5.1 Preparazione dei ligandi
Come descritto nell’Introduzione, lo scopo di questo studio è quello di investigare il binding alla DNA girasi di due ligandi diversi, ottenuti da modificazioni specifiche (aggiunta di gruppi photoswitch) ad un precursore comune “ciprofloxacina”.
Poiché nella struttura molecolare di tale precursore è presente un anello di piperazina (eterociclo con due atomi di azoto “N” in posizione 1 e 4, Figura 5.1) che a temperatura fisiologica è mobile, è stato necessario prendere in considerazione tutte le possibili conformazioni che, per mobilità di tale anello potevano essere generate. Questo perché il processo di docking che è stato eseguito successivamente, permette di ruotare i legami così da esplorare le varie conformazioni e valutare come queste si legano all’enzima ma, allo stesso tempo, tratta gli anelli come gruppi rigidi impedendo di considerare la loro flessibilità interna.
Da una prima ricerca conformazionale, quindi, sono state identificate quattro possibili conformazioni per la piperazina:
- Due conformazioni “Boat” che differiscono nella disposizione spaziale del resto della molecola di ciprofloxacina rispetto al piano creato dall’anello, in un caso assiale e in un altro equatoriale.
- Due conformazioni “Chair” che, allo stesso modo delle precedenti, differiscono nella disposizione spaziale del resto della molecola di ciprofloxacina rispetto al piano creato dall’anello; perciò, anche in questo caso, una conformazione assiale e una conformazione equatoriale.
Figura 5.1, Rappresentazioni delle conformazioni “Boat”(a sinistra) e “Chair”(a destra) dell’anello di piperazina.
Dall’aggiunta di ciascun photoswitch a un atomo di azoto in entrambe le disposizioni spaziali (assiale ed equatoriale) dell’anello piperazinico (Chair e Boat), sono state generate tutte le possibili strutture: questo rappresenta una analisi preliminare fondamentale per poter disporre della totalità di ligandi e poter definire poi con sicurezza, quelli in grado di legarsi meglio all’enzima. In totale sono risultate 40 strutture (Figura 5.2).
47 NOME* R1 R2 R3 R4 SPR C aa SPR B aa SPR C ee SPR B ee SPR C ae SPR B ae SPR C ea SPR B ea SPS C aa SPS B aa SPS C ee SPS B ee SPS C ae SPS B ae SPS C ea SPS B ea MC C aa MC B aa MC C ee MC B ee MC C ae MC B ae MC C ea MC B ea AC C aa AC B aa AC C ee AC B ee AC C ae AC B ae AC C ea AC B ea AT C aa AT B aa AT C ee AT B ee AT C ae AT B ae AT C ea AT B ea CP Ø SPR H AT H Ø CP H AT CP Ø H AT CP Ø MC H Ø CP H SPR CP Ø H SPR Ø CP SPR H CP Ø H SPS Ø CP SPS H CP Ø SPS H Ø CP H SPS Ø CP CP Ø H MC Ø CP MC H CP Ø AC H Ø CP H AC Ø AT H CP CP Ø H AC Ø CP AC H CP H MC Ø
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Figura 5.2, La tabella a sinistra in figura rappresenta le 40 strutture generate. A destra sono rappresentate le conformazioni dell’anello piperazinico, il resto della molecola a completamento
della ciprofloxacina e i photoswitch dei due sistemi considerati.
Queste sono ripartite in:
1) Azofloxacina Cis/Trans: 16 strutture (8 per l’azofloxacina in conformazione Cis e 8 per quella in conformazione Trans)
2) Spiropirano/Merocianina: 24 strutture, perché nella struttura dello spiropirano è presente un atomo di carbonio chirale. Questa molecola, quindi, esiste in due forme enantiomeriche R e S, rispettivamente denominate SPS e SPR.
Figura 5.3, Rappresentazione degli enantiomeri di spiropirano.
5.2 Preparazione della proteina
Prima di procedere al docking è stata necessaria una fase di preparazione della proteina a causa degli errori che, per i limiti della tecnica di cristallizzazione, erano presenti nella struttura cristallografica e che, se non risolti, avrebbero compromesso seriamente i risultati delle successive analisi. Alterazioni localizzate nella DNA girasi a livello della tasca di legame per la ciprofloxacina, infatti, potrebbero impedire la riproduzione delle reali interazioni che il ligando compie con l’enzima e che sono fondamentali per mantenerlo all’interno del sito di legame.
