donatori di sangue per anticorpi
anti-Plasmodium"
CANDIDATA RELATORI
Dott.ssa Franca Migliaccio Chiar.mo Prof. Fabrizio Bruschi Dott.ssa Valentina Mangano
INDICE
1. INTRODUZIONE...4
1.1 Generalità sulla malaria...4
1.2 Ciclo vitale del parassita...5
1.3 Clinica della malaria...7
1.4 Risposta anticorpale alla malaria...10
1.5 Diagnosi della malaria...12
1.6 Epidemiologia...16
1.7 La malaria in Italia...18
1.7.1 Cenni storici...18
1.7.2 Storia recente...18
1.7.3 Decreto del 2 Novembre 2015...22
1.8 Screening dei donatori di sangue nell’Azienda...23
Ospedaliero-Universitaria di Pisa 2. SCOPO ED OBIETTIVI DELLA TESI...24
3. MATERIALI E METODI...25
3.1.Campioni analizzati...25
3.1.1 Campioni dei donatori di sangue...25
3.1.2 Campioni a titolo noto IFAT...27
3.1.3 Curva standard...28
3.2.Metodiche ELISA...29
3.2.1. I kit ELISA...29
3.2.2. Esecuzione del test ELISA...30
3.2.3. Reagenti...32
3.3.1. Controlli interni...34
3.3.2. Calcolo degli indici di assorbanza...35
ed interpretazione degli esiti 3.3.3. Curve standard...36
3.3.4. Sensibilità...36
3.3.5. Specificità...37
3.3.6. Riproducibilità...38
3.3.6.1. Coefficiente di Variazione...38
3.3.6.2. Concordanza tra gli esiti...39
3.3.7. Confronto dei risultati dei diversi kit ELISA...41
3.3.7.1. Correlazione (R2) tra indici...41
3.3.7.2. Concordanza tra gli esiti...42
3.3.8. Corrispondenza tra indici ELISA e titolo IFAT...42
4. RISULTATI E DISCUSSIONE...43 4.1. Controlli interni...43 4.2. Curve standard...44 4.3. Sensibilità...46 4.4. Specificità...46 4.5. Riproducibilità...46 4.5.1. Riproducibilità intra-laboratorio...46 4.5.2. Riproducibilità inter-laboratorio...49
4.6. Confronto dei risultati dei diversi kit ELISA...51
4.6.1. Correlazione (R2) tra indici...51
4.6.2. Concordanza tra gli esiti...53
4.7. Corrispondenza tra indici ELISA e titolo IFAT...56
5. CONCLUSIONI...58
6. BIBLIOGRAFIA...60
1. INTRODUZIONE
1.1. Generalità sulla malaria
La malaria è una delle maggior emergenze sanitarie nel mondo. Secondo l’Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS), nel 2015 oltre 3 miliardi di persone sono a rischio di contrarre la malaria, causata dal protozoo del genere Plasmodium, appartenente al Regno Protista, Phylum Apicomplexa, Classe Sporozoa, Ordine Eucoccidiida, Famiglia Plasmodiida. Il Plasmodio è trasmesso all’uomo attraverso la puntura di una zanzara infetta del genere Anopheles.
Cinque specie di Plasmodium infettano l’uomo e sono P. falciparum, P.
ovale, P. vivax, P. malariae e P. knowlesi.
Le specie patogene di Plasmodium presentano una diversa distribuzione geografica: P. falciparum è principalmente diffuso in Africa; P. vivax è più frequente in America Centrale, in America del sud e nel Sud est dell’Asia;
P. ovale è molto comune in Africa occidentale, raro o assente negli altri
continenti e P. malariae è distribuito più o meno come P. falciparum, ma con minore frequenza; P. knowlesi é distribuito nel Sud Est dell'Asia dove abitualmente infetta i primati e solo raramente l'uomo come recentemente descritto.(1,2)
Sebbene, le ultime stime dell’OMS ci indicano una riduzione dell’incidenza dei casi di malaria e del tasso di mortalità a livello globale, ci sono
numerosi Paesi che continuano ad essere iperendemici.(2)
Infatti, la malaria è prevalentemente diffusa nei Paesi africani, soprattutto nei Paesi dell’Africa Sub-Sahariana, dove i più colpiti sono i bambini di età inferiore ai cinque anni, tra cui si registra il più alto tasso di mortalità e le donne in gravidanza. (3)
I Paesi dell’Africa Sub-Sahariana sono anche i paesi economicamente più svantaggiati, dove l’accesso agli strumenti di controllo della malaria risulta più difficile. (4)
Grazie all’adozione di adeguate misure di controllo, come la diagnosi precoce, il trattamento efficace con farmaci combinati a base di
artemisinine e l’utilizzo di zanzariere impregnate di insetticida, l’incidenza mondiale dei casi di malaria, come detto prima, è diminuita del 41% nel periodo 2000-2015.(2)
Ciò nonostante, l’OMS raccomanda fortemente di fare degli sforzi ulteriori per attuare i programmi di lotta alla malaria e garantire l'accesso agli strumenti di controllo a tutta la popolazione, al fine dell’eradicazione della malaria dai Paesi endemici, che continuano a rappresentare un serbatoio di infezione da Plasmodium anche per quei Paesi non più endemici.
Sebbene, il Plasmodio, si trasmetta principalmente attraverso la puntura della zanzara anofelina, può essere introdotto nell’organismo, attraverso trasfusioni di sangue, trapianti d’organo, aghi contaminati e ci può essere una trasmissione transplacentare.
1.2. Ciclo vitale del parassita
Il ciclo infettivo nell’uomo, inizia quando una zanzara femmina infetta, appartenente al genere Anopheles, compie il suo pasto di sangue sulla cute integra, inoculando con la saliva il parassita allo stadio di sporozoita. Gli sporozoiti, attraverso il sistema circolatorio, raggiungono rapidamente il parenchima epatico ed invadono gli epatociti.
Negli epatociti, all’interno del vacuolo parassitoforo, il parassita va incontro ad un processo di maturazione che lo trasformerà in schizonte epatico contenente numerosi merozoiti.
Dopo maturazione, il vacuolo parassitoforo e lo schizonte si rompono, liberando i merozoiti che entrano nel circolo sanguigno e qui ha termine la fase esoeritrocitaria o epatica del ciclo. Tuttavia, alcuni forme
intraepatiche di P. ovale e P. vivax possono rimanere nel fegato per periodi molto lunghi, anche diversi anni, in stato dormiente o di ipnozoiti (il Plasmodium non si replica ma dorme, dal greco antico hypnos - dio del sonno), prima che il parassita entri nuovamente in circolo.
I merozoiti, una volta in circolo, infettano i globuli rossi, attraversandone la membrana cellulare e localizzandosi nel vacuolo parassitoforo e dando così inizio alla fase eritrocitaria.
Nel vacuolo iniziano i processi maturativi del plasmodio, che si trasformerà prima in trofozoite giovane, poi in trofozoite maturo ed infine in schizonte eritrocitario. Lo schizonte, per divisione asessuata schizogonica, darà vita a numerosi merozoiti, che verranno, poi, liberati nel circolo sanguigno. I merozoiti andranno ad infettare nuovi globuli rossi con un meccanismo a cascata con l’interessamento di un numero sempre crescente di globuli rossi. Mentre, alcuni merozoiti intraprenderanno una via differenziativa diversa, che li porterà a trasformarsi in gametociti maschili
(microgametociti) e femminili (macrogametociti).
Questo è il momento in cui l’uomo è in grado di trasmettere il parassita ad un’altra zanzara che compie il pasto di sangue sulla sua cute, ingerendo i gametociti.
Nell’apparato digerente dell’anofele vettrice, i gametociti si trasformono nelle forme sessuate mature (micro- e macro- gameti) per formare lo zigote. Successivamente, lo zigote assume la forma dell’oocinete mobile e vermiforme, che va ad invadere l’epitelio intestinale per raggiungere l’emocele, dove si differenzia in oocisti.
Infine, l’oocisti rilascia migliaia di sporozoiti, che raggiungono ed
invadono le ghiandole salivari, da cui saranno pronti per essere inoculati, attraverso la saliva, nell’ospite vertebrato, dando inizio a un nuovo ciclo infettivo. (fig.1)
Fonte:
Figura 1 - Ciclo vitale del Plasmodium spp.
1.3. Clinica della malaria
La malaria si manifesta con un quadro clinico abbastanza variabile, che può decorrere come:
un’infezione asintomatica una malaria non complicata una malaria grave.
L’esito della malattia può essere diverso e dipendere da alcuni fattori legati al parassita, all’ospite e alle condizioni socio-geografiche, riassunti in figura 2.
Figura2. Fattori implicati nel esito della malattia (Miller et al., 2002).(5)
La malaria non complicata si manifesta come una sindrome
simil-influenzale con febbre, accompagnata da brividi e sudorazione eccessiva, malessere generale, cefalea, disturbi gastrointestinali, nausea, vomito, artralgie.
