Risultati e discussione
Come già ampiamente descritto, il fenomeno della vascular inflammation è caratterizzato da due diverse tipologie di stimolo: uno di natura prettamente infiammatoria e l’altro di natura ossidativa. In questo lavoro di tesi sono state investigate le proprietà protettive di erucina nei confronti di entrambi gli stimoli.
Per quanto riguarda lo stimolo di natura ossidativa, in lavori di tesi precedentemente svolti presso il laboratorio di farmacologia del Professor Calderone era già stata confermata l’azione protettiva di erucina nei confronti dello stress ossidativo indotto mediante la somministrazione di H2O2 in cellule
HUVEC e HASMC. In particolare, era stato valutato il coinvolgimento in tale azione protettiva di due diversi pathway: quello delle sirtuine e quello di AMPK. In questo lavoro di tesi l’indagine è stata focalizzata invece sulla valutazione del coinvolgimento di un altro fondamentale pathway nell’ambito dei sistemi antiossidanti endogeni, ovvero quello di Nrf2.
La somministrazione di H2O2 200 µM in cellule di muscolatura liscia vascolare
HASMC determina una riduzione della vitalità cellulare di oltre il 30% (% di vitalità cellulare in cellule HASMC trattate con H2O2 vs veicolo = 68.6% ±
4.0%). Come già osservato in studi precedenti, l’isotiocianato erucina alla massima concentrazione testata, ovvero la 3 µM, determina una significativa protezione nei confronti del danno indotto da H2O2, mantenendo i livelli di
vitalità cellulare ad un valore di 90.5% ± 4.4 %. Il coinvolgimento del pathway di Nrf2 è stato valutato pre-incubando le cellule HASMC trattate con erucina 3 µM e H2O2 200 µM con ML385 10 µM. La pre-incubazione di questo inibitore
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di esercitare la propria azione protettiva nei confronti del danno di natura ossidativa, facendo registrare una vitalità cellulare del 68.4% ± 8.7% (Grafico
1). Veic olo M 200 2 O 2 H M 200 2 O 2 M + H Eru 3 2 O 2 M + H M + Eru 3 ML3 85 1 0 0 25 50 75 100 125
***
## § Vi ta li tà cel lu lar eGrafico 1. Istogrammi relativi alla vitalità cellulare delle HASMC dopo 1h di pre-incubazione con
veicolo (DMSO 0,1%) o con ML385 10 µM, successivo trattamento con veicolo (DMSO 0,03%) o con erucina 3 µM per 1h e ulteriore trattamento con H2O2 200 µM per 2h. Gli istogrammi rappresentano
la media ± l’errore standard (SEM). Gli asterischi (*) si riferiscono ad un valore % di vitalità significativamente differente da quello del veicolo (*** p < 0,001), il simbolo # indica un valore % di vitalità significativamente differente dal danno (## p < 0,01) mentre il simbolo § indica un valore % di vitalità significativamente differente rispetto ad erucina 3 µM + H2O2 200 µM (§ p < 0,05).
Lo stesso protocollo è stato applicato a cellule endoteliali HUVEC, ma con differente concentrazione di H2O2, cioè utilizzando una concentrazione più
adatta a tale linea cellulare, come riportato in letteratura (Park, 2013; Jin et al., 2015)). Come già osservato nell’altra linea cellulare, l’esposizione allo stimolo ossidativo determina una riduzione della vitalità cellulare di circa il 18% (%
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vitalità cellulare in cellule HUVEC trattate con H2O2 100 µM vs veicolo = 82.4
% ± 2.9%). Il pre-trattamento delle cellule con erucina 3 µM preserva completamente la vitalità delle cellule endoteliali sottoposte a stimolo ossidativo (H2O2 100 µM) mantenendo una piena vitalità cellulare (101.8% ±
3.8%). Anche in questo caso, la pre-incubazione delle cellule con un inibitore del pathway di Nrf2, quale ML385 10 µM, determina una significativa inibizione della protezione esercitata da erucina, facendo registrare una % di vitalità cellulare pari a 78.0% ± 3.6% (Grafico 2).