Uno dei più̀ importanti limiti della tecnica usata per ottenere la struttura cristallografica è l’impossibilità di determinare lo stato di protonazione di gruppi acidi e basici, perché la densità elettronica degli idrogeni, essendo dotati di un unico elettrone, non può essere distinta da quello che è considerato il rumore di fondo. Pertanto, in generale, nel cristallo non è possibile identificare gli idrogeni e non è quindi possibile conoscere lo stato di protonazione, che può essere diverso da quello che un determinato aminoacido presenta in soluzione acquosa (condizioni fisiologiche) e dipendere invece dalle interazioni che questo stabilisce con ciò che è presente nel suo intorno (molecole/residui). Quanto descritto, è particolarmente delicato quando si considerano gli aminoacidi localizzati vicino alla tasca di legame, responsabili dell’accomodamento corretto del ligando nel sito target della proteina.
Per determinare lo stato di protonazione, sono stati quindi applicati due metodi (H++ e PROPKA), che hanno permesso di simulare il cambiamento del valore di pKa di ciascun aminoacido: da quello che quest’ultimo aveva in acqua (ambiente fisiologico) a quello posseduto quando localizzato nella
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struttura della DNA girasi. Tramite questa analisi, è stata ottenuta una previsione del valore di pKa per ogni aminoacido. Di questi poi, sono stati ulteriormente analizzati solo gli aminoacidi per i quali i programmi hanno fornito valori di pKa che indicavano protonazioni non standard in almeno una delle due catene polipeptidiche (B o D) di cui il recettore è costituito, risultati che sono riportati in
Tabella 5.1.
CHAIN B CHAIN D PROPKA H + +
PROPKA H + + RESIDUE pKa pKa pKa pKa
ASP 510 8.5 6.4 9.3 6.4 ASP1024 5.7 5.4 7.3 5.0 GLU 435 > 12 > 12 11.6 > 12 GLU 477 6.3 6.1 7.5 6.4 GLU 585 5.9 7.0 8.1 7.0 GLU1088 6.8 8.4 6.5 7.2 HIS 501 5.5 7.3 6.4 6.6 HIS 600 6.6 6.9 6.8 7.2 HIS 1081 1.1 9.7 2.3 11.0 HIS 1186 3.3 7.1 3.5 7.0 HIS 1390 6.4 7.5 6.6 7.7 LYS 466 5.3 > 12 5.9 > 12 LYS 1043 6.0 > 12 6.2 > 12
Tabella 5.1, Tabella rappresentante gli aminoacidi con stato di protonazione non-standard secondo le predizioni di PROPKA e di H ++.
Dall’osservazione dei risultati riportati in Tabella 5.1 per l’acido aspartico (Asp) 510, è possibile notare come, mentre PROPKA fornisce output entrambi superiori a 7 (più precisamente 8.5 e 9.9) e quindi valori che indicano per questo aminoacido una forma non standard, quelli di H ++ sono entrambi inferiori a 7 (6.4 e 6.4). Tuttavia, una successiva analisi del dato cristallografico della DNA girasi ha permesso di evidenziare l’interazione di tale residuo con uno ione Mn2+ la cui presenza non
è stata tenuta in considerazione dalle predizioni dei due metodi usati (si veda Figura 5.4). Poiché un’interazione di questo tipo stabilizza ulteriormente la forma deprotonata degli Asp, l’unica forma dell’aminoacido in questione che permetterebbe tale scenario è quella anionica e i valori “non- canonici” di PROPKA, perciò, possono essere associati al fatto che le predizioni non considerano l’effetto dello ione vicino. Asp 510, dunque, non è stato modificato.
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Figura 5.4, Rappresentazione dell’interazione tra Asp 510 e lo ione Mn 2+ (sfera gialla).
D’altra parte, i residui Glu 435 e Glu 1088 presentano valori di pKa che potrebbero indicare forme neutre. Per Glu 435 c’è una maggior concordanza tra i risultati di PROPKA e di H ++ rispetto agli aminoacidi considerati precedentemente, perché in questo caso i valori sono vicini o superiori a 12; per Glu 1088, i valori di PROPKA oscillano intorno a 6.5-6.8 mentre quelli di H ++ sono superiori a 7. Ancora una volta, la struttura del cristallo (Figura 5.5) ha indicato che entrambi i residui sono localizzati vicino a ioni Mn2+, con i quali interagiscono. Dato che l’interazione con questo ione positivo, non tenuta conto nelle predizioni di pKa, stabilizzerebbe ulteriormente la forma anionica dei Glu, anche in questo caso entrambi i residui sono in forma deprotonata e non è stato quindi necessario modificarli.