I tipici picchi febbrili sono dovuti alla rottura sincrona dei globuli rossi, che rilasciano nel sangue non solo i merozoiti ma anche i cataboliti del
parassita, come l’emozoina, prodotta dalla degradazione dell’emoglobina. L’emozoina è rapidamente sequestrata dai monociti circolanti e dai
macrofagi tissutali, inducendo il rilascio dei mediatori pro-infiammatori (6), che sono responsabili dell’innalzamento febbrile.
La malaria grave è il decorso clinico più severo, potendo portare ad exitus del paziente.
Le sindromi più comuni in età pediatrica, causate dall’infezione da P.
falciparum sono: anemia grave, distress respiratorio (caratterizzato da
acidosi metabolica e/o edema polmonare) e malaria cerebrale (caratterizzata da prostrazione, convulsioni e coma).
Il P. falciparum può invade tutti gli stadi degli eritrociti ed infettare fino al 50% dei globuli rossi di un individuo. Inoltre, ne può determinare un accumulo nei capillari sanguigni.
Infatti, i globuli rossi parassitati acquisiscono capacità di aderire tra di loro ed alla superficie delle cellule endoteliali dei vasi sanguigni, grazie
all’aumento sulla loro superficie di molecole di adesione di origine parassitaria.
In questo modo, gli aggregati di eritrociti sfuggono alla clearance operata dalla milza, ma si accumulano nei capillari degli organi, dove determinano un grave danno di ipossia, portando alla necrosi i tessuti interessati.(7) In questo fenomeno, detto di sequestramento, si formano quindi degli aggregati di globuli rossi, noti come “clumping” tra eritrociti parassitati con il coinvolgimento delle piastrine (8) e “rosette” tra eritrociti non parassitati e parassitati, che ulteriormente aggravano la
sintomatologia.(9)
La malaria grave colpisce soprattutto i bambini di età compresa tra i 6 mesi e 5 anni di vita. I neonati fino a 6 mesi di vita sono i meno esposti, perchè se da un lato, il parassita incontra una certa resistenza a
metabolizzare l’emoglobina fetale, dall’altra può essere inibito nella sua virulenza dagli anticorpi materni.
Oltre ai bambini, anche le donne in gravidanza sono interessate dalla malaria grave, caratterizzata da anemia grave materna, aborto e ridotto peso alla nascita, fenomeni ascrivibili al sequestro dei parassiti a livello della placenta. (10)
1.4. La risposta anticorpale alla malaria
Gli individui che vivono nelle aree endemiche della malaria, dopo continue esposizioni al parassita, sviluppano una forma di immunità clinica alla malattia, nota come premunizione.(11, 12) La premunizione è l’effetto della risposta immunitaria dell’ospite verso il parassita, che non viene eliminato del tutto dall’organismo, ma vi persiste con bassa parassitemia. Grazie alla premunizione, questi individui sono protetti dalla forma più grave di malaria, finchè vivono in zone endemiche.
Alla base dell’immunità clinica, oltre ai meccanismi effettori dell’immunità cellulo-mediata, c’è la produzione di anticorpi anti-Plasmodium, che
possono avere un’azione di neutralizzazione e opsonizzazione, e agire in meccanismi di citotossicità anticorpo-dipendenti, come hanno dimostrato vari esperimenti condotti su modelli-animali. (13,14)
Gli anticorpi anti-Plasmodium sono degli importanti marcatori di
esposizione alla malaria (15). E’ stato visto, infatti, che i livelli anticorpali variano in funzione dell’età e del livello di trasmissione alla malaria: gli adulti mostrano livelli anticorpali più alti dei bambini con una diminuita prevalenza dei parassiti; nei soggetti esposti ad un maggior numero di punture infettanti, aumenta la sieroprevalenza degli anticorpi
anti-Plasmodium soprattutto quelli diretti contro gli antigeni dei merozoiti.(16)
Gli anticorpi anti-Plasmodium sono considerati un promettente strumento per stimare le variazioni dell’intensità di trasmissione della malaria,
soprattutto in quelle zone a bassa endemicità, dove i livelli di trasmissione sono tali da non essere rilevati con i metodi emoscopici, con i test rapidi e con gli strumenti entomologici. (15,17)
Diversi gruppi di ricerca sono impegnati a identificare i marcatori
sierologici più appropriati per stimare la trasmissione della malaria. (15) L'utilizzo di un particolare marcatore sierologico dipende dal grado di immunogenicità dell’antigene, dalla variabilità dei polimorfismi antigenici che può ridurre la sensibilità del saggio prescelto e dalle caratteristiche del saggio stesso, che deve assicurare il dosaggio di rilevanti titoli
anticorpali.(15)
Inoltre, non è ancora del tutto chiaro, quali antigeni di Plasmodium siano i bersagli più importanti degli anticorpi anti-Plasmodium, ai fini dello
sviluppo di immunità. (18)
L’identificazione di questi biomarcatori e dei loro bersagli antigenici avrebbe importanti implicazioni, non soltanto per la siero-sorveglianza nelle aree endemiche, ma anche per lo sviluppo di un vaccino efficace per l’eradicazione della malaria.
Nei paesi non più endemici, invece, marcatori sierologici anti-Plasmodium potrebbero essere un utile strumento, non solo per indagini
epidemiologiche all’esposizione del parassita, ma anche per lo screening di quei donatori di sangue che hanno soggiornato in paesi endemici, sebbene la presenza di anticorpi anti-Plasmodium non sia diagnostica di infezione in atto, nè, viceversa, l'assenza di anticorpi specifici possa escludere l'infezione (15).
Dei meccanismi, coinvolti nella memoria immunologica dell’infezione malarica, si conosce ben poco ed in particolare sulla durata dei livelli anticorpali e dell’attivazione delle cellule B specifiche.(19)
Gli individui esposti per la prima volta al parassita, iniziano a produrre gli anticorpi specifici dopo la prima ondata di parassitemia in un tempo che va da 1 a 3 settimane e possono rimanere in circolo per tre o sei mesi dopo la clearance dei parassiti.(20)
Mentre, negli individui semi-immuni, continuamente esposti alle punture infettanti delle zanzare, questi anticorpi possono persistere in circolo per diversi mesi o anni. Inoltre, è stato visto che diversi individui, che vivono in aree endemiche a bassi livelli di trasmissione, sono protetti da
reinfezioni, grazie ai loro livelli anticorpali mantenuti stabili nel tempo, anche diversi anni dopo l’infezione primaria.(19)
Quindi, il rischio di trasmissione del parassita, attraverso trasfusioni di sangue od emocomponenti, provenienti da donatori asintomatici infetti, è potenzialmente possibile, sebbene il Plasmodio si trasmetta naturalmente
attraverso la puntura della zanzara Anopheles. Infatti, casi di tale modalità di trasmissione del Plasmodio, sono stati descritti in diversi studi.(21) Nei paesi non endemici, la strategia per eliminare questo rischio di
trasmissione, si basa sull’individuazione di potenziali portatori asintomatici del parassita tra i candidati donatori, provenienti da paesi endemici per la malaria o che vi hanno soggiornato.
Il Ministero della salute italiano, nell’intento di attuare questa strategia, nel 2015 ha emanato il Decreto sulle “Disposizioni relative ai requisiti di qualità e sicurezza del sangue e degli emocomponenti”, che in accordo a quanto raccomandato dall’Organizzazione Mondiale di Sanità e
dall’European Directorate for the Quality of Medicines and Healthcare (EDQM), prevede di sottoporre il candidato donatore ad un test
immunologico per la ricerca di anticorpi anti-Plasmodium. (22, 23) Questa strategia per lo screening dei donatori, in attesa di aver a disposizione marcatori sierologici affidabili e validati, allo stato attuale, presenta delle importanti incertezze, per i motivi descritti.
Infatti, potrebbero presentarsi allo screening quei candidati donatori che pur portatori del parassita, non presentano ancora livelli anticorpali nel sangue ed essere comunque accettati alla donazione, con il rischio di trasmettere il Plasmodio al ricevente. Viceversa, potrebbero presentarsi anche quei soggetti, che pur avendo livelli anticorpali anti-Plasmodium nel sangue, non sono portatori del parassita e dunque essere esclusi dalla donazione con perdita innecessaria di donatori di sangue.
1.5. Diagnosi della malaria
L’Organizzazione Mondiale della Sanità raccomanda una diagnosi
tempestiva per iniziare immediatamente il trattamento anti-malarico al fine di prevenire lo sviluppo di malaria complicata ed impedire la morte del paziente. Naturalmente, al fine, anche di ridurre il rischio di trasmissione. Allo scopo, è fortemente raccomandato di confermare il sospetto clinico di malaria con il test emoscopico o un test diagnostico rapido (TDR).(2)
Il gold standard della diagnosi diretta di malaria è l’esame emoscopico, che viene effettuato ricercando il parassita nello striscio sottile e goccia spessa di sangue periferico, direttamente al microscopio ottico, previa colorazione dei preparati ematici.
