RISULTATI E DISCUSSIONE RISULTATI E DISCUSSIONE

4. RISULTATI E DISCUSSIONE

Mortalità

Nell’intero processo di raccolta, trasporto, stabulazione, trapianto e recupero, è stata registrata una mortalità di Unio pictorum molto bassa, equivalente ad un individuo in ogni sito, trascorso un mese nelle aree di studio.

Test di ritenzione del rosso neutro

Gli organismi recuperati dopo aver trascorso un mese nei siti di studio hanno fornito i risultati riportati in tabella 1 e raffigurati nel grafico sottostante; l’analisi della MANOVA ha rilevato l’effetto del sito (p<0.01) sull’integrità delle membrane lisosomali ad un mese dal trapianto nel Fiume Cecina.

Per quanto riguarda l’alterazione delle membrane lisosomali gli animali più compromessi risultano quelli trapiantati nel sito di Santa Marta,che rappresenta il principale collettore di inquinanti verso l’asta fluviale. Un valore intermedio è mostrato dai molluschi mantenuti presso l’abitato di Ponteginori, alcuni chilometri a valle della confluenza con il Botro S. Marta. Questo risultato è in accordo con le analisi chimiche dei sedimenti effettuate dall’ARPAT e dal CNR negli anni passati, dalle quali emerge una forte contaminazione da mercurio nei sedimenti del Botro (>5 mg/Kg), accompagnata da una compromissione delle comunità di macroinvertebrati, come risulta dai valori dell’ indice IBE (classe 5) caratteristico di un ambiente fortemente inquinato (ARPAT, 2005).

Gli organismi meno danneggiati risultano essere quelli recuperati nel sito, individuato come controllo, in località “Masso degli Specchi”, presso l’area protetta di Berignone. Dalle analisi di ritenzione del rosso neutro effettuate sul sottocampione analizzato tra gli esemplari provenienti dal Lago Maggiore, dalle vasche di stabulazione e dagli organismi recuperati dopo una settimana di trapianto nei tre siti del Fiume Cecina, non sono emersi risultati interpretabili. L’osservazione dei preparati al microscopio e la successiva possibilità di attribuire un eventuale danno a carico della membrana lisosomale era, infatti, ostacolata dalla repentina aggregazione degli emociti tra loro. Aggregati di questo tipo rendevano difficoltoso il conteggio delle singole cellule tanto da non poter concludere l’analisi secondo il protocollo utilizzato (Regoli, 2000 con alcune modifiche), che prevede

membrana lisosomale danneggiata, superi il numero di quelle che, non avendo subito compromissioni a carico dei lisosomi, appaiono bianche.

Sono state effettuate ulteriori modifiche, come la sostituzione di eparina con acqua minerale nella siringa di prelievo, dal momento che la causa dell’aggregazione cellulare era stata individuata proprio nell’inadeguatezza del protocollo che è stato modificato ed adattato per la specie Unio pictorum grazie alle prime esperienze di analisi; gli organismi recuperati ad un mese dal trapianto sono stati sottoposti al protocollo così perfezionato.

Sito Tempo di ritenzione del Rosso Neutro (minuti) Deviazione standard Controllo, Masso degli Specchi >120’ (a) 27,97 Santa Marta 39,20’ (c) 23,29 Ponteginori 88,00’ (b) 20,52

Tabella 1: tempo medio di ritenzione del rosso neutro e deviazione standard (n=10 organismi per sito) un mese dal trapianto, le lettere indicano le differenze significative tra le medie.

Figura 10: tempo medio di ritenzione del rosso neutro (NRRT) ad un mese dal trapianto,le lettere indicano le differenze significative tra le medie, p<0,01.

Test del micronucleo

La frequenza di micronuclei osservata nelle cellule branchiali dei dieci Unio pictorum provenienti direttamente dal Lago Maggiore è di 3,8‰ (range 0 - 4). Frequenze simili sono state riportate in studi di laboratorio effettuati su specie appartenenti alla stessa famiglia (Unionidae) nei gruppi di controllo (Scarpato et al., 1990); ed in altre specie di molluschi bivalvi d’acqua dolce, prelevati da siti naturali reputati non contaminati (Mersch et al., 1996). Inoltre, paragonando il dato con i risultati di indagini ambientali effettuate su popolazioni naturali di Mytilus gallopovincialis, il valore di 3,8‰ ricade nel range di variabilità stagionale dei siti di controllo (Bolognesi et al.; 2004).