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Figura 5.5, Rappresentazioni dell’interazione tra Glu 435 e lo ione Mn 2+(a sinistra) e tra Glu 1088 e lo ione Mn 2+ (a destra).
Per quanto riguarda Glu 477, i risultati presentano valori intorno a 6 e un solo valore, proveniente da PROPKA, è superiore a 7. Dato però che la localizzazione di questo residuo è in una posizione vicina
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ad una Arg protonata e al gruppo -NH2+ della ciprofloxacina, quest’ultima non considerata nelle
predizioni di pKa, nuovamente le interazioni suggeriscono la forma anionica di questo residuo che non ha necessitato di alcuna modifica. Per Glu 585 i valori di pKa, essendo complessivamente intorno a 7, indicano una stessa probabilità di essere presente in forma protonata o deprotonata. In ogni caso, la posizione di tale residuo è lontana dal sito di binding dei ligandi generati in precedenza, quindi abbiamo deciso di mantenere la forma anionica abituale.
Prendendo in analisi Lys 466 e Lys 1043, vi è una discordanza importante tra i risultati di PROPKA (indicanti forme deprotonate/non standard) e quelli di H ++ (pKa > 12 per entrambe). Poiché le posizioni di questi residui nel cristallo dell’enzima indicano interazioni con i gruppi fosfato (carichi negativamente) del DNA (si veda Figura 5.6), i risultati H++ in questo caso sembrano più affidabili e la forma cationica delle Lys sembra quella più ragionevole. Questi residui, pertanto, non sono stati modificati.
Figura 5.6, Rappresentazione dell’interazione di Lys 466 con i gruppi fosfato del backbone di DNA (rappresentato in viola).
I risultati di PROPKA rispetto alle Lys suggeriscono che questo programma non considera correttamente l’impatto del DNA nelle predizioni, talvolta dovuto alla natura empirica di questo approccio che è maggiormente parametrizzato per molecole proteiche. Invece, i risultati H ++ basati su calcoli elettrostatici sembrano essere più affidabili.
Considerando inoltre i residui His 1081 e His 1390, i quattro valori di pKa di ciascuno di essi riportati in Tabella 5.1 mostrano nuovamente differenze tra i risultati di PROPKA (al di sotto di 7) e i risultati di H ++ (superiori a 7, non standard). Data la maggiore affidabilità di H ++ osservata per i risultati con le Lys e, dato che, His 1081 interagisce con un gruppo fosfato (carico negativamente) del DNA e His 1390 è localizzata vicino ad un Glu (carico negativamente), per poter soddisfare queste interazioni tali aminoacidi sono stati considerati in forma protonata e quindi modificati.
Infine, i valori H ++ per His 501, His 600 e His 1186 sono risultati tutti intorno a 7, indicando una stessa probabilità, per questi residui, di essere presenti in una forma protonata o in una deprotonata. Per questo motivo e anche per il fatto che, data la loro lontananza dal sito di binding la scelta della
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loro forma non avrebbe inficiato in modo significativo i risultati dello step successivo di docking, sono stati considerati come neutri (forma più abituale per questo tipo di aminoacido).
5.3 Molecular Docking
Le simulazioni di docking sono state condotte con lo scopo di determinare il binding mode dei ligandi al complesso DNA-proteina, consentendo di stabilire anche le conformazioni che, in questi, l’anello di piperazina adotta per il legame.
Poiché tutti i 40 ligandi presentavano nella loro struttura il precursore ciprofloxacina e poiché a tale porzione della molecola era attribuibile il ruolo di legame alla DNA girasi, è stata applicata una restrizione al metodo del docking, ancorando (tethering) l’orientazione di alcuni gruppi del gruppo ciprofloxacina allo stesso modo di come erano posizionati nel ligando del dato cristallografico di origine. In questo modo, è stato possibile restringere il numero di pose generate per ciascun ligando a quelle che, effettivamente, corrispondevano a modalità di legame ipoteticamente veritiere.