L’osservazione microscopica dello striscio sottile di sangue permette anche l’identificazione delle diverse specie di Plasmodium nei loro differenti stadi maturativi e la valutazione della parassitemia, espressa come numero di parassiti/µl di sangue (sulla goccia spessa) o come percentuale di emazie parassitate (sullo striscio sottile), utile per il monitoraggio della terapia. La ricerca microscopica del parassita è una metodica legata molto
all’esperienza e al grado di preparazione del microscopista ed ha, inoltre, una sensibilità ridotta per valori inferiori a 50 parassiti/μl (metodica della goccia spessa).(24,25,26,27)
Con i test rapidi (TDR) di diagnosi diretta della malaria si ricercano nel sangue gli antigeni circolanti del plasmodio, attraverso il principio
dell’immunocromatografia. In commercio esistono numerosi test TDR, il cui utilizzo si è diffuso soprattutto nelle aree endemiche, dove risulta più difficile la pratica della diagnosi emoscopica.(28)
In particolare, il kit è costituito da una cassetta contenente una
membrana di nitrocellulosa su cui sono immobilizzati gli anticorpi
anti-Plasmodium a cui si legano gli antigeni specifici se presenti nel sangue del
paziente.
Alcuni TDR sono specie-specifici, cioè permettono di ricercare antigeni specifici prodotti da P. falciparum e da P. vivax, altri sono pan-specifici e rilevano antigeni prodotti da tutte le specie (P. falciparum, P. vivax, P.
ovale, P. malariae).
Questi metodi hanno il vantaggio di essere relativamente semplici e rapidi nell’esecuzione ed interpretazione, perchè non richiedono strumentazioni, nè richiedono la catena del freddo e soprattutto sono poco costosi.
Ciò nonostante, una problematica emersa da differenti studi clinici, condotti in vari Paesi, è un’ampia variabilità nella sensibilità dei TDR.
Infatti, la sensibilità risulta particolarmente variabile in relazione alla parassitemia, e si riduce al di sotto dei 200 parassiti/µl e, in particolare, quando il livello si attesta su valori inferiori o uguali a 100 parassiti/μl. Inoltre, i TDR non permettono di effettuare una diagnosi certa di specie. (24,25,26)
I test di diagnosi diretta per la malaria a maggior sensibilità, sono i test molecolari, basati sull’amplificazione di regioni specifiche dell’acido
nucleico del parassita, attraverso la reazione di polimerizzazione a catena (Polymerase Chain Reaction, PCR). Questi testi sono maggiormente
utilizzati nei centri di ricerca e nei laboratori di riferimento.
Recentemente, in diagnostica è stata implementata una nuova tecnica di PCR, chiamata LAMP ( Loop-mediated isothermal amplification), una tecnica di amplificazione isotermica del DNA loop-mediata.(29)
In particolare, il target del test è una regione del genoma di Plasmodium comune a P. falciparum, P. vivax, P. ovale, P. malariae e P. knowlesi. Una caratteristica importante di questa tecnica è che non richiede la denaturazione del DNA target (30) e la reazione di amplificazione è
condotta in condizioni isotermiche (60-65 °C). Inoltre, i numerosi prodotti di reazione sono visibili tramite torbidità o fluorescenza, ottenendo i
risultati senza richiedere sofisticate e costose strumentazioni e personale altamente specializzato.
Per queste caratteristiche, il test LAMP si presterebbe ad essere utilizzato anche in condizioni disagiate delle aree endemiche, dove l’applicazione migliore sarebbe quella di individuare soggetti asintomatici con
parassitemie molto basse per ridurre o eliminare la trasmissione dell’infezione. Tra l’altro, l’eliminazione della malaria, secondo le
raccomandazioni dell’OMS, è un obiettivo da raggiungere in un futuro non troppo lontano e tra gli strumenti utili allo scopo sono indicati anche i test molecolari.(31)
I test sierologici indiretti, per la ricerca di anticorpi anti-Plasmodium, non sono applicabili per una diagnosi della malaria, soprattutto in fase acuta
della malattia, perchè un risultato positivo, in soggetti non immuni, si ha solo dopo diversi giorni dalla presenza del parassita nel sangue, mentre in soggetti immuni, può verificarsi anche in assenza di infezione (vedi
paragrafo 1.4). Infatti, i test sierologici possono identificare individui positivi agli anticorpi anti-Plasmodium, ma non indicare necessariamente parassitemia, perché i titoli anticorpali possono rimanere elevati per molti anni dopo l'infezione da P. falciparum e P. vivax (19).
Invece, i test sierologici indiretti sono utilizzati soprattutto per lo screening dei donatori di sangue, che hanno soggiornato in un’area endemica, per indagini epidemiologiche all’esposizione del parassita, oppure per i casi sospetti con negatività ai test emoscopici.
I metodi indiretti più utilizzati sono:
- Immunofluorescanza Indiretta (IFI) o Indirect Fluorescent Antibody Test
(IFAT);
- Saggio Immunoenzimatico o Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA).
Nel test IFAT, il siero del paziente è testato con emazie parassitate da P. falciparum. Gli anticorpi anti-Plasmodium, se presenti nel siero, si legano agli antigeni del Plasmodio e la rilevazione del immunocomplesso è messo in evidenza dall’aggiunta di un coniugato anti IgG umane legato ad
isotiocianato di fluoresceina. All’osservazione al microscopio a
fluorescenza, le emazie parassitate appaiono di color verde mela sul fondo nero-marrone.
Con l’IFAT si pùò anche determinare il titolo anticorpale, diluendo serialmente il siero, dando indicazioni sull’assenza di infezione o sulla probabile esposizione passata all’infezione malarica da P. falciparum. Anche il test ELISA è un immunodosaggio, che prevede l’impiego di pozzetti sul cui fondo sono adesi gli antigeni di Plasmodium spp. Se nel siero del paziente sono presenti gli anticorpi specifici, questi si legheranno agli antigeni di Plasmodium spp.
L’immunocomplesso antigene-anticorpo sarà messo in evidenza dal sistema rilevatore, che è un coniugato anti-immunoglobuline umane legato ad un enzima (perossidasi di rafano o fosfatasi alcalina). Allo spettrofotometro, il siero testato apparirà di una colorazione più o meno intensa, dovuta all’aggiunta di un substrato cromogeno, che viene
attaccato dall’enzima quando questo è legato all’immunocomplesso.
L’intensità di questa colorazione è direttamente proporzionale alla quantità di anticorpi specifici per Plasmodium spp. presenti nel campione.
1.6. Epidemiologia
Secondo i dati dell’Organizzazione Mondiale di Sanità (OMS), pubblicati nel World Malaria Report 2016 (2), la malaria è endemica in 91 Paesi
dall’inizio del 2016, rispetto ai 108 paesi del 2000. (Fig.3)
Secondo le ultime stime, tra il 2000 e il 2015, l'incidenza dei casi di malaria si è ridotta del 41% e dei tassi di mortalità del 62%.
Nonostante queste significative riduzioni, i casi stimati nel mondo nel 2015 sono stati 212 milioni con un margine di incertezza di 148–304 milioni e con un’incidenza del 21% stimata tra il 2010 e 2015. La maggior parte dei casi sono stati registrati nella Regione africana (90%), seguita dal Sud-Est asiatico (7%) e dalla Regione del Mediterraneo orientale (2%).
Nella Regione europea, nel 2015 non sono stati registrati casi di malaria autoctoni: l’ultimo caso è stato registrato in Tajikistan a luglio 2014. Dunque, nel mese di aprile 2016, l’Ufficio Regionale Europeo dell’OMS ha ufficialmente dichiarato la Regione Europea libera dalla malaria.
Inoltre, i dati dell’OMS, non sono incoraggianti per quanto riguarda il numero di decessi, che nel 2015, globalmente, sono stati 429 mila con un margine di incertezza di 235-639 mila ed un tasso di mortalità del 29% stimato tra il 2010 e 2015.
Il maggior contributo è dato dal 70% dei decessi dei bambini di età inferiore ai 5 anni, di cui 292 mila nella Regione Africana.
Il maggior numero di decessi è stato stimato nella Regione africana
(92%), seguita dal Sud-Est asiatico (6%) e dalla Regione del Mediterraneo (2%). Il maggior responsabile di questi decessi (99%) è il P. falciparum, seguito da P. vivax , che causa più morti (86%) nei paesi fuori dal
continente africano.
Il numero di decessi dei bambini di età inferiore ai 5 anni, è in calo rispetto al numero registrato negli anni precedenti. Tuttavia, la malaria continua ad essere una delle principali cause di mortalità infantile a livello mondiale.