Veicol o M 100 2 O 2 H M 100 2 O 2 M + H Eru 3 2 O 2 M + H M + E ru 3 ML3 85 10 0 25 50 75 100 125
**
### §§§ Vi ta li tà cel lu lar eGrafico 2. Istogrammi relativi alla vitalità cellulare delle HUVEC dopo 1h di pre-incubazione con
veicolo (DMSO 0,1%) o con ML385 10 µM, successivo trattamento con veicolo (DMSO 0,03%) o con erucina 3 µM per 1h e ulteriore trattamento con H2O2 100 µM per 2h. Gli istogrammi rappresentano
la media ± l’errore standard (SEM). Gli asterischi (*) si riferiscono ad un valore % di vitalità significativamente differente da quello del veicolo (** p < 0,01), il simbolo # indica un valore % di vitalità significativamente differente dal danno (### p < 0,001) mentre il simbolo § indica un valore % di vitalità significativamente differente rispetto ad erucina 3 µM + H2O2 100 µM (§§§ < 0,001).
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Tale effetto protettivo viene confermato anche dalla valutazione della produzione delle specie reattive dell’ossigeno (ROS) in cellule sottoposte a stimolo ossidativo. Infatti, la somministrazione di H2O2 100 µM in cellule
HUVEC determina un incremento % delle ROS di circa il 25% (% ROS vs veicolo = 125.1% ± 9.0%). La pre-incubazione di erucina riporta la % delle ROS a valori simili o addirittura inferiori a quelli del veicolo (Eru 3 µM + H2O2 100
µM vs veicolo= 94.2% ± 4.5%). La pre-incubazione con l’inibitore del pathway di Nrf2, ML385 10 µM, determina un incremento significativo delle ROS rispetto al veicolo, probabilmente dovuto sia allo stimolo ossidativo H2O2 sia
all’inibizione stessa del pathway di Nrf2 (ML385 10 µM + Eru 3 µM + H2O2 100
µM vs veicolo= 175.2% ± 5.9%) (Grafico 3). Veicol o M 100 2 O 2 H M 100 2 O 2 M + H Eru 3 2 O 2 M + H M + E ru 3 ML3 85 10 0 25 50 75 100 125 150 175 200
**
##
§§§
% ROS78 Grafico 3. Istogrammi relativi alla % di produzione nelle ROS HUVEC dopo 1h di pre-incubazione
con veicolo (DMSO 0,1%) o con ML385 10 µM, successivo trattamento con veicolo (DMSO 0,03%) o con erucina 3 µM per 1h e ulteriore trattamento con H2O2 100 µM per 2h. Gli istogrammi
rappresentano la media ± l’errore standard (SEM). Gli asterischi (*) si riferiscono ad un valore % di vitalità significativamente differente da quello del veicolo (** p < 0,01), il simbolo # indica un valore % di vitalità significativamente differente dal danno (## p < 0,01) mentre il simbolo § indica un valore % di vitalità significativamente differente rispetto ad erucina 3 µM + H2O2 100 µM (§§§ < 0,001).
Per quanto riguarda lo stimolo di natura infiammatoria, si è scelto di utilizzare uno stimolo che inducesse un’infiammazione acuta e sostenuta. Il danno è stato ottenuto somministrando in entrambe le linee cellulari lipopolisaccaride (LPS) a diverse concentrazioni. In particolare, in linea con quanto riportato in letteratura (Simon e Fernàndez, 2009; Jiang et al., 2017), l’effetto sulle due linee è di natura diversa poiché sulle cellule di muscolatura liscia vascolare HASMC la somministrazione di LPS 100 ng/ml determina un effetto ipertrofico che fa registrare valori di vitalità cellulare pari a 123.8% ± 5.1 % rispetto al veicolo considerato come 100% (100.6% ± 4.1%). La pre-incubazione di tre diverse concentrazioni di erucina (0.3 µM, 1 µM e 3 µM) previene in modo significativo questo effetto ipertrofico mostrando % di vitalità cellulare che sono pari a 98.1% ± 3.1% quando LPS è preceduto dall’incubazione di erucina 0.3 µM, 99.6% ± 7.4%, quando LPS è preceduto dall’incubazione di erucina 1 µM e 94.6% ± 5.0% quando LPS è preceduto dalla pre-incubazione con erucina 3 µM (Grafico 4).
79 Veicol o LPS 1 00 ng/m l M + L PS 10 0 ng/m l Eru 0 .3 M + LPS 100 n g/ml Eru 1 M + L PS 10 0 ng/m l Eru 3 0 25 50 75 100 125 150 ## ###
**
## V it al it à cel lu lar eGrafico 4. Istogrammi relativi alla vitalità cellulare delle HASMC dopo 1h di pre-incubazione con
veicolo (DMSO 0,03%) o con erucina a diverse concentrazioni (Eru 0.3 µM- 1 µM -3 µM) e successivo trattamento con LPS 100 ng/ml, incubato per 24h. Gli istogrammi rappresentano la media ± l’errore standard (SEM). Gli asterischi (*) si riferiscono ad un valore % di vitalità significativamente differente da quello del veicolo (** p< 0,01) mentre il simbolo # indica un valore % di vitalità significativamente differente rispetto al danno (## p< 0,01 e ### p< 0,001).