Dall’applicazione del “Tethered Docking” a ciascuna delle 40 strutture photoswitch in combinazione con la struttura della DNA girasi, sono state ottenute molteplici pose, cioè possibili posizioni/orientazioni assunte da ciascun ligando nel legare il recettore. La qualità del binding di ciascuna posa di ciascun ligando è definita da un parametro denominato SCORE, calcolato tramite un’opportuna funzione e che è un valido indicatore di quella che è l’affinità di legame tra il ligando stesso e il recettore. Il calcolo dello SCORE ha consentito quindi di traslare un’analisi basata interamente sulla geometria dei due componenti del sistema, in un’analisi in grado di considerare anche l’energia di interazione.
La funzione di score utilizzata nel programma rDock è scrivibile come somma di vari contributi:
𝑆𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 = 𝑆𝑖𝑛𝑡𝑒𝑟+ 𝑆𝑖𝑛𝑡𝑟𝑎+ 𝑆𝑠𝑖𝑡𝑒+ 𝑆𝑟𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎𝑖𝑛𝑡 (1)
dove 𝑆𝑖𝑛𝑡𝑟𝑎 descrive il contributo intramolecolare allo score, 𝑆𝑠𝑖𝑡𝑒 quello relativo alle regioni flessibili del sito attivo, e 𝑆𝑟𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎𝑖𝑛𝑡 indica la parte relativa agli eventuali vincoli (restraint) che possono essere
usati come bias al calcolo di docking, per esempio la restrizione di ancoraggio (tethering) assunta in questo studio per la porzione ciprofloxacina della struttura di ciascun ligando generato.
La componente intermolecolare è definita come 𝑆𝑖𝑛𝑡𝑒𝑟 = 𝑊𝑖𝑛𝑡𝑒𝑟 𝑣𝑑𝑤 ∙ 𝑆𝑖𝑛𝑡𝑒𝑟 𝑣𝑑𝑤 + 𝑊𝑖𝑛𝑡𝑒𝑟 𝑝𝑜𝑙𝑎𝑟 ∙ 𝑆𝑖𝑛𝑡𝑒𝑟 𝑝𝑜𝑙𝑎𝑟 + 𝑊𝑖𝑛𝑡𝑒𝑟 𝑟𝑒𝑝𝑢𝑙 ∙ 𝑆𝑖𝑛𝑡𝑒𝑟 𝑟𝑒𝑝𝑢𝑙 + 𝑊𝑟𝑜𝑡∙ 𝑁𝑟𝑜𝑡 (2)
e rappresenta lo score attribuibile a tutte le interazioni che il ligando compie con il recettore, Van der Waals (vdW), polari (pol) e repulsive (rep), ciascuna moltiplicata per il proprio peso W. L’ultimo è un termine entropico che descrive la penalizzazione associata al fatto che vengono bloccate le rotazioni interne al ligando quando legato al recettore ed è un valore proporzionale al numero di legami intorno ai quali possono verificarsi le rotazioni (𝑁𝑟𝑜𝑡).
Per stabilire poi quali fossero tra i vari photoswitch quelli in grado di legarsi con maggiore affinità alla DNA girasi, sono state condotte due analisi.
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Una prima analisi è quella interna a ciascuna conformazione del ligando che ha permesso di scegliere la posa migliore. Questa analisi generalmente viene condotta considerando lo score totale, il quale include la componente intramolecolare dovuta alla geometria adottata dal ligando nella tasca di legame (comprese interazioni polari, di van der Waals e rotazioni dei legami): in altre parole, il costo energetico che il ligando “paga” per assumere la determinata conformazione. Poiché però, questo valore non tiene conto dell’energia conformazionale degli anelli presenti nella struttura (ma solo quella di rotazioni intorno a legami), lo SCORE totale può essere usato solamente per confrontare pose aventi nella loro struttura una stessa conformazione degli anelli.
Una seconda analisi è stata poi condotta per confrontare l’affinità dei diversi ligandi in base alle migliori pose ottenute precedentemente, che sono state ordinate secondo il valore di Sinter per lo
spiropirano R (SPR), spiropirano S (SPS), merocianina (MC), azofloxacina Cis (AC) e azofloxacina Trans (AT). L’affinità di legame è quantificabile in base allo score, per cui tanto più questo è negativo tanto più l’affinità sarà maggiore.