Figura 3 – Distribuzione geografica della malaria (World Malaria Report, WHO 2016)
1.7. La malaria in Italia
1.7.1. Cenni storici
Alla fine della seconda guerra mondiale, la malaria era diffusa in gran parte dell’Europa e in particolare in Italia era presente al Centro-sud e nelle isole maggiori, lungo le fasce costiere delle regioni nord-orientali, con propaggini di ipoendemia nella Pianura Padana. (32)
La malaria era causata soprattutto da P.vivax e P. malariae, il P.
falciparum era, invece, presente sul territorio in estate e in autunno.
I vettori erano principalmente: Anopheles labranchiae, soprattutto nelle Isole e nell’Italia centrale e meridionale; A. sacharovi diffusa al Nord, in Sardegna, Puglia e Basilicata; A. superpictus limitata soprattutto al Sud d’Italia. (33)
La Sardegna e la Sicilia erano le regioni più colpite, dove si registrava il 70% dei casi nazionali. Le zone a media endemicità comprendevano: la Puglia, la Basilicata, la Calabria, la Campania ed il Lazio, con il 20% delle denunce. Le regioni ipoendemiche erano: il Veneto, il litorale della
Toscana, l’Abruzzo, la valle e il delta del Po (Piemonte, Lombardia, Emilia Romagna), con il 10% dei casi nazionali. (32,33)
La malaria da P. falciparum venne eradicata subito dopo l’avvio del piano nazionale quinquennale (1947-1951) di lotta alla malaria, mentre casi sporadici di malaria da P. vivax continuarono fino al 1962. Nel 1970, l’Organizzazione Mondiale della Sanità dichiarò l’Italia ufficialmente libera dalla malaria. (34)
Da allora, in Italia si registrano solo casi importati, come negli altri paesi europei.
1.7.2. Storia recente
Oggi, la malaria continua ad essere la malattia tropicale più importata nei paesi non endemici. Questo è dovuto, da una parte all’aumento dei
viaggiatori internazionali che si recano nei Paesi tropicali e sub-tropicali e dall’altra, ai continui flussi migratori, provenienti da zone endemiche. La
principale preoccupazione sanitaria che ne consegue è il rischio della reintroduzione della malaria nei paesi non più endemici. Infatti, i casi importati possono rappresentare un reale serbatoio di infezione per le zanzare locali, in cui il plasmodio può completare il suo ciclo biologico. Presumibilmente è ciò che è accaduto in Italia, dove nel 1997, in una zona rurale del grossetano, si è verificato un caso di malaria autoctona da P.
vivax, probabilmente trasmesso da popolazioni locali di Anopheles
labranchiae (35), ancora oggi presenti in molte regioni dell’Italia centrale
e meridionale e nelle isole maggiori.
Inoltre, più recentemente in Grecia ci sono stati dei piccoli focolai di malaria, che hanno determinato, nel 2015, un alert, associato alla
donazione di sangue ed emocomponenti per i donatori che si erano recati in quel paese. (36,37)
I dati più recenti indicano che la malaria d’importazione nel nostro paese è aumentata, soprattutto a carico di stranieri residenti in Italia da molto tempo e che ritornando nel loro paese di origine anche per lunghi periodi, risultano essere potenzialmente i più esposti all’infezione da Plasmodium
spp. Infatti, secondo gli ultimi dati epidemiologici a disposizione del
Ministero della Salute (38), relativi al periodo 2011-2015, questi casi definiti in letteratura come Visiting Relatives and Friends (VRFs), risultano essere l’81% su un totale di 3.633 casi di malaria notificati, di cui l’89% con diagnosi confermata. Mentre, tra i cittadini italiani, che si sono recati in zone endemiche, si sono riscontrati il 20% dei casi contro l’80% dei casi totali degli stranieri entrati in Italia da zone endemiche. (38)
I dati relativi al periodo 2011-2015 riguardano anche la distribuzione percentuale dei casi notificati in ciascuna regione italiana, mostrata in figura 4. Il risultato ci indica che un maggior numero di casi sono stati notificati dalle regioni del centro-nord, ma con una probabile sottostima di notifiche da parte di alcune regioni, soprattutto del centro-sud, che hanno fatto la richiesta di conferma di diagnosi di malaria all’Istituto Superiore di
Sanità, ma che poi non hanno mai inviato la relativa scheda di notifica.(38)
La specie di Plasmodio predominante è risultata P. falciparum, con l’82% dei casi segnalati, seguita da P.vivax (12%), P.ovale (4%), P. malariae (2%); rare le infezioni miste (0,4%). Il 92% dei casi sono originati dal continente africano (soprattutto da paesi dell’Africa occidentale), il 7% da quello asiatico, lo 0,6% da paesi dell’America centro meridionale e lo 0,1% dall’Oceania (Papua-Nuova Guinea); in questi ultimi tre continenti predomina il P.vivax. I decessi sono stati in totale 4, dovuti ad infezioni da
P. falciparum acquisite in Africa. (38)
Questi dati ci segnalano, inoltre, 7 casi di malaria autoctona, di cui 2 indotti (P. falciparum e P. malariae), tre criptici (1 di P. falciparum e 2 di
P. malariae), uno sospetto da bagaglio (P. falciparum), uno sospetto
introdotto (P. vivax), cioè trasmesso da vettori indigeni. (38)
Le indicazioni dell'OMS definiscono, ai fini epidemiologici, la classificazione dei casi suindicati di malaria autoctona contratta con certezza nei paesi non endemici e di seguito elencata:
Caso indotto: malaria accidentalmente acquisita attraverso mezzi artificiali (trasfusioni, trapianti, contaminazioni nosocomiali); Caso introdotto: malaria verificatosi sul territorio nazionale con
sospetta trasmissione da parte di zanzare indigene verosimilmente infettatesi su un caso d’importazione;
Caso criptico: caso isolato di malaria per il quale le indagini
epidemiologiche non siano riuscite ad identificare con certezza la fonte d’infezione o a ipotizzarne ragionevolmente una (malaria da bagaglio, malaria d’aeroporto).
Alla luce di tutto ciò, risulta molto importante aver definito dei protocolli di prevenzione e controllo della malaria in Italia da parte del Ministero della Salute. In quest’ottica, si collocano anche le misure di prevenzione per la sicurezza trasfusionale, che indicate nel decreto del 2 novembre 2015,
prevedono i criteri di esclusione temporanea dalla donazione di sangue ed emocomponenti relativamente alla malaria.
Fonte:
Figura 4 - Distribuzione percentuale per Regione dei casi notificati di malaria in Italia, 2011-2015. Le gradazioni di colore (chiaro/scuro) sono relative al valore di percentuale delle
1.7.3. Decreto del 2 novembre 2015
Il rischio di trasmissione della malaria, attraverso la trasfusione di sangue ed emocomponenti provenienti da donatori portatori asintomatici del Plasmodio, è potenzialmente possibile, sebbene, in alcuni paesi non endemici, tra cui l’Italia, sia molto basso. (39,40)
Globalmente, nei paesi non endemici, sono stati 100 i casi di malaria trasmessa attraverso la trasfusione di sangue, documentati dal 1911 fino al 2015. (21)
Per cui, diversi Paesi hanno adottato misure di prevenzione per la sicurezza trasfusionale, emanando linee guide per lo screening di quei candidati alla donazione di sangue od emocomponenti, che attestino di provenire da Paesi endemici per malaria o di avervi soggiornato.
Attualmente, la Regolamentazione Europea, attraverso l’European Directorate for the Quality of Medicines and Healthcare (EDQM),
raccomanda lo screening dei candidati donatori di sangue per anticorpi anti-Plasmodium.(23)
In Italia, il decreto del 2 novembre 2015 del Ministero della Salute, indica le disposizioni relative ai requisiti di qualità e sicurezza del sangue e degli emocomponenti ed elenca i criteri di esclusione temporanea dalla
donazione di sangue ed emocomponenti per la prevenzione della trasmissione dell’infezione malarica.
Allo scopo, il succitato decreto prevede che venga somministrato un questionario anamnestico con domande specifiche, quali ad esempio: “E’ nato, vissuto, vive o ha viaggiato all’estero? Se sì, in quale Paese; “Ha avuto malaria o febbre inspiegata durante un viaggio in zone a rischio o entro 6 mesi dal rientro?”. Al candidato donatore si richiede di rispondere al questionario in maniera veritiera e consapevole. Sulla base delle
risposte, poi il medico responsabile della selazione del donatore esprime il giudizio di idoneità, tenendo conto di una valutazione complessiva, sia anamnestica che clinica.
Nel caso si evidenzia il dubbio che il candidato donatore possa essere un potenziale portatore asintomatico del parassita, si prevede la necessità di sottoporlo allo screening della malaria con un test immunologico per la ricerca di anticorpi anti-Plasmodium.