L’osservazione al microscopio ottico dei preparati allestiti dai campioni d’organismi provenienti dalle vasche di stabulazione e dai tre siti di studio trascorsi sia una settimana che un mese dal trapianto ha evidenziato numerose alterazioni morfologiche della conformazione del nucleo la cui cromatina appariva grossolanamente frammentata (figura 11).

A

B C

D

Figura 11: cellule branchiali di Unio pictorum. A) 24 h dal prelievo presso il lago Maggiore; B),C),D) dopo la stabulazione e dopo il trapianto nei siti di studio (X 800).

Nei preparati relativi alle vasche di stabulazione il 65% delle cellule presentava un aspetto simile; ne è stata invece osservata una media pari all’82% nelle cellule branchiali appartenenti agli organismi provenienti dai tre siti di studio dopo i due recuperi successivi; gli organismi del Lago Maggiore non presentavano invece nessuna cellula con un simile aspetto.

Sono state condotte ulteriori indagini sulle stesse cellule branchiali per meglio interpretare le morfologie nucleari precedentente descritte per verificare se potessero trattarsi di cellule apoptotiche.

Mediante indagini con il microscopio elettronico a trasmissione (TEM) e il diffusion-assay è stato possibile descrivere tali manifestazioni proprio come eventi apoptotici.

La maggior parte delle cellule branchiali sottoposte al test di diffusione, è stata classificata come apoptotica ed anche le osservazioni al microscopio elettronico hanno confermato tale aspetto, caratterizzato da frammentazione nucleare, fenomeni di blebbing, e cromatina condensata al perimetro della membrana nucleare (figura 12).

L’elevata frequenza di cellule con tale morfologia nei preparati ha ostacolato la valutazione della frequenza di cellule micronucleate negli organismi traslocati nelle stazioni oggetto dell’indagine.

La comparsa di cellule apoptotiche potrebbe essere attribuita a condizioni di stress generali accusate nel trasporto o nelle diverse fasi del processo di trapianto (manipolazione, allestimento degli organismi nelle gabbie, etc.), ulteriore stress tale da indurre il processo apoptotico potrebbe essere individuato nella scarsità di cibo e/o di ossigeno durante il periodo di stabulazione in vasca. È noto infatti che tanto

l’affamamento, quanto le condizioni di ipossia, documentate negli organismi bivalvi, (Moore et al., 2007) possano indurre processi di morte cellulare programmata.

Nel nostro caso, sebbene nel mezzo naturale, a seguito del trapianto, si sia probabilmente ripristinata una favorevole condizione di disponibilità alimentare; processi di chiusura delle valve come reazione ad una situazione di stress (Jing et al., 2006), potrebbero aver mantenuto gli organismi trapiantati in condizione di ipossia tali da innescare o mantenere attivi i processi apoptotici. Nei siti di Ponteginori ed a livello del Botro Santa Marta il fattore di disturbo potrebbe essere rappresentato proprio da una condizione abientale altamente (Santa Marta) o mediamente (Ponteginori) compromessa (indice IBE, dati ARPAT). Nel caso invece del sito di controllo, individuato a monte delle principali fonti di immissioni di contaminanti, all’interno dell’area protetta di Berignone, le cause ipotizzate precedentemente per spiegare l’insorgenza di apoptosi nell’ambiente contaminato, non chiariscono l’assenza del ripristino di una normale fisiologia cellulare.

Figura 12: Osservazione di cellule branchiali apoptotiche di U. pictorum al TEM

Comet assay

I valori risultati dal Comet Assay sono riassunti in tabella 2 e visualizzati nel grafico sottostante.

Tabella 2: percentule media di DNA migrato in cellule branchiali di Unio pictorum provenienti da ognuno dei diversi siti di prelievo e trapianto.

Sito _{_} %DNA migrato (x ± d.s.)

Lago Maggiore 19,49 ± 5,55 Vasche di stabulazione 23,42 ± 5,85

1° settimana dal trapianto

Controllo,

Masso degli Specchi 28,29 ± 8,78 Santa Marta 26,13 ± 6,51 Ponteginori 29,14 ± 10,68

30 giorni dal trapianto

Controllo,

Masso degli Specchi 30,31 ± 10,78 Santa Marta 26,99 ± 8,28 Ponteginori 31,12 ± 10,89

Figura 13: cellule branchiali di U. pictorum, percentuale di DNA migrato nei tre siti di studio ad un mese dal trapianto.