I risultati di Sinter ottenuti per i tre sistemi considerati (ciprofloxacina, azofloxacina e spirofloxacina)
sono riportati in Tabella 5.2. Per i due sistemi contenenti il photoswitch sono riportati i valori relativi ai vari stati possibili: trans-cis per azofloxacina (AT-AC), e spiropirano-merocianina per spirofloxacina (SP-MC). Inoltre, per lo stato spiropirano sono riportati i valori di entrambe le forme enantiomeriche (SPR e SPS).
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Tabella 5.2, |𝑆𝐶𝑂𝑅𝐸 𝑖𝑛𝑡𝑒𝑟| (kJ/mol) delle migliori pose di docking ottenute per ogni
conformazione del ring piperazinico e per ogni ligando. Evidenziati in giallo gli SCOREinter delle migliori pose per ciascun ligando.
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Dalla Tabella 5.2, è possibile osservare per ciascuno stato dei photoswitch dei due sistemi presi in considerazione, la conformazione (in giallo) che lega la DNA girasi con maggiore affinità.
Per quanto riguarda il sistema spiropirano/merocianina, entrambi i valori di Sinter delle migliori pose
che gli enatiomeri della spirofloxacina possono assumere (SPR -35.7 kJ/mol e SPS -37.4 kJ/mol) sono inferiori a quello corrispondente alla migliore posa dello stato di merocianina (-41.0 kJ/mol). Poiché maggiore è Sinter maggiore è l’affinità di legame, secondo i risultati ottenuti l’affinità dello
stato di merocianina è maggiore rispetto ai due possibili stati di spiropirano, in accordo con le osservazioni sperimentali51. Un’importante considerazione che questa analisi ha permesso di ottenere, non riportata in letteratura, è come tra i due possibili stati di spiropirano la forma enantiomerica S potrebbe mostrare una maggiore affinità verso l’enzima.
Per il sistema azofloxacina, i valori di SCOREinter delle due migliori pose per gli isomeri Trans e Cis
sono rispettivamente -43.1 kJ/mol e -38.7 kJ/mol, indicando che lo stato Trans si lega con maggiore affinità alla DNA girasi, di nuovo in accordo con le osservazioni sperimentali51.
Considerando inoltre la disposizione spaziale dei residui legati all’anello piperazinico, in ogni sistema è possibile osservare che:
- Per il sistema spiropirano/merocianina, lo SPR adotta una conformazione boat con il gruppo ciprofloxacina in posizione equatoriale e il photoswitch disposto in posizione assiale. Lo SPS, invece, adotta una struttura chair con il gruppo ciprofloxacina rivolto in posizione equatoriale e il photoswitch in posizione assiale. La MC invece si lega tramite una conformazione chair con i gruppi ciprofloxacina e photoswitch rivolti entrambi in posizione assiale.
- Per il sistema azofloxacina, la forma Cis adotta una struttura con anello piperazinico in conformazione boat, e i gruppi ciprofloxacina e photoswitch rivolti in posizione equatoriale. La forma Trans, invece, si lega in conformazione boat con i due gruppi rivolti in posizione assiale.
Nella Tabella 5.3, sono riportati i valori dei diversi contributi che definiscono Sinter delle pose migliori
di ciascun sistema preso in considerazione.
In tale contesto è possibile notare alla variazione di quale contributo è associabile il passaggio da uno stato ad un altro nel sistema.
Tabella 5.3, Contributi a Sinter (in kJ/mol, eccetto Nrot) per le migliori pose di ciascun ligando.
Sinter.polar Sinter.repul Nrot Sinter.vdw SINTER
SPR B ea -2.4 0.1 7 -40.3 -35.7 SPS C ea -1.9 0.1 7 -43.6 -37.4 MC C aa -2.8 0.0 10 -46.8 -41.0 AC B ee -2.4 0.2 6 -43.2 -38.7 AT B aa -2.9 0.0 7 -45.7 -43.1
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Per il sistema spirofloxacina, i contributi che differenziano le migliori pose per i diversi stati sono il numero di torsioni, NROT (nelle due conformazioni dello spiropirano presenta valore pari a 7, mentre
nello stato di merocianina il valore aumenta a 10) e il contributo dovuto alle interazioni di Van Der Waals che, anche in questo caso aumenta nello stato di merocianina. Ciò che quindi maggiormente differenzia i due stati, è proprio l’instaurazione di queste interazioni con gli aminoacidi all’interno della tasca di legame, che aumentando nello stato di merocianina, sono responsabili di una maggiore stabilità di questa conformazione nel sito bersaglio e, conseguentemente una maggiore affinità di legame.