Secondo il Ministero della Salute (38), non è ritenuto accettabile il test rapido, con conferma microscopica, in accordo alle raccomandazioni dell'OMS e dall’European Directorate for the Quality of Medicines and Healthcare (EDQM).
1.8. Screening dei donatori di sangue nell’Azienda Ospedaliero-Universitaria di Pisa
Dal mese di febbraio 2016 il Laboratorio di Parassitologia della Sezione Dipartimentale di Microbiologia Universitaria dell’Azienda Ospedaliero Universitaria Pisana è il centro di riferimento per lo screening dei donatori di sangue dell’area Nord-Ovest della Regione Toscana per la ricerca di anticorpi anti-Plasmodium.
Il test di screening utilizzato, in accordo al decreto del 2 novembre 2015, è un test immunologico, basato sulla tecnica immunoenzimatica ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay), descritta in dettaglio nel capitolo 3.
2. SCOPO ED OBIETTIVI DELLA TESI
Nel lavoro svolto, sono stati analizzati dei sieri di donatori di sangue e dei sieri di pazienti infetti da P. falciparum, già testati con la metodica
dell’immunofluorescenza indiretta (IFAT), con diversi kit ELISA
commerciali per la ricerca di anticorpi anti-Plasmodium. Questo lavoro è stato svolto in collaborazione con il Laboratorio del Centro delle Malattie Tropicali dell'Ospedale “Sacro Cuore Don Calabria” di Negrar, provincia di Verona (CMT di Negrar).
In assenza di un test sierologico "gold standard" per la ricerca di anticorpi anti-Plasmodium, lo scopo generale è stato quello di confrontare il
risultato tra i diversi kit ELISA tra di loro e con quello della metodica IFAT in pazienti infetti e donatori di sangue di origine italiana o straniera. Gli obiettivi specifici sono stati, quindi:
1. valutare la sensibilità dei kit ELISA tramite test di sieri da pazienti infetti da Plasmodium spp.;
2. valutare la specificità dei kit ELISA tramite test di sieri da pazienti infetti con parassiti diversi da Plasmodium spp.;
3. confrontare il risultato ottenuto con i diversi kit ELISA commerciali in sieri dei donatori di sangue afferenti ai Centri Trasfusionali della Regione Toscana Nord Ovest;
4. valutare la riproducibilità dei risultati intra-laboratorio (AOUP) ed inter-laboratorio (AOUP e CTM di Negrar);
5. individuare il kit ELISA commerciale con migliore corrispondenza con il titolo IFAT e ottenere un grafico di corrispondenza tra titolo IFAT ed indice ELISA per il kit ELISA con la migliore corrispondenza.
3. MATERIALI E METODI
3.1 Campioni analizzati
3.1.1 Campioni dei donatori di sangue
I campioni da testare sono stati selezionati da un database di 496 donatori (vedi tab.1), provenienti dai Centri Trasfusionali dell’Azienda Ospedaliero-Universitaria di Pisa (AOUP) e dell’Azienda Usl Toscana Nord Ovest delle province di Pisa, Lucca, Livorno e Massa Carrara, nel periodo compreso tra il 15/02/2016 e 21/02/2017, già testati con metodica DRG® Malaria ELISA
presso il Laboratorio di Parassitologia della Sezione Dipartimentale di Microbiologia Universitaria dell’Azienda Ospedaliero-Universitaria Pisana.
Tabella 1- Donatori di sangue per Centro trasfusionale
Centro Trasfusionale N° Donatori AOUP 42 Pisa 41 Lucca 136 Versilia 63 Massa e Carrara 93 Livorno 121
Grafico 1 – Donatori di sangue per Paese di provenienza
Avendo a disposizione una piastra di 88 pozzetti per ogni kit ELISA, dopo aver incluso i controlli dei kit, altri sieri di controllo e la curva di
calibrazione (vedi schema della piastra in fig.5), rimanevano disponibili, per i campioni dei donatori, 43 pozzetti. Sono stati quindi selezionati n° 8 campioni negativi, n° 27 campioni positivi e n° 8 campioni dubbi per un totale di 43 campioni. (vedi tab.2)
Tabella 2 – Donatori da testare
Provenienza dei donatori Esito DRG®
Malaria ELISA
Italia Straniera Totali
Positivo 8 19 27
Negativo 3 5 8
Dubbio 2 6 8
3.1.2 Campioni a titolo noto IFAT
Sono stati, inoltre, considerati 64 sieri di pazienti infetti, provenienti dal Centro Malattie Tropicali di Negrar, dove sono stati analizzati con la tecnica dell’Immunofluorescenza Indiretta (IFAT) per anticorpi anti-P. falciparum.
All'interno di questo campione, 46 individui avevano una diagnosi emoscopica di infezione da Plasmodium spp.
Per questo test, sono disponibili in commercio (kit Falciparum-spot IF® della BioMérieux) dei vetrini con emazie parassitate da P. falciparum con cui è stato testato il siero del paziente.
All’osservazione al microscopio a fluorescenza, i protozoi presenti sul vetrino appaiono di color verde mela sul fondo nero-marrone se nel siero del paziente sono presenti gli anticorpi specifici.
Un numero di 10 sieri a titolo noto IFAT, elencati in tabella 2, sono stati testati in duplicato con ciascun kit ELISA, nei due laboratori (AOUP e CMT di Negrar).
Tabella 3 – Sieri a titolo noto
N° Titolo IFAT ID Campione 1 10240 3589 2 5120 3028 3 2560 1795 4 1280 3414 5 640 16 6 320 4307 7 160 2106 8 80 3451 9 20 2375 10 0 1090
3.1.3 Curva Standard
Tre campioni di siero con titolo IFAT 1:10240 sono stati utilizzati per formare un pool, che è stato definito standard 1.
Dallo standard 1 sono stati ottenuti gli altri 9 standard, tramite delle diluizioni seriali con fattore di diluizione 3.
Allo scopo è stata allestita una serie di 9 provette con 360 µl di diluente ed 1 provetta con 540 µl di siero del pool.
Partendo dal volume iniziale di 540 µl del pool, si sono pipettati 180 µl di siero nella prima provetta della serie e da qui, successivamente trasferiti altri 180 µl di siero in maniera seriale tra un campione ed il successivo. Ottenendo, così, i 10 standard di riferimento, indicati con ST1, ST2, fino a ST10. Il titolo anticorpale atteso in unità arbritarie/ml (U Ab/ml) di ogni standard è indicato in tabella 4.
Tabella 4 – Standard di riferimento
ST U Ab/ml ST1 1000 ST2 333 ST3 111 ST4 37 ST5 12 ST6 4 ST7 1 ST8 0 ST9 0 ST10 0
I 10 standard sono stati saggiati in duplicato su ogni micropiastra ed utilizzati per costruire la curva standard di riferimento.
3.2 Metodiche ELISA
3.2.1 I kit ELISA
I quattro kit ELISA commerciali utilizzati nello studio, sono forniti da diversi produttori e sono tutti basati sulla stessa tecnica
immunoenzimatica ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay), che prevede la determinazione qualitativa degli anticorpi per Plasmodium spp. I Kit ELISA usati sono quelli di seguito elencati:
NovaLisa TM della Novatech
DRG® Malaria ELISA della DRG International, già in uso
Malaria Ab della DIA.PRO Diagnostic Bioprobes Srl Euroimmun
Tabella 5 – Principali differenze tra i kit ELISA
Kit ELISA Diluizione del campione 1:
Calibratore Negativo Positivo Dubbio Antigene Ig
DRG® Malaria
ELISA 11 Doppio <9 >11 9-11 ricombinanti di Proteine P. vivax e P.
falciparum
IgG IgM
NovaLisa 11 Doppio <9 >11 9-11 Proteine ricombinanti di
P. vivax e P. falciparum
IgG IgM
Euroimmun 11 Singolo <8 >11 8-11 Proteine ricombinanti di P. vivax, P. falciparum, P.malariae, P.ovale, P. knowlesi IgG
DIA.PRO 1,3 Doppio <9 >11 9-11 Proteine
ricombinanti di Plasmodium spp.* IgG IgM IgA * epitopi immunodominanti
3.2.2 Esecuzione del test ELISA
La procedura analitica è comune a tutti i kit ELISA, tranne per qualche passaggio.
Per i kit ELISA DRG® Malaria ELISA, NovaLisa TM ed Euroimmun, i sieri
sono stati prediluiti in provette, mentre per il kit ELISA Malaria Ab della DIA.PRO, sono stati diluiti direttamente nei pozzetti della micropiastra, secondo le istruzioni dei kit ELISA, come illustrate nella tabella 6.