Per questo particolare test, basato sull’integrità del DNA, l’analisi della MANOVA non ha rilevato né effetti del sito né effetti del tempo di campionamento.

non in maniera statisticamente significativa; non esistono invece distinzioni per quanto riguarda l’eventuale compromissione del DNA, tra il sito di controllo posto in un’area protetta e quello di Santa Marta, classificato, come risulta dai valori dell’ indice IBE, un ambiente fortemente inquinato (ARPAT, 2005).

Per quanto riguarda la somiglianza inattesa tra il livello di danno al DNA del sito di Santa Marta, e del sito di controllo, tale risultato deve probabilmente essere interpretato alla luce all’elevata frequenza di cellule apoptotiche precedentemente discussa. A causa, infatti, del basso peso molecolare del DNA nelle cellule apoptotiche, gran parte del materiale genetico, finemente frammentato, viene perso nella corsa elettroforetica eseguita nelle condizioni adottate (Vasquez & Tice, 1997). In conseguenza di questo, i dati del Comet assay potrebbero fornire una sottostima del danno genetico eventualmente presente nelle stazioni indagate. Dal momento che gli eventi apoptotici non sembrano caratterizzare gli organismi provenienti direttamente dal Lago Maggiore, possiamo paragonare i valori ottenuti per questa stazione con quelli presenti in letteratura per definire la condizione iniziale degli organismi utilizzati per il trapianto. Il parametro più ricorrente nelle pubblicazioni disponibili per i bivalvi dulciacquicoli per stimare il danno di genotossicità attraverso il Test della cometa, non è, come riportato nella tabella 2, la percentuale di DNA migrato nella coda, ma il tail moment (prodotto tra %DNA coda e la lunghezza coda/100). Al fine di comparare i nostri risultati con quelli della letteratura è stato calcolato questo parametro per i dieci organismi provenienti direttamente dal Lago Maggiore, ed è stato ottenuto il valore medio di 1,24 (±0,58). Tale risultato è in linea con i valori dei controlli di esperienze scientifiche che utilizzano organismi del genere Unio nei test di genotossicità in vivo ed in vitro (Łabieniec, Gabryelak, 2006; K. Milowskaa , et al., 2003).

Inizialmente non era stato preferito, come misura per il test della cometa, il tail moment. Tale parametro, infatti, è influenzato dalla lunghezza e variabili sperimentali come le diverse componenti di corsa elettroforetica, a parità di percentuale di DNA migrato nelle “code”, possono fra stimare erroneamente il danno genetico incidendo proprio sulla lunghezza. (McKelvey-Martin et al., 1993).

Attività delle difese antiossidanti

I risultati delle diverse risposte antiossidanti osservate negli epatopancreas di U.pictorum delle vasche di stabulazione e dei diversi siti ad un mese dal trapianto nel fiume, sono

esposti nella tabella 3 e nella figura sottostante. Là dove le varianze sono risultate omogenee (test di Levene) è stata effettuata un’analisi parametrica (ANOVA) e il test di Newman-Keuls per evidenziare differenze significative tra le medie. Poiché solo i dati relativi all’attività della catalasi sono risultati distribuiti in modo normale, è stato anche applicato un test non parametrico (Kruskall-Wallis); i valori di sigificatività risultati dai diversi test sono riportati in tabella 3.

Tabella 3 :Tabella riassuntiva dell'attività enzimatica analizzta nei campioni di epatopancreas di U.pictorum

Unità di misura ± d.s. Newman-Keuls Kruskal-Wallis

Catalasi µmol/min/mgprt ± d.s. p<0.05 p<0,001 Vasche di stabulazione 89,82±28 a a Controllo, Masso degli Specchi 136,52±22,9 a b Ponteginori 173,41±58,8 b c Santa Marta 87,75±40 a a Reduttasi nmol/min/mgprt ± d.s. p<0,001 Vasche di stabulazione 10,29±3,5 - _a Controllo, Masso degli Specchi 13,29±1,3 - b Ponteginori 13,55±2,5 - b Santa Marta 10,46±3,5 - a Perossidasi H2O2 nmol/min/mgprt ± d.s. p<0,001 Vasche di stabulazione 17,40±6 - a Controllo, Masso degli Specchi 19,70±4,6 - a Ponteginori 24,66±7,5 - b Santa Marta 21,23±6,4 - ab

