6.1 Indagine sierologica
I risultati delle indagini sierologiche sono presentati nella tabella 6.1
L’esame sierologico è stato eseguito su 30 campioni di siero: 16 prelevati nella stagione venatoria 2014/2015 e 14 nella stagione venatoria 2017/2018. Cinque campioni (soggetti #10, 11, 23, 26 e 27) non sono stati utilizzati perché si presentavano eccessivamente emolitici. I dati relativi ai soggetti positivi vengono riassunti nella tabella 6.2. Dei trenta campioni, 7 (23%) appartenevano a soggetti giovani e 23 (77%) ad adulti. Per quanto riguarda il sesso 13 (43%) erano di soggetti maschi e 17 (57%) di femmine. Quattordici campioni sono risultati positivi (47%) e sedici negativi (53%). Tra i 14 campioni positivi 2 (14%) appartenevano a soggetti giovani e 12 (86%) ad adulti. In base al sesso 4 (28%) erano di soggetti maschi e 10 (72%) di femmine.
Dei 16 campioni prelevati nel 2014/2015, 5 (31%) appartenevano a soggetti giovani e 11 (69%) ad adulti; 5 (31%) a soggetti maschi e 11 (69%) a femmine.
Undici campioni sono risultati positivi (69%). Tra gli undici campioni positivi 2 (18%) erano giovani e 9 (82%) adulti; 2 (18%) erano maschi e 9 (82%) femmine.
Dei 14 campioni prelevati nel 2017/2018, 2 (14%) appartenevano a soggetti giovani e 12 (86%) ad adulti; 8 (57%) a soggetti maschi e 6 (43%) a femmine. Tre campioni sono risultati positivi (21%) e undici negativi (79%). Tra i 3 campioni positivi 3 erano adulti; 2 maschi e 1 femmina.
In sintesi la siero-prevalenza complessiva è risultata del 47%, mentre nel 2014/2015 e 2017/2018 è risultata del 69% e del 21% rispettivamente, con una differenza statisticamente significativa (P < 0,02).
51 Soggetti Data prelievo Classe di età Sesso Sierologia PCR
1 22/09/14 G F - + 2 22/09/14 A F + - 3 22/09/14 G M + - 4 22/10/14 G M - - 5 25/10/14 A M + + 6 25/10/14 A F + - 7 25/10/14 A F + - 8 25/10/14 G F + - 9 25/10/14 A F + - 10 25/10/14 G M n.e. - 11 08/11/14 A M n.e. - 12 08/11/14 A F + - 13 08/11/14 A F - - 14 08/11/14 G M - - 15 08/11/14 A F + - 16 10/12/14 A M - + 17 10/12/14 A F + + 18 10/12/14 A F + - 19 14/10/17 A F + - 20 14/10/17 A M - - 21 14/10/17 A F - - 22 11/11/17 G F - - 23 11/11/17 G F n.e. - 24 11/11/17 A F - - 25 29/11/17 A M + - 26 29/11/17 A F n.e. - 27 29/11/17 A M n.e. - 28 09/12/17 A M - - 29 09/12/17 A F - - 30 09/12/17 A M - - 31 13/12/17 A M - - 32 13/12/17 A M - - 33 29/12/17 A F - - 34 29/12/17 A M + - 35 29/12/17 G M - -
Tabella 6.1 Riepilogo dei risultati sierologici e molecolari dei soggetti campionati in località Cenaia (PI). A: adulto; G: giovane; F: femmina; M: maschio; n.e.: non eseguito.
52
Soggetti Elisa HEV-positivi/esaminati
2014-2015 2017-2018
Maschi Femmine Totale Maschi Femmine Totale Giovani (n=7) 1/3 1/2 2/5 0/1 0/1 0/2 Adulti (n=23) 1/2 8/9 9/11 2/7 1/5 3/12 Totale (n=30) 2/5 9/11 11/16 2/8 1/6 3/14
Tabella 6.2 Risultati delle indagini sierologiche condotte su campioni di siero prelevati da 30 dei 35 soggetti in studio.
53
6.2 Indagine molecolare
Nested – PCR su campioni di fegato o feci
I risultati delle indagini molecolari sono presentati nella tabella 6.1.