Tabella 6 - Diluizioni dei sieri Kit Volume Siero (µl) Volume Diluente (µl) Volume Totale (µl) Diluizione Campione 1: DRG® Malaria ELISA 10 100 110 11 NovaLisa 10 100 110 11 Euroimmun 10 100 110 11 DIA.PRO 150 50 200 1,3
Nei pozzetti, a cui sono adesi gli antigeni di Plasmodium spp., sono stati dispensati i controlli interni dei kit (Ctrl), gli standard (ST), i sieri a titolo noto IFAT (IF) e i sieri dei donatori (DN). Per ogni kit ELISA è stata allestita una micropiastra con 11 strip da 8 pozzetti ciascuna, tranne per un kit, per il quale sono state usate 10 strip, per mancanza di pozzetti. Ciascuna micropiatra è stata incubata a 37 °C per 60 minuti.
(Lo schema generale delle micropiastre dei kit ELISA è illustrato in figura 5).
Trascorso il periodo di incubazione, sono stati eseguiti 3 lavaggi, allo scopo di allontanare gli anticorpi non legati ai pozzetti.
Si è proceduto, quindi, all’aggiunta del coniugato.
Solo per il kit ELISA Malaria Ab della DIA.PRO è stato aggiunto un secondo coniugato in un ulteriore passaggio.
Ciascuna micropiastra è stata incubata per 30 minuti a temperatura ambiente, allo scopo di permettere la formazione dell’immunocomplesso. Terminato il periodo di incubazione, si sono effettuati nuovamente 3
lavaggi con lo stesso tampone utilizzato in precedenza, al termine dei quali è stato aggiunto a ciascun pozzetto il substrato cromogeno TMB.
La piastra è stata, quindi, lasciata a temperatura ambiente per 15 minuti (30 minuti solo per il kit DIA.PRO), allo scopo di far avvenire la reazione colorimetrica.
La reazione enzimatica è stata arrestata per aggiunta della soluzione di stop. Ed infine, l’assorbanza di tutti i pozzetti è stata misurata a 450 nm, come lunghezza d'onda (λ) di misura e a 620 nm come λ di riferimento, utilizzando il lettore per micropiastre SirioS® SEAC della ditta Radim.
Figura 5 – Schema delle Piastre ELISA
3.2.3 Reagenti
Sostanzialmente, i kit ELISA sono molto simili e sono costituiti da vari reagenti di seguito descritti:
1. Fase solida:
Micropiastra da 12 strips da 8 pozzetti coattati con antigeni di
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A Ctrl1 ST1 ST1 ST9 ST9 IF7 DN4 DN12 DN20 DN28 DN36
B Ctrl2 ST2 ST2 ST10 ST10 IF7 DN5 DN13 DN21 DN29 DN37
C Ctrl3 ST3 ST3 IF1 IF1 IF8 DN6 DN14 DN22 DN30 DN38
D Ctrl4 ST4 ST4 IF2 IF2 IF8 DN7 DN15 DN23 DN31 DN39
E Ctrl5 ST5 ST5 IF3 IF3 IF9 DN8 DN16 DN24 DN32 DN40
F DN1 ST6 ST6 IF4 IF4 IF9 DN9 DN17 DN25 DN33 DN41
G DN2 ST7 ST7 IF5 IF5 IF10 DN10 DN18 DN26 DN34 DN42
Plasmodio ricombinanti. 2. Diluente del campione:
Flacone contenente tampone Tris con aggiunta di 0.05% Kathon GC e Tween 20 per i kit Malaria Ab della DIA.PRO.
Flacone contenente tampone fosfato, stabilizzanti,conservanti e un colorante giallo inerte per i kit NovaLisa TM e DRG® Malaria ELISA.
3. Coniugato:
Flacone contenente anticorpi anti-IgG ed anti-IgM umani coniugati con l'enzima perossidasi di rafano (HRP).
Il kit Malaria Ab della DIA.PRO ha due coniugati, uno contenente antigeni ricombinanti liofilizzati biotinilati anti specie Plasmodium e l'altro contenente HRP coniugata con streptavidina dissolta in tampone salino Tris con aggiunta di 0.05% Kathon GC, Tween 20 e BSA.
4. Controllo positivo:
Contiene siero umano positivo per anticorpi anti specie Plasmodium. 5. Controllo negativo:
Contiene siero umano negativo per anticorpi anti specie Plasmodium. 6. Controllo Cut-off o Calibratore:
Contiene siero umano positivo per anticorpi anti specie Plasmodium 7. Soluzione di lavaggio:
Flacone contenente un tampone concentrato 20x o 10x. Il contenuto viene diluito con acqua deionizzata o distillata.
8. Substrato:
Flacone contenente il reagente 3,3`,5,5`-Tetrametilbenzidina (TMB) e perossido di idrogeno.
9. Soluzione di arresto:
3.3 Analisi dei dati
Per la validità dei test e l’interpretazione degli esiti sono state eseguite le istruzioni riportate sui fogli illustrativi di ogni kit ELISA.
3.3.1. Controlli interni
Per la validazione del saggio, è stato verificato che i valori di assorbanza (OD) dei controlli di ogni kit ELISA rientrassero nei parametri attesi, di seguito riportati nella tabella 7.
Tabella 7 – Valori di OD attesi dei Controlli Kit Substrato Bianco Controllo Negativo Controllo Cut-off Controllo Positivo Controllo Calibratore DRG® Malaria ELISA <0.100 <0.200 e <Cut-off 0.150-1.30 > Cut-off NovaLisa <0.100 <0.200 e <Cut-off 0.150-1.30 > Cut-off Euroimmun 0 – 0.7 Ratio 1.5 – 4.1 Ratio >0.140 DIA.PRO ≤ 0.100 ≤ 0.200 ≥ 0.500 S/Cut-off > 1 Legenda: S= OD siero
Cut-off= OD Controllo Negativo+0.300 Ratio = OD Controllo Neg o Pos/Cut-of
3.3.2. Calcolo degli indici di assorbanza ed interpretazione degli esiti
Per l’interpretazione degli esiti, è stato calcolato il Cut-off:
- come media dei valori di assorbanza del controllo Cut-off, per i kit ELISA NovaLisa e DRG® Malaria ELISA;
- come somma della media dei valori del controllo negativo e del valore 0.300 per il kit ELISA DIA.PRO;
- come valore di assorbanza del calibratore testato in singolo, per il kit ELISA Euroimmun.
Dall’assorbanza del Cut-off, si sono calcolati gli indici di assorbanza dei campioni analizzati (controlli e sieri), secondo la formula:
off
Cut
campione
assorbanza
Indice
10
Tenendo conto che:
- i campioni sono positivi se l’assorbanza supera il Cut-off almeno del 10 %;
- i campioni sono dubbi con assorbanza del 10% al di sopra o al di sotto del Cut-off;
- i campioni sono negativi, se l’assorbanza risulta inferiore del Cut-off almeno del 10 %,
i criteri interpretativi, elencati in tabella 8, sono i seguenti:
campioni con indice <9 sono considerati negativi per anticorpi anti-
Plasmodium;
campioni con indice >9 sono considerati positivi per anticorpi
anti-Plasmodium;
Tabella 8 – Criteri interpretativi
Kit ELISA Negativo Positivo Dubbio
DRG® Malaria ELISA <9 >11 9-11 NovaLisa <9 >11 9-11 Euroimmun <8 >11 8-11 DIA.PRO <9 >11 9-11 3.3.3. Curve standard
Sulla base dei valori di assorbanza dei 10 standard, sono state costruite le curve standard per ciascun kit ELISA. Ogni punto è stato calcolato come media dei valori di assorbanza dello standard in duplicato.
Per una tipica curva standard, è stata verificata la correlazione tra i valori di assorbanza (OD) e le unità di anticorpi attese/ml di ogni standard.
3.3.4. Sensibilità
La sensibilità diagnostica è la probabilità del test di fornire un risultato positivo in presenza di anticorpi anti-Plasmodium.
Per calcolare la sensibilità nei diversi kit ELISA, sono stati analizzati in ELISA, i sieri dei seguenti gruppi di controlli positivi per Plasmodium spp. (vedi tab.9):
1. Gruppo positivi in emoscopia (N=46) 2. Gruppo positivi IFAT (N=56)
La analisi sono state effettuate presso il laboratorio del CMT di Negrar, e dopo aver ottenuto i risultati, si è proceduti a calcolare la sensibilità di
ogni kit ELISA, come rapporto, espresso in percentuale, tra il numero dei controlli positivi risultati positivi in ELISA ed il numero totale dei controlli positivi considerati per ogni gruppo.
3.3.5. Specificità
La specificità diagnostica è la probabilità del test di fornire un risultato negativo in assenza di anticorpi anti-Plasmodium.