Perossidasi CUPX nmol/min/mgprt ± d.s. p<0,001

Vasche di stabulazione 26,67±4,3 - a Controllo, Masso degli Specchi 29,23±2,8 - a Ponteginori 35,72±5,3 - b Santa Marta 28,81±9,6 - a Glutatione S- Transferasi nmol/min/mgprt ± d.s. p<0,002 Vasche di stabulazione 676,98±186,8 - a Controllo, Masso degli Specchi 633,67±80,5 - a Ponteginori 656,47±138 - b Santa Marta 590,55±109 - b

Glutatione Totale µmol/g ± d.s. p<0,001

Vasche di stabulazione 0,119±0,06 - b Controllo, Masso degli Specchi 0,095±0,07 - b Ponteginori 0,083±0,02 - b Santa Marta 0,050±0,03 - a

A B C Catalasi (!mol/min/mgprt) 0 50 100 150 200 250

Vasca Controllo Masso degli

Specchi Ponteginori Santa Marta

a

b

c

a p<0.001

Transferasi (nmol/min/mgprt) 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000

Vasca Controllo Masso degli

Specchi Ponteginori Santa Marta

p<0,002

a a

b

b

Figura 14: Risposte antiossidanti osservate negli epatopancreas di U.pictorum nei diversi siti ad un mese dal trapianto. Le lettre indicano differenze significative tra siti. I grafici si riferiacono ai risultati ottenuti con il test di Kruskal-Wallis. A) Catalasi B) Reduttasi, C) Perossidasi Cu, D) Perossidasi H2O2, E) Transferasi, F) Glutatione totale.

E

F D

I dati emersi dall’analisi delle risposte antiossidanti sembrano confermare la condizione di stress evidenziata dai test di genotossicità già nella fase di stabulazione, come dimostra la similitudine delle risposte degli individui delle vasche rispetto agli organismi traslocati nel sito contaminato di Santa Marta. Tuttavia, in questa stazione si osserva una marcata diminuzione dei livelli di glutatione nella ghiandola digestiva, il che suggerisce l’instaurarsi di una condizione di stress ossidativo, verosimilmente legata alla pesante contaminazione chimica documentata per i sedimenti (ARPAT 2005).

Nel caso delle perossidasi, della reduttasi e della catalasi, si osserva una maggiore, seppur leggera, induzione negli organismi recuperati nel sito di Ponteginori. Tale induzione può essere interpretata come risposta dei bivalvi allo stress ambientale che caratterizza questa stazione (sito Progetto Bacino Pilota). Per quanto riguarda l’assenza di particolari induzioni enzimatiche negli organismi recuperati nel sito di Santa Marta, è possibile che i singoli enzimi subiscano un’ azione inibitoria legata alla presenza di elevate concentrazioni ambientali di metalli. Situazioni simili sono state riportate in letteratura, soprattutto per il mitilo (Regoli et al., 1998).

L’ulteriore difficoltà per la discussione delle risposte antiossidanti in Unio pictorum è data anche dalla difficile comparazione con i dati rintracciabili in letteratura.

I valori ottenuti dall’analisi dei sistemi antiossidanti riportati per altri organismi modello, come gli appartenenti al genere Mytilus, per i quali, nella stessa stagione è stato analizzato lo stesso tessuto, sono diversi e difficilmente paragonabili con quelli ottenuti nel presente studio; sia che provengano da siti contaminati che non contaminati. In Unio

pictorum, in particolare, si osservano valori evidentemente più alti per alcuni enzimi quali:

la catalasi, le perossidasi, la transferasi; mentre rispetto al bivalve marino osserviamo concentrazioni più basse di glutatione totale e dell’attività della reduttasi. (Regoli et al.,

1998; Regoli, 1998).

Studi sullo stesso genere di molluschi dulciacquicoli rivelano, in generale, risultati diversi nell’analisi dei vari enzimi antiossidanti, mentre paragonabili sono i valori registrati per la attività delle perossidasi, che si avvicinano in media ai dati rilevati negli animali provenienti da siti altamente contaminati (Cossu et al.,1997; Cossu et al.,1998).

Vasseur & Leguille (2004) analizzando le attività delle difese antiossidanti in organismi del genere Unio traslocati da un sito di controllo in tre fiumi francesi inquinati, rivelarano in uno solo dei tre un decremento significativo dell’attività degli enzimi indagati, sottolineando la difficoltà di misurare un parametro ambientale, quale la contaminazione, attraverso un limitato numero di risposte biologiche (Mydlarzn, 2006), e soprattutto attraverso singoli

componenti del sistema antiossidante che difficilmente variano in modo sincrono (Regoli et al., 1998). Per ovviare a questo problema sono stati sviluppati metodi che valutano l’efficacia totale del complesso sistema antiossidante, quantificando la capacità totale di neutralizzare specifici ROS e fornendo un indice integrato di resistenza (o suscettibilità) allo stress ossidativo più facilmente interpretabile .