La somministrazione di LPS 1 µg/ml su cellule endoteliali HUVEC determina invece una riduzione della vitalità cellulare di oltre il 15%, facendo registrare valori di vitalità cellulare pari a 83.5% ± 2.8%. Erucina pre-incubata a tre diverse concentrazioni determina una protezione concentrazione-dipendente fino al raggiungimento di una significatività statistica solo alla massima concentrazione testata, ovvero la 3 µM (% di vitalità cellulare delle cellule trattate con Eru 0.3 µM + LPS vs veicolo: 78.5 ± 2.6; Eru 1 µM + LPS ml vs veicolo: 85.6 ± 3.3; Eru 3 µM + LPS ml vs veicolo: 94.1 ± 2.3) (Grafico 5).
80 Veicol o g/ml LPS 1 g/ml M + L PS 1 Eru 0 .3 g/ml M + L PS 1 Eru 1 g/ml M + L PS 1 Eru 3 0 25 50 75 100 125 ##
***
V it al it à cel lu lar eGrafico 5. Istogrammi relativi alla vitalità cellulare delle HUVEC dopo 1h di pre-incubazione con
veicolo (DMSO 0,03%) o con erucina a diverse concentrazioni (Eru 0.3 µM- 1 µM -3 µM) e successivo trattamento con LPS 1 µg/ml, incubato per 24h. Gli istogrammi rappresentano la media ± l’errore standard (SEM). Gli asterischi (*) si riferiscono ad un valore % di vitalità significativamente differente da quello del veicolo (*** p< 0,001) mentre il simbolo # indica un valore % di vitalità significativamente differente rispetto al danno (## p< 0,01).
Infine, vista la natura infiammatoria dello stimolo indotto con LPS e considerati gli effetti preventivi di erucina 3 µM nei confronti della vitalità cellulare su cellule HUVEC, è stata investigata la capacità di tale concentrazione di erucina di inibire l’incremento del marker infiammatorio TNFα nel surnatante delle cellule endoteliali. La somministrazione di LPS 1 µg/ml ha determinato un incremento significativo dei valori di TNFα, che sono passati da un valore pressochè pari a 0 pg/ml nelle cellule trattate con
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solo veicolo ad un valore di 2.1 ± 0.3 pg/ml nelle cellule trattate con LPS. La pre-incubazione di erucina 3 µM prima dello stimolo di natura infiammatoria indotto con LPS ha determinato una prevenzione significativa dell’incremento dei livelli di TNFα facendo registrare livelli pari a 0.4 ± 0.1 pg/ml (Grafico 6).
Veicol o g/ml LPS 1 g/ml M + L PS 1 Eru 3 0 1 2 3 4 5
###
***
T NF - p g /m LGrafico 6. Istogrammi relativi alla produzione di TNFα da parte di cellule HUVEC dopo 1h di pre-
incubazione con veicolo (DMSO 0,03%) o con erucina 3 µM e successivo trattamento con LPS 1 µg/ml, incubato per 24h. Gli istogrammi rappresentano la media ± l’errore standard (SEM). Gli asterischi (*) si riferiscono ad un valore pg/ml di TNFα significativamente differente da quello del veicolo (*** p< 0,001) mentre il simbolo # indica un valore pg/ml di TNFα significativamente differente rispetto al danno (### p< 0,001).
I dati ottenuti in questo lavoro di tesi hanno confermato le capacità protettive di erucina nei confronti del danno di natura ossidativa su entrambe le
82
principali componenti della parete vasale: endotelio e muscolatura liscia. È stato infatti dimostrato che erucina protegge l’endotelio e la muscolatura liscia nei confronti dello stimolo ossidativo attraverso il coinvolgimento del pathway di Nrf2. Inoltre, è stato dimostrato che erucina è in grado di prevenire il danno indotto attraverso lo stimolo infiammatorio generato da LPS sia in cellule endoteliali che in cellule di muscolatura liscia vascolare.
In conclusione, erucina si conferma un agente dotato di proprietà antiossidanti che possono, almeno in parte apparentemente preponderante, essere spiegate dal coinvogimento del pathway di Nrf2. Inoltre, erucina si conferma capace di proteggere le componenti del vaso nei confronti dell’infiammazione acuta, ponendosi come prospettiva terapeutica o nutraceutica in grado di prevenire i danni indotti dal processo denominato vascular inflammation.
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