Per valutare la specificità di ogni kit ELISA, sono stati considerati due gruppi di controlli negativi (vedi tab.9):
1. Gruppo donatori sani (N=8)
2. Gruppo pazienti infetti da altri parassiti (N=15)
Allo scopo, sono stati testati 8 sieri di donatori non infetti e 15 sieri di pazienti infetti con Leishmania spp, Trypanosoma cruzi, Strongyloides
stercoralis e Schistosoma mansoni, presso il laboratorio del Centro
Malattie Tropicali di Negrar.
Infine, la specificità è stata calcolata, nei diversi kit ELISA, rapportando, in percentuale, il numero dei controlli negativi risultati negativi in ELISA per il numero totale dei controlli negativi considerati.
Tabella 9 – Gruppi di Controlli
Controllo Gruppo Numero
Positivo Emoscopia 46
Positivo IFAT 56
Negativo Infezione altri parassiti
15
3.3.6. Riproducibilità
Per valutare la riproducibilità intra-laboratorio dei diversi kit ELISA sono stati confrontati tra loro i risultati dei sieri testati in duplicato (due pozzetti nella stessa piastra) nel laboratorio di Parassitologia dell’AOUP (N=20). Per valutare anche la riproducibilità inter-laboratorio, sono stati
confrontati, allo stesso modo, i risultati dei sieri analizzati in doppio, presso il laboratorio di Parassitologia dell’AOUP e presso il laboratorio del CMT di Negrar (N=10).
La variabilità tra gli indici è stata valutata calcolando il coefficiente di variazione, mentre l'effetto di questa variabilità sul risultato finale
(positivo/negativo) è stata valutata calcolando la concordanza tra gli esiti.
3.3.6.1. Coefficiente di Variazione
Sono stati calcolati, tra i due valori di assorbanza (OD) di ogni campione in duplicato:
- la media aritmetica (M) - la deviazione standard (DS); - il coefficiente di variazione (CV).
La deviazione standard (DS) è data dalla radice quadrata della
sommatoria della differenza al quadrato tra i due valori di assorbanza e media aritmetica, diviso il numero di campioni (N) considerati meno 1, come dalla seguente formula:
Il coefficiente di variazione, espesso in percentuale, è stato calcolato come rapporto tra la deviazione standard (DS) e la media aritmetica (M) dei
100
(%)
x
M
DS
CV
Per una buona riproducibilità, si considerano validi i risultati con coefficiente di variazione inferiore o uguale al 20%.
3.3.6.2. Concordanza tra gli esiti
Inoltre, è stata calcolata la concordanza, come percentuale di esiti (positivo/negativo) identici.
L'esito (positivo/negativo) è stato confrontato per ogni coppia, è stato contato il numero dei risultati concordi e discordi come descritto in tabella 10 e determinata la percentuale di concordanza, rapportando il numero di campioni con lo stesso esito al numero totale di campioni.
Inoltre, è stato calcolato il coefficiente “kappa” di Cohen, a voler escludere una quota di concordanza dovuta al caso. La concordanza totale
osservata, infatti, è data dal contributo di una parte di concordanza
dovuta al caso e di una parte dovuta al reale accordo tra i test saggiati. Il contributo dell’uno o dell’altra parte di concordanza può essere stabilito attraverso un metodo statistico che, a partire dai dati della tabella di contingenza, sotto riportata, consente di calcolare il Kappa di Cohen.
Tabella 10 - Tabella di Contingenza
Test 1
+
-
Test 2
+
PP NPDove:
PP= doppi positivi (concordi) NN= doppi negativi (concordi)
NP= negativi al primo test e positivi al secondo test (discordi) PN= positivi al primo test e negativi al secondo test (discordi)
La formula per il calcolo di k di Cohen è la seguente:
)
1
(
)
(
AA
AA
AO
k
Dove:AO= accordo osservato
)
(
)
(
NP
PN
NN
PP
NN
PP
AO
AA= accordo atteso per caso
2
)
(
)]
(
)
[(
)]
(
)
[(
PN
NP
NN
PP
PN
NN
x
NP
NN
PN
PP
x
NP
PP
AA
L'interpretazione dei valori di Kappa si esegue secondo le linee-guida (Landis & Koch, 1977) in tabella 11.
Tabella 11 – Criteri interpretativi del kappa di Cohen
3.3.7. Confronto tra i diversi kit ELISA
Il risultato ottenuto nel campione di sieri dei donatori (N=37 o 43) per i quattro kit ELISA è stato confrontato, misurando la correlazione tra indici e la concordanza tra esiti.
3.3.7.1. Correlazione (R2) tra gli indici
Per valutare il grado di corrispondenza dei quattro kit ELISA, è stata calcolata la correlazione tra gli indici dei sieri dei donatori testati in ogni kit ELISA.
I valori degli indici ottenuti da ogni coppia di kit ELISA sono stati inseriti in un grafico a dispersione, includendo una retta di correlazione lineare (vedi grafici da 2 a 7).
La correlazione è stata calcolata attraverso il coefficiente di correlazione di Pearson R2.
Il coefficiente di correlazione è standardizzato e può assumere valori che vanno da –1.0, ad indicare una correlazione perfetta negativa, a +1.0, ad indicare una correlazione perfetta positiva. Una correlazione uguale a 0 indica che tra le due variabili non vi è alcuna relazione.
Di seguito è indicata la formula per il calcolo di R2: Kappa Concordanza <0.01 nulla 0.01-0.20 scarsa 0.21-0.40 modesta 0.41-0.60 moderata 0.61-0.80 buona 0.81-1.00 eccellente
Dove r2 = R2
x = valore di indice dei sieri testati con un kit ELISA = media di indice dei sieri testati con un kit ELISA y = valore di indice dei sieri testati con un altro kit ELISA
= media di indice dei sieri testati con un altro kit ELISA.
3.3.7.2. Concordanza tra gli esiti
Per valutare la concordanza tra gli esiti dei quattro diversi kit ELISA è stato usato il metodo già descritto al punto 3.3.6.2.
3.3.8. Corrispondenza tra indici ELISA e titolo IFAT
Per individuare il kit ELISA commerciale con migliore corrispondenza con il saggio IFAT, è stata eseguita un’analisi statistica di regressione lineare dei dati degli indici ottenuti in ELISA di ogni kit e dei titoli ottenuti con la
tecnica IFAT dello stesso campione. Dalla elaborazione dei dati, è stato costruito, per ogni kit ELISA, un grafico di corrispondenza (boxplot) tra titolo IFAT ed indice ELISA. Ogni boxplot mostra, per ogni titolo IFAT, una distribuzione dei valori degli indici dell'ELISA del siero corrispondente.
4. RISULTATI E DISCUSSIONE
4.1. I controlli interni
I controlli interni dei kit ELISA hanno mostrato dei valori di assorbanza tutti rientrati nei valori attesi, come mostato in tabella 12.
Il controllo positivo del kit ELISA DIA.PRO ha dato come risultato un “overflow”, ad indicare il superamento del valore massimo di assorbanza dello spettrofotometro utilizzato e non quantificabile in valore di
assorbanza.
Tabella 12 – Valori di Assorbanza (OD) dei controlli dei kit ELISA Kit ELISA Substrato
Bianco Controllo Negativo Controllo Cut-off Controllo Positivo Controllo Calibratore DRG® Malaria ELISA 0.025 0.064 0.522 0.567 1.675 NovaLisa 0.035 0.061 0.163 0.303 0.867 Euroimmun 0.090 0.921 0.311 DIA.PRO 0.056 0.123 ovf* 0.892 1.951 *overflow
4.2. Curve standard
Analizzando i grafici delle curve standard e considerando che:
- per il kit ELISA DRG® Malaria ELISA, solo lo standard 3 è overflow, lo
ST4 è maggiore dello ST3, il CV medio è pari al 6% con n°7 campioni validi;
- per il kit ELISA NovaLisa, lo ST1 è overflow, il CV medio è del 7% con n° 9 campioni validi;
- per il kit ELISA Euroimmun, lo ST1 è overflow, il CV medio è del 5% con n°8 campioni validi;
- per il kit ELISA DIA.PRO, ci sono n°5 standard overflow, il CV medio è del 10% con n°5 campioni validi;
- c'è una buona correlazione tra i valori di assorbanza (OD) e le unità di anticorpi/ml di standard per ogni curva costruita,
le curve standard dei kit ELISA DRG® Malaria ELISA e NovaLisa sono
abbatanza tipiche, quella del kit ELISA DIA.PRO è meno tipica ma considerando solo 5 punti, è accettabile.
Mentre, la curva per il kit ELISA Euroimmun risulta essere la migliore con il tipico andamento sigmoide.
Nel complesso, i test ELISA risultano validi.
Le figure 6, 7, 8 e 9 mostrano i grafici delle curve standard dei quattro kit ELISA saggiati, dove i valori degli OD sono in funzione del numero dello standard e quindi delle unità di anticorpi/ml.