A questo proposito sono stati sviluppati alcuni metodi d’analisi, tra questi la tecnica nota come Total Oxyradical Scavenging Capacity Assay (TOSC-A), utilizzata anche nel presente studio, i cui risultati sono esposti nel paragrafo successivo.

TOSC-Assay

Per quanto riguarda l’analisi del TOSC-A sono stati registrati i valori riassunti nella tabella 4 e nei grafici sottostanti; per il radicale perossilico non si registrano differenze statisticamente significative nei diversi siti di studio. Per il radicale idrossilico i siti d’analisi sono invece significativamente discriminati (p<0,05). In particolare si registrano valori più alti nei siti di Ponteginori e Masso degli Specchi, e significativamente più bassi nel sito di Santa Marta e negli organismi prelevati dalle vasche di stabulzione.

Tabella 4 : Valori ricavati dal TOSC-A eseguito su epatopancreas di Unio.

Abap ROO• UTOSC/mgprt Deviazione standard

Vasche di stabulazione 343,2 63,3

Controllo, Masso degli

Specchi 320,52 30,65

Ponteginori 370,42 34,69

Santa Marta 334,23 63,72

Fenton •OH UTOSC/mgprt Deviazione standard

Vasca(a) 619,36 41,01

Controllo, Masso degli

Specchi (b) 829,52 103,64

Ponteginori (b) 930,66 115,99

Figura 15: capacità antiossidante totale (espressi in unità TOSC/mg di proteine) nei confronti del radicale perossilico (A) e idrossilico (B), negli epatopancreas di U.pictorum recuperati dopo un mese dal trapianto nelle località di studio. Le lettere indicano differenze significative ta siti (p< 0,05).

La bassa resistenza del sistema antiossidante nei confronti dell’ultimo radicale, registrata nelle vasche, potrebbe essere correlata all’alterazione della normale fisiologia cellulare evidenziata dall’alto tasso di cellule apoptotiche registrato nei preparati dei test di genotossicità.

I valori maggiori registrati invece nel sito di controllo e in quello di Ponteginori potrebbero essere connessi ad una fase di recupero avvenuta nel mese di trapianto; recupero che non è avvenuto negli organismi posizionati all’altezza del Botro Santa Marta a causa della propria condizione di ambiente fortemente inquinato (indice IBE, ARPAT). La sigificativa discriminazione per la località di Ponteginori, per quanto riguarda il radicale ossidrilico, è verosimilmente correlata alla più elevata risposta, nello stesso sito, registrata per l’enzima catalasi, che essendo responsable della rimozione dell’acqua ossigenata, previene la formazione di tale radicale.

Paragonando i dati con quelli in letteratura relative ad analisi effettuate su ghiandole digestive del genere Mytilus (Regoli, 2000) provenienti da siti di controllo, si osservano, per U.pictorum, valori molto più bassi nel caso del radicale perossilico, mentre valori molto

A

più alti nel caso del radicale idrossilico.

I valori registrati in U.pictorum nelle analisi con il radicale perossilico sono inferiori anche a quelli registrati con i mitili nei siti classificati come contaminati.

Bioaccumulo

I valori risultanti dalle analisi di assorbimento atomico per i vari elementi analizzati, sono riportati nella tabella 5 e rappresentati nella figura sottostante, i dati sono stati analizzati tramite il test non parametrico di Kruskall-Wallis.

Tabella 5 :Tabella 5 :Bioaccumulo nella ghiandola digestiva di U. pictorum. Valori relativi ad un mese dal trapaianto ei tre siti, e dopo 13 giorni di vasche di stabulazione (µg/g).