Dei 35 campioni analizzati tramite Nested-PCR di screening, 18 raccolti nella stagione venatoria 2014/2015 e 17 in quella 2017/2018, 4 sono risultati positivi. I campioni positivi, prelevati nel 2014/2015, appartengono ad una femmina giovane (soggetto # 1), a due maschi adulti (soggetti # 5 e 16) e ad una femmina adulta (soggetto # 17). I campioni di intestino, linfonodi, milza e siero dei soggetti identificati positivi sono risultati negativi all’ulteriore indagine molecolare. Tutti i campioni prelevati nella stagione venatoria 2016/2017 sono risultati negativi alla Nested-PCR. In tabella 6.3 sono riassunti i dati relativi ai soggetti positivi.
Soggetti PCR HEV-positivi/esaminati
2014-2015 2017-2018
Maschi Femmine Totale Maschi Femmine Totale Giovani (n=9) 0/4 1/2 1/6 0/1 0/2 1/3 Adulti (n=26) 2/3 1/9 3/12 0/8 0/6 0/14 Totale (n=35) 2/7 2/11 4/18 0/9 0/8 0/17
Tabella 6.3. Risultati delle indagini molecolari condotte su campioni di feci e fegato prelevate dai 35 conigli campionati.
Analisi di sequenza
L’analisi filogenetica ha permesso di identificare le 4 sequenze ottenute come appartenenti al genotipo 3. In particolare le sequenze 1 RB IT 2014 e 5 RB IT 2014, isolate rispettivamente dai conigli # 1 e 5, hanno mostrato omologia con stipiti identificati in cinghiali nel 2012 nello stesso areale geografico mentre quelle 16 RB IT 2014 e 17 RB IT 2014, isolate dai conigli # 16 e 17, hanno mostrato omologia con stipiti di coniglio appartenenti al clade/sottotipo 3ra. (figura 6.1)
54 Figura 6.1 Analisi filogenetica mediante il metodo Neighbor-Joining.
L’analisi, condotta utilizzando il metodo Neighbor-Joining (500 bootstrap), è stata effettuata su 39 sequenze costituite da 234bp. Le analisi evolutive sono state eseguite utilizzando il software MEGA7. Le sequenze sottolineate in rosso corrispondono a ceppi umani di rHEV isolati nel 2015 in Francia (Abravanel et al., 2017)). La sequenza sottolineata in blu appartiene ad un ulteriore caso di infezione nell’uomo da rHEV (Izopet et al., 2012). Le sequenze all’interno dei box rossi appartengono ai conigli HEV positivi identificati in questo studio. RB: coniglio; HU: uomo; SW: suino; WB: cinghiale; CH: Cina; USA: Stati Uniti; IT: Italia; FR: Francia; RU: Russia; DE: Germania; ML: Olanda; DK: Danimarca; GB: Regno Unito; ES: Spagna; NL: Olanda.
55
6.3 Indagini istologiche e di immunoistochimica
L’esame necroscopico non ha evidenziato alterazioni macroscopiche a carico degli organi sia nei soggetti positivi sia in quelli negativi per HEV. I soggetti negativi non hanno mostrato infiltrati infiammatori significativi negli spazi portali, alterazioni a carico della morfologia e dell’architettura degli epatociti e lesioni riconducibili ad altri patogeni (Fig. 6.2 A e D). Le aree periduttali e peri-centrolobulari degli epatociti sono risultate negative alla ricerca dell’antigene virale (Fig. 6.2 G). All’indagine istopatologica i conigli positivi hanno presentato quadri patologici diversi sulla base del ceppo infettante. Nei soggetti infetti con ceppi di HEV-3 risultati geneticamente correlati con i ceppi di cinghiale (conigli # 1 e 5) le lesioni, di gravità inferiore, risultavano localizzate prevalentemente negli spazi portali (Fig. 6.2 B). Queste erano caratterizzate dalla presenza di infiltrati di mononucleati (Fig. 6.2 E) e da fibrosi periportale, con vacuolizzazione e necrosi degli epatociti in queste aree. L’indagine immunoistochimica ha dimostrato la presenza dell’antigene virale nell’epitelio dei dotti biliari e negli epatociti in queste aree (Fig. 6.2 H). Nei conigli infetti con i ceppi di rHEV (conigli # 16 e 17), le lesioni risultavano essere di maggiore gravità ed erano prevalentemente localizzate nelle aree peri-centrolobulari (Fig. 6.2 C). In queste aree si osservano fenomeni degenerativo/necrotici a carico degli epatociti, megalocitosi, epatociti binucleati e la presenza di infiltrazione da parte di mononucleati (Fig. 6.2 F). In queste aree il citoplasma degli epatociti risultava positivo per la presenza dell’antigene virale (Fig. 6.2 I).
