La sindrome da deficit della creatina (Cr) cerebrale corrisponde ad un gruppo di errori congeniti del metabolismo denominati complessivamente Creatine Deficiency Syndromes (CDS). Tra questi disturbi rientrano tre tipi di difetti metabolici. I primi due sono relativi alla sintesi endogena della creatina, affidata agli enzimi Arginina-Glicina-Amidinotransferasi (AGAT) e Guanidinoacetato-Metiltransferasi (GAMT). Questi difetti metabolici provocano l’incapacità dell’organismo di sintetizzare il composto. Il terzo disturbo riguarda il trasportatore della creatina (CRTR). Tutti e tre le condizioni presentano lo stesso meccanismo patogenetico, ovvero la deplezione di creatina cerebrale, caratterizzato da disabilità intellettiva, disturbi del movimento, comportamento simil-autistico, deficit di apprendimento del linguaggio, epilessia e disturbi del movimento. Poiché la sindrome da deficit del trasportatore di creatina (CRTR-D) manca ancora di un protocollo terapeutico consolidato, sarebbe utile riuscire ad identificare delle proteine marker significative per comprendere le cause delle alterazioni alla base della patologia.
L’esistenza di modelli animali preclinici sono mezzi cruciali per analizzare i meccanismi patogenetici e sviluppare nuove strategie terapeutiche. Anche per lo studio delle sindromi da deficit di creatina sono stati creati dei modelli murini in cui la delezione del gene del trasportatore ha portato a topi in cui manca il trasportatore della creatina sia a livello centrale che periferico e che mostrano il fenotipo cognitivo, valutato da test comportamentali, simile all’uomo. Questo studio è nato in collaborazione con l’istituto di Neuroscienze del CNR dell’Università di Pisa (dott. Pizzorusso) che possiede i modelli murini con deficit del trasportatore di creatina. Utilizzando topi KO per il trasportatore della creatina siamo andati per la prima volta a studiare la mappa proteomica dei mitocondri ottenuti dal cervello comparandola con la corrispondente ottenuta dai topi WT. In uno studio precedente condotto nel nostro laboratorio abbiamo analizzato le mappe proteomiche mitocondriali da cervello di topi Wild Type e Knock out per il trasportatore della creatina a 30 giorni di età. Utilizzando elettroforesi accoppiata a spettrometria di massa avevamo identificato diverse proteine differenzialmente espresse legate allo stress ossidativo e catena respiratoria mitocondriale.
Lo scopo del mio lavoro di tesi è stato quello di analizzare, utilizzando la stessa tipologia di approccio, i patterns proteici di mitocondri ottenuti da cervello di topi Wild Type e Knock out per il trasportatore della creatina a 12 giorni di età al fine di identificare potenziali biomarcatori precoci della sindrome.
I cervelli sono stati prelevati subito dopo il sacrificio degli animali di 12 giorni di età e processati per l’ottenimento delle preparazioni mitocondriali. Le proteine estratte dalla frazione mitocondriale, secondo quanto descritto in metodi, sono state sottoposte ad elettroforesi bidimensionale. Nella figura 18 sono riportate delle immagini rappresentative del pattern proteico mitocondriale ottenuto da topi WT e KO rispettivamente. L’analisi dei gels condotta utilizzando il programma Same spot, ha portato all’individuazione di circa 2000 spots proteici. Dall’analisi comparativa condotta tra i gruppi KO e WT 4 spots risultano differenzialmente espressi in modo significativo anche se con variazioni comprese fra 1.2- 1.5.
Figura n. 18: Immagini dei pattern proteici
In tabella 3 è riportato il numero degli spots trovati differenzialmente espressi in modo significativo, l’entità della variazione, il p value ottenuto dall’analisi ANOVA e i volumi normalizzati degli spots nelle due condizioni. Il volume riportato per ogni condizione è il
TABELLA 3
# SPOT WT KO KO vs WT
MEDIA SEM MEDIA SEM Pvalue Fold
1309 7583762 349989,1 8655355 201800,4 0,0291443 1,14↑ 1497 843376,2 27393,23 691935 26940,56 0,00428618 1,22↓ 1518 1477485 88996,79 1764538 50103,22 0,0228209 1,2↑ 4835 1660325 294357,4 2917432 278020 0,0145605 1,76↑ 5165 325078,3 8155,134 699087,3 133506,9 0,0233338 2,15↑
In figura 19 A e B è riportato l’istogramma con le immagini ingrandite ottenute nel confronto WT /KO degli spot di interesse. Da notare che per tutti questi spots si riscontra un aumento nel caso del KO rispetto al WT.
Figura n.19B: Immagini ingrandite degli spot di interesse
In Figura 20 è riportata l’analisi delle componenti principali ottenuta sempre con il programma Same spot che ci permette di vedere come i pochi spots differenzialmente espressi siano comunque in grado di determinare una buona separazione tra le due classi con valori di percentuale di 60.6 per la prima componente e di 15.8 per la seconda componente.
Figura n.20: Analisi delle componenti principali ottenuta mediante il programma Same spot
Gli spots di interesse sono stati tagliati, tripsinizzati ed inviati all’analisi di spettrometria di
1309
WT
KO
1497
1518
4835
5165
(Dott. Maurizio Ronci). In modo del tutto preliminare abbiamo proceduto ad un confronto delle mappe a 12 giorni con quelle ottenute a 30 giorni ed abbiamo evidenziato che gli spot di interesse non si sovrappongono con nessuna delle proteine identificate precedentemente. In conclusione questi dati preliminari suggeriscono una diversità di risposta alla carenza del trasportatore della creatina nelle fasi iniziali di sviluppo almeno nelle due età analizzate. Questi risultati suggeriscono la necessità di uno studio proteomico ad un età intermedia tra le due finora analizzate con valutazione contemporanea degli effetti fisiologici allo scopo di individuare da un lato i meccanismi di evoluzione della sindrome e dall’altro la possibilità di individuare marcatori precoci.
4.1 CONCLUSIONE
In conclusione questo lavoro di tesi suggerisce come una visione di insieme delle alterazioni delle proteine mitocondriali cerebrali ottenuta tramite analisi proteomica possa dare importanti indicazioni sia sulla validità del modello murino di deficit del trasportatore della creatina sia sull’eventuale possibilità di utilizzare farmaci che controllino l’attività alterata delle proteine mitocondriali.
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