Siti Cd Cr Hg Cu Mn Fe Zn As Pb Ni

Media dev.st Media dev.st media Dev.st media dev.st Media dev.st Media Dev.st media dev.st media dev.st media dev.st Media Dev.st

Vasche di stabulazione 2,29 0,90 1,17 0,10 0,0737 0,0128 14,7 5,2 1322 1110 1633 294 178,0 86,0 5,9 4,1 3,34 2,23 3,34 1,63 Ponteginori 4,97 1,22 2,15 0,60 0,2063 0,1340 17,9 4,8 1338 1050 2362 808 184,2 84,6 5,9 1,9 5,63 3,14 5,64 2,81 Santa Marta 2,68 0,97 1,51 0,56 0,0976 0,0742 12,8 3,8 1139 316 1808 307 152,1 30,2 5,4 2,6 3,62 0,79 3,73 1,32 Controllo, Masso degli Specchi 3,53 1,19 2,50 0,88 0,0930 0,0541 15,4 5,4 1992 1663 2725 1030 - - 5,6 2,7 5,45 1,85 6,14 0,87 Cr 0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 3,00 3,50 4,00

Vasca Ponteginori Santa Marta Controllo

p<0,001

*

*

p<0,003

Figura 16: accumulo dei diversi elementi nell'epatopancreas di U. pictorum ad un mese dal trapainto nei diversi siti di studio. Quando presenti le stelline indicano differenze significative tra siti.

Per alcuni metalli come il Manganese, il Ferro e l’Arsenico non si registrano differenze tra gli organismi trapiantati e gli organismi provenienti dal Lago Maggiore analizzati dopo il periodo di stabulazione, nonostante, nel caso particolare dell’arsenico, questo elemento caratterizzi il corso del fiume (sito internet Progetto Bacino Pilota), probabilmente non in forme biodisponibili.

La stazione di Ponteginori sembra essere quella più interessata dalla disponibilità di metalli; per quanto riguarda il Cadmio, il Cromo, il Rame, il Nichel, il Piombo ed il Mercurio,

* * * * Hg 0,0000 0,0500 0,1000 0,1500 0,2000 0,2500 0,3000 0,3500 0,4000

Vasca Ponteginori Santa Marta Controllo p<0,005 * Cu 0,0 5,0 10,0 15,0 20,0 25,0

Vasca Santa Marta Controllo

p<0,001 *

vi si registano le maggiori concentrazioni. Valori statisticamente altrettanto alti di Cadmio, Cromo, Nichel e Piombo, si registrano anche nell’area indivduata come controllo e posta a monte delle maggiori sorgenti di contaminazione. La presenza di alcuni metalli (Cr,Ni), in questa zona può essere attribuita ad un’origine naturale a causa della presenza di conformazioni geologiche congrue alla loro presenza che caratterizzano tutto il bacino. Non si registrano invece concentazioni tali da discriminare statisticamente il sito individuato a livello del Botro Santa Marta; è possibile che, nonostante la documetata (ARPAT e CNR) concentrazione di metalli in questo tratto del fiume (ad esempio per il mercurio si registrano valori >5 mg/Kg), adattamenti comportamentali, quali la chiusura delle valve, come risposta ad un ambiente altamente contaminato (Jing et al., 2006) abbiano portato ad una minore attività di filtrazione e dunque ad un minor bioaccumulo degli elementi indagati.

Concentrazioni particolrmente elevate (circa due ordini di grandezza rispetto al mitilo,

Regoli et al., 1998) di manganese sono state rilevate in tutti gli organimi analizzati.

Questo risultato potrebbe essere connesso più che allla disponibilità ambientale di Mn, ad una particolare attitudine di Unio ad accumulare selettivamente questo elemento (Ravera

et al., 2003). Come avviene per altri bivalvi, il manganese viene verosimilemente incluso in

concrezioni renali, organo che nel presente caso non è stato separato dalla ghiandola digestiva comportando così una difficile valutazione della disponibilita di Mn ambientale. I risultati ottenuti possono inoltre essere ulteriormente discussi attraverso il paragone con i dati disponibili in letteratura. Analisi condotte su due specie di Unionidae, registrano un accumulo di Cd, Pb, Cu, Zn, in zone con forte antropizzazione (Gundacker, 2000), simili, nel caso del rame e dello zinco, ai valori rilevati negli organismi sottoposti al trapianto nel Cecina. Per quanto riguarda i dati relativi a cadmio e piombo, gli organismi recuperati dai tre siti del fiume, hanno valori di un ordine di grandezza maggiori. Tuttavia, sembrerebbe emergere che i diversi tessuti degli unionidi non riflettano chiaramente le concentrazioni mosurate nelle matrici ambientli (Gundacker, 2000).

In utima analisi merita paticolare attenzione il risultato ottenuto per il bioaccumulo del mercurio per il quale, come già sottolineato, livelli significativamente maggiori sono registrati per il sito di Ponteginori. Dati del laboratorio di Morfologia Umana e Biologia