Figura 7 – Curva Standard per il kit NovaLisa
Figura 8 – Curva Standard per il kit EUROIMMUN
4.3. Sensibilità
La sensibilità di ciascun test ELISA calcolata usando come test di
riferimento, da un lato l’emoscopia e dall’altro l’IFAT, è mostrata in tabella 13. In confronto all’emoscopia, la sensibilità varia dal 45,7% al 52,2%, mentre per l’IFAT dal 51,8% al 60,7%.
Questi livelli di sensibilità sono ritenuti insoddisfacenti per entrambi i confronti. Il kit ELISA, che mostra maggior sensibilità in entrambi i casi, è il kit DIA.PRO.
Tabella 13 – Sensibilità dei kit ELISA
4.4. Specificità
Tutti i sieri, appartenenti ad entrambi i gruppi di controlli negativi, hanno avuto esito negativo e la specificità calcolata è risultata del 100% per ogni kit ELISA.
4.5. Riproducibilità
4.5.1. Riproducibilità intra-laboratorio
Il coefficiente di variazione (CV) dei campioni testati in duplicato, all’interno del laboratorio (AOUP), ha superato la soglia del 20% per: - 2 campioni per il kit DRG® Malaria ELISA
- 1 campione per i kit NovaLisa - 1 campione per i kit Euroimmun
Test di riferimento
Sensibilità (%) DRG®
Malaria ELISA
NovaLisa Euroimmun DIA.PRO
Emoscopia (N=46)
50,0 50,0 45,7 52,2
- 6 campioni per il kit DIA.PRO
Il CV minimo è stato dello 0% per 2 campioni per il kit ELISA Euroimmun ed il CV massimo è stato del 42% per 1 campione per il kit Euroimmun. Nel complesso, il CV medio dei kit ELISA DRG® Malaria ELISA, NovaLisa ed Euroimmun è comparabile, mentre il più alto è quello del kit ELISA DIA.PRO. Quindi, i kit ELISA NovaLisa ed Euroimmun mostrano una
miglior riproducibilità intra-laboratorio, rispetto ai kit DRG® Malaria ELISA e DIA.PRO.
I risultati sono riassunti in tabella 14.
Tabella 14 - Riproducibilità intra-laboratorio (CV%) dei quattro kit ELISA
DRG®
Malaria
ELISA NovaLisa Euroimmun DIA.PRO
N CV>20% 2 1 1 6 N Totale 15 17 17 15 % CV>20% 13% 6% 6% 40% CV medio 11% 8% 8% 18%
N= numero dei campioni
Mentre, la concordanza tra gli esiti positivo/negativo, in termini di percentuale, dei sieri testati in duplicato, all’interno del laboratorio (AOUP), è stata del:
- 90% per la coppia di kit DRG® Malaria ELISA e Euroimmun; - 90% per la coppia di kit DRG® Malaria ELISA e NovaLisa; - 80% per la coppia di kit DRG® Malaria ELISA e DIA.PRO; - 80% per la coppia di kit Euroimmun e DIA.PRO;
- 65% per la coppia di kit NovaLisa e DIA.PRO.
Ed il coefficiente di Kappa di Cohen, è stato, per la coppia di kit ELISA: - DRG® Malaria ELISA - Euroimmun K= 0.80;
- DRG® Malaria ELISA - NovaLisa K= 0.80; - DRG® Malaria ELISA - DIA.PRO K= 0.60; - Euroimmun e DIA.PRO k=0.60;
- Euroimmun e NovaLisa k=0.84;
- NovaLisa e DIA.PRO k=0.23 (vedi tab.15).
In base ai criteri interpretativi del kappa di Cohen della tabella 11, la concordanza è:
eccellente per la coppia di kit Euroimmun–NovaLisa;
buona per le coppie di kit DRG® Malaria ELISA–Euroimmun e DRG® Malaria ELISA;
moderata per le coppie di kit DRG® Malaria ELISA - DIA.PRO e Euroimmun e DIA.PRO;
modesta per la coppia di kit NovaLisa e DIA.PRO.
Nel complesso, questo risultato ci mostra, ulteriormente, una miglior riproducibilità intra-laboratorio dei kit Euroimmun–NovaLisa rispetto agli altri kit ELISA.
Tabella 15 – Concordanza intra-laboratorio dei kit ELISA DRG® Malaria – NovaLisa DRG® Malaria – Euroimmun DRG® Malaria – DIA.PRO Euroimmun -NovaLisa NovaLisa – DIA.PRO Euroimmun– DIA.PRO N° risultati concordi 18 18 16 14 14 18 N° risultati discordi 2 2 4 2 6 2 N° Totale 20 20 20 20 20 20 Concordanza 90% 90% 80% 93% 65% 80% Kappa di Cohen 0.80 0.80 0.60 0.84 0.23 0.60
4.5.2. Riproducibilità inter-laboratorio
Il coefficiente di variazione (CV) dei 10 sieri a titolo noto IFAT, analizzati nei due Laboratori (AOUP e Negrar) ha superato la soglia del 20% per: - 6 campioni per il kit ELISA DRG® Malaria ELISA
- 9 campione per i kit ELISA NovaLisa - 5 campione per i kit ELISA Euroimmun - 10 campioni per il kit ELISA DIA.PRO
Il CV minimo è stato dello 0% per 1 campioni per il kit ELISA Euroimmun ed il CV massimo è stato del 102% per 1 campione per il kit Euroimmun. Il CV medio del kit Euroimmun è il più basso tra quelli degli altri kit ELISA. Nel complesso, i kit ELISA saggiati mostrano una riproducibilità
inter-laboratorio non soddisfacente, sebbene, il kit Euroimmun sia il kit con più campioni con CV≤20%.
I risultati sono riassunti in tabella 16.
Tabella 16 – Riproducibilità inter-laboratorio (CV%) dei kit ELISA
N= numero dei campioni
La concordanza tra gli esiti positivo/negativo dei 10 sieri IFAT, testati con i quattro diversi kit ELISA nei due Laboratori (AOUP e CMT di Negrar), è stata del:
DRG®
Malaria
ELISA NovaLisa Euroimmun DIA.PRO
N CV>20% 6 9 5 10 N Totale 10 10 10 10 % CV>20% 60% 90% 50% 100% CV medio 36% 53% 33% 47%
- 100% per il kit ELISA Euroimmun;
- 80% per i kit DRG® Malaria ELISA e kit ELISA NovaLisa; - 70% per il kit ELISA DIA.PRO. (vedi tab.17)
Mentre, il coefficiente kappa di Cohen è risultato uguale a: - 1 per il kit Euroimmun
- 0.62 per il kit DRG® Malaria ELISA - 0.60 per il kit NovaLisa
- 0.44 per il kit DIA.PRO
In base ai criteri interpretativi del kappa di Cohen della tabella 11, il kit ELISA Euroimmun, rispetto agli altri kit ELISA testati, mostra un’eccellente concordanza tra gli esiti positivo/negativo dei sieri analizzati nei due
laboratori.
Tabella 17 – Concordanza inter-laboratorio (AOUP-CMT di Negrar) tra i kit ELISA
Campione CONCORDANZA
ID DRG® NovaLisa Euroimmun DIA.PRO
3589 si si si si 3028 si si si si 1795 si si si no 3414 no no si no 16 si no si no 4307 si si si si 2106 si si si si 3451 no si si si 2375 si si si no 1090 si si si si N° Concordi 8 8 10 7 Concordanza 80% 80% 100% 70% Kappa di Cohen 0.62 0.60 1 0.44
4.6. Confronto dei risultati dei diversi kit ELISA 4.6.1. Correlazione (R2) tra indici
Sulla base dei seguenti risultati dei coefficienti di correlazione R2 tra gli
indici della coppia di kit ELISA:
- DRG® Malaria ed Euroimmun con R2 = 0.22
- DRG® Malaria e NovaLisa con R2 = 0.75
- DRG® Malaria e DIA.PRO con R2 = 0.10
- NovaLisa e Euroimmun con R2 = 0.23
- NovaLisa e DIA.PRO con R2 = 0.08
- Euroimmun e DIA.PRO con R2 = 0.02
la correlazione tra indici è:
alta tra DRG® Malaria ELISA e NovaLisa
bassa tra DRG® Malaria ELISA ed Euroimmun, tra NovaLisa ed Euroimmun
assente tra DIA.PRO e tutti gli altri kit ELISA. Questa correlazione è illustrata nei grafici da 2 a 7.
Alla luce di questi risultati, l’esito dello screening del donatore di sangue potrebbe essere diverso a seconda del kit ELISA utilizzato, come descritto nel prossimo paragrafo.
Grafico 3 – Correlazione tra i kit DRG® Malaria ELISA ed Euroimmun
Grafico 4 – Correlazione tra i kit DRG® Malaria ELISA e DIA.PRO
Grafico 5 – Correlazione tra i kit NovaLisa ed Euroimmun