Analogamente al sistema considerato in precedenza, anche nel sistema azofloxacina i contributi che differenziano maggiormente le due migliori pose sono Nrot che diminuisce al passaggio dallo stato
Trans (dove è pari a 7) allo stato Cis (dove invece è pari a 6), e SVDW che diminuisce da un valore di –
45.7 kJ/mol nella forma Trans ad un valore di – 43.2 kJ/mol nella forma Cis. Dato che la forma più stabile è la forma Trans e siccome a tale conformazione sono associati i valori più alti in riferimento a tali contributi, è possibile affermare che ciò che in questo sistema è responsabile di una maggiore o minore affinità di legame alla tasca dell’enzima, è proprio il numero di interazioni vdW che all’interno di tale sito la struttura sarà in grado di instaurare con gli aminoacidi dell’ambiente proteico circostante. Infatti, dato che la differenza tra Cis e Trans è dovuta alla diversa orientazione del gruppo azobenzene, le interazioni di van der Waals che i due anelli aromatici nei due possibili stati stabiliranno con la DNA girasi saranno diverse sia nel numero che nel tipo di residui coinvolti. Possiamo concludere ricordando nuovamente le evidenze sperimentali relative ai due tipi di ciprofloxacina modificata (spirofloxacina e azofloxacina):
- Per irraggiamento con luce UV, la ciprofloxacina modificata con il gruppo spiropirano (spirofloxacina), tramite un processo di fotoisomerizzazione, subisce un cambiamento conformazionale da uno stato meno affine e conseguentemente a bassa attività antibatterica, ad un altro stato (detto merocianina), più affine e ad attività batterica maggiore.
- Per irraggiamento con luce UV, la ciprofloxacina modificata con il gruppo azobenzene (azofloxacina) subisce un processo di fotoisomerizzazione che porta ad un cambiamento conformazionale da uno stato Trans a elevata affinità per il recettore e conseguentemente elevata attività antibatterica, ad uno stato Cis a bassa affinità e bassa attività antibatterica.
I nostri risultati di docking mostrano una buona concordanza con le evidenze sperimentali per entrambi i composti, indicando un’affinità maggiore dello stato di merocianina per spirofloxacina e del conformero trans per azofloxacina.
5.4 Dinamica Molecolare
Per superare i limiti introdotti dalla rigidità del recettore usata nel docking, è stata condotta una Dinamica Molecolare su ciascuna delle migliori pose ottenute nell’analisi precedente. Con questa successiva analisi è stato quindi possibile avere una descrizione più accurata di:
- Stabilità di ciascun binding a conferma del fatto che il binding delle migliori pose selezionate tramite docking, fosse anche duraturo nel tempo perché talvolta il ligando, dopo un breve periodo di tempo adagiato nel sito di legame sul target, si allontana da questa tasca proteica non garantendo quindi un efficace meccanismo d’azione;
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- Modalità di legame, ovvero come il ligando si arrangia nel binding site quando a quest’ultimo è permesso di rilassare la sua geometria.
Queste informazioni, in particolare, possono essere ottenute dai grafici RMSD condotti sul complesso DNA girasi-DNA-ligando e su ciascun ligando singolarmente.
I grafici RMSD non sono altro che rappresentazioni dell’evoluzione della geometria del complesso nel tempo partendo da disposizioni spaziali degli atomi che sono state preventivamente sottoposte ad un processo di fitting (allineamento) rispetto ad un sistema di riferimento che, in questo studio, era la struttura “proteina-DNA-ligando” del dato cristallografico originale. Il fitting è stato necessario per evitare di ottenere risultati RMSD falsati da contributi derivanti da possibili rotazioni e traslazioni del sistema stesso. Il fitting non è stato invece applicato al singolo ligando, anch’esso rappresentato nei grafici, poiché avrebbe comportato cambiamenti solo a livello della geometria interna (non inficiante sul meccanismo di binding alla proteina).
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Figura 5.7, Deviazione quadratica media (RMSD) delle posizioni atomiche dei ligandi (in rosso) e il complesso proteina-DNA-ligando (in nero) lungo le dinamiche molecolari.
Il primo grafico in figura rappresenta l’evoluzione temporale della geometria del complesso