Sia negli spazi portali (Fig. 6.3 A) che nelle aree peri-centrolobulari (Fig. 6.3 B), la presenza dell’antigene virale risultava essere associata ad infiltrazione da parte di linfociti T CD3+ (Figg. 6.3 C e D). In queste aree la presenza di linfociti B CD79a+ risultava essere invece ridotta (Figg. 6.3 E e F), mentre erano presenti alcune cellule macrofagiche (Figg. 6.3 G e H).
I risultati dei test sierologici, molecolari e istopatologici sono sintetizzati nella tabella 6.4.
56 Figura 6.2 Fegato di un soggetto di controllo senza alterazioni patologiche evidenti (A, D, G) e lesioni istologiche in soggetti HEV positivi, infetti con ceppi HEV-3 (B, E, H) e rHEV (C, F, I). A) Coniglio #4. Assenza di alterazioni significative a carico del parenchima epatico (E-E, Ob 20x); B) Coniglio #1. Colangite e presenza di infiltrato flogistico (freccia) nello spazio portale (E-E, Ob. 20x); C) Coniglio #16. Fenomeni degenerativo/necrotici a carico degli epatociti con distribuzione peri-centrolobulare (freccia) e fibrosi portale (E-E, Ob. 20x); D) Coniglio #4. Anche a maggiore ingrandimento non si osservano modificazioni significative a carico degli epatociti (E-E, Ob. 40x); E) Coniglio #1. Forte ingrandimento della figura B, infiltrato di mononucleati presente nello spazio portale (E-E, Ob. 40x); F) Coniglio #16. Fenomeni regressivi a carico degli epatociti con megalocitosi (frecce) e necrosi epatocellulare (E-E, Ob. 40x); G) Coniglio #4. Negativa la ricerca dell’antigene virale negli epatociti (anticorpo primario anti-HEV, IHC, Ob. 20x); H) Coniglio #1. Presenza dell’antigene virale nelle cellule dei dotti biliari (freccia) in corrispondenza degli infiltrati infiammatori (anticorpo primario anti-HEV, IHC, Ob. 40x); I) Coniglio #16. Antigene virale presente nel citoplasma degli epatociti con distribuzione peri-centrolobulare (freccia) nelle aree interessate dai fenomeni degenerativo/necrotici (anticorpo primario anti-HEV, IHC, Ob. 20x).
57 Figura 6.3 Immunolocalizzazione cellulare nelle aree periduttali in soggetti infetti da HEV-3 (A, C, E, G) e nel parenchima epatico di soggetti rHEV positivi (B, D, F, H).
A e B. Immunolocalizzazione dell’antigene virale nel soggetto #1 (A, freccia) e #16 (B, freccia) (anticorpo primario anti-HEV, IHC, Ob. 40x). C e D. Presenza di linfociti T CD3+ negli infiltrati infiammatori rilevati nei soggetti #1 (C, frecce) e #16 (D, freccia) (anticorpo primario anti-CD3, IHC, Ob. 40x). E e F. Rari linfociti B CD79a+ presenti negli infiltrati rilevati nei soggetti # 1 (E) e #16 (F) (anticorpo primario anti-CD79a, IHC, Ob. 40x). G e H. Presenza di cellule macrofagiche MAC387+ presenti negli infiltrati rilevati nei soggetti # 1 (G, freccia) e #16 (H, frecce) (anticorpo primario anti-MAC387, IHC, Ob. 40x).
58 Soggetti Ceppi Elisa Nested
PCR
Principali lesioni istologiche IHC T B Ø 1 1 RB IT 2014 - + Colangite linfocitica, fibrosi
portale, necrosi degli epatociti
++ - + 5 5 RB IT 2014 + + Colangite linfocitica, fibrosi
portale, necrosi degli epatociti
++ - + 16 16 RB IT 2014 - + Fibrosi portale, macrocitosi,
epatociti binucleati, necrosi epatocellulare
++ - +
17 17 RB IT 2014 + + Fibrosi portale, macrocitosi, epatociti binucleati, necrosi epatocellulare
++ - +
Tabella 6.4 Risultati dei test sierologici, di biologia molecolare, dell’istologia e dell’immunoistochimica.
59