Per lo studio biologico dei nuovi ligandi irreversibili 7 8 e 18 ci siamo avvalsi della tecnica di binding all’equilibrio, seguita da studi sulla potenziale irreversibilità di questi ligandi al recettore.
La tecnica di binding all’equilibrio, eseguita su membrane di rene di ratto, si basa sulla competizione dei ligandi in esame nei confronti del [3H] Ro 5-4864.
32 Di seguito sono riportate le curve di spiazzamento del [3H] Ro 5-4864 da parte dei composti in esame (Fig. 14, 15 e 16).
Fig. 14 Grafico di spiazzamento del [3H] Ro 5-4864 da parte del composto 7 in
membrane mitocondriali di rene di ratto.
Fig. 15 Grafico di spiazzamento del [3H] Ro 5-4864 da parte del composto 8 in membrane mitocondriali di rene di ratto.
33 Fig. 16 Grafico di spiazzamento del [3H] Ro 5-4864 da parte del composto 18 in
membrane mitocondriali di rene di ratto.
I dati relativi al binding all’equilibrio dei composti 7,8 e 18 mostrano valori di affinità nel range del nanomolare, comparabili quindi ai valori dello standard Ro 5-4864 (Ki da 37.6 nM a 49.5 nM). (Tab. 3)
Tab. 3 Valori di IC50 e Ki dei composti 7,8 e 18 ottenuti dai saggi di binding all’equilibrio attraverso l’equazione di Cheng-Prusoff.
34 Per esaminare la potenziale irreversibilità del legame dei composti 7,8 e 18 sul TSPO è stato eseguito un binding in cinetica con particolari accorgimenti. I campioni sono stati diluiti 1:10 con tampone freddo al termine della loro incubazione con il radioligando e si è osservato che i dati ottenuti dopo tali diluizione non erano differenti da quelli ottenuti nei campioni non diluiti. Ciò indicava che l’interazione TSPO-ligando era irreversibile e questo escludeva immediatamente la possibilità di applicare l’equazione di Cheng-Prusoff nell’analisi dei parametri di binding , perchè valida solo nel caso di ligandi reversibili.
I risultati ottenuti hanno dimostrato che, pretrattando le membrane mitocondriali con i nuovi ligandi per il TSPO, questi erano in grado di inibire il legame del [3H] Ro 5-4864 con il recettore. Questa inibizione era di tipo tempo- e concentrazione- dipendente come si può osservare nelle cinetiche di legame relative ai composti 7,8 e 18 (Fig. 17, 18 e 19).
Fig. 17 Comportamento nel tempo del binding del composto 7 al TSPO. Rappresentazione semilogaritmica della diminuzione del binding del [3H] Ro 5-4864 al TSPO con pretrattamento del composto 7 (0, 10, 30, 60, 90 e 180
min.) a varie concentrazioni. I punti rappresentano il valore medio ±SEM derivanti da tre esperimenti indipendenti eseguiti in doppio.
35 Fig. 18 Comportamento nel tempo del binding del composto 8 al TSPO.
Rappresentazione semilogaritmica della diminuzione del binding del [3H] Ro 5-4864 al TSPO con pretrattamento del composto 8 (0, 10, 30, 60, 90 e 180
min.) a varie concentrazioni. I punti rappresentano il valore medio ± SEM derivanti da tre esperimenti indipendenti eseguiti in doppio.
Fig. 19 Comportamento nel tempo del binding del composto 18 al TSPO. Rappresentazione semilogaritmica della diminuzione del binding del
[3H] Ro 5-4864 al TSPO con pretrattamento del composto 18 (0, 10, 30, 60, 90 e 180
min.) a varie concentrazioni. I punti rappresentano il valore medio ± SEM derivanti da tre esperimenti indipendenti eseguiti in doppio
36 Nei grafici sopra riportati B indica il binding dopo pretrattamento delle membrane a diverse concentrazioni dei ligandi ai diversi tempi (0, 10, 30, 60, 90 e 180 min) mentre B0 rappresenta il caso in cui la concentrazione di ligando è pari a 0.
Riportando le grandezze di B e B0 in scala logaritmica in funzione del tempo si può
osservare come la diminuzione del valore ln B/B0 sia lineare e quindi costante nel tempo
(fig. 19, 20 e 21). Secondo queste osservazioni, si può parlare quindi di reazione di cinetica di primo ordine definita dalla seguente relazione:
ln B/B0 = - Kobs x t
dove Kobs è la costante di velocità apparente per le reazioni di primo ordine,
caratterizzanti il binding irreversibile. Matematicamente Kobs è definita dalla pendenza
delle diverse rette presenti nelle fig. 20-22.
Questa relazione matematica permette di calcolare la costante di dissociazione (Kd) del complesso reversibile recettore-ligando e la pseudocostante di velocità della reazione di primo ordine (K2) implicata nella formazione dell’interazione irreversibile tra il
recettore ed il ligando secondo la seguente equazione:
1/Kobs = Kd/K2 x 1/[ D ] + 1/K2
Il grafico in cui sono riportati i valori di 1/Kobs in relazione ai valori di 1/D (dove D è la
concentrazione del ligando) mostra una retta la cui intercetta sull’asse delle ordinate rappresenta il valore di 1/K2, mentre l’intercetta sull’asse delle ascisse dà il valore di
37 Fig. 20 Relazione matematica per calcolare i valori di K2 e Kd del ligando 7
38 Fig. 22 Relazione matematica per calcolare i valori di K2 e Kd del ligando 18
Nella seguente tabella sono riportati i valori della K2 e della Kd dei composti 7,8 e 18;
come si può notare i valori delle Kd sono all’interno del range del nanomolare.
COMPOUND K2 (nM) Kd (nM)
7 0.003 ± 0.001 3.17 ± 0.31
8 0.015 ± 0.002 5.07 ± 0.61
18 0.0012 ± 0.002 8.31 ± 0.89
Tab. 4 Valori di K2 e Kd dei composti 7,8 e 18
Si è potuto quindi concludere che l’interazione dei ligandi testati con il TSPO è di tipo irreversibile e segue tale relazione:
Kd K2
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4.2 STUDI IN VITRO DEL COMPOSTO 18
La capacità del composto 18 di legare specificamente ed irreversibilmente il TSPO è stata valutata sulla linea cellulare U87MG di glioma umano usando la spettroscopia fluorescente.
Per valutare la capacità del composto 18 di permeare attraverso la membrana cellulare sono state anche studiate le sue proprietà chimico-fisiche (tab. 5) dimostrando la sua buona capacità di permeare.
Tab.5 Proprietà chimico-fisiche del composto 18
a coefficiente di ripartizione n-ottanolo acqua. b Totale superficie del solvente. c
Superficie polare. d Numero di atomico. e Numero di legami ruotabili. f Peso molecolare.
Per la valutazione in vitro, le cellule sono state incubate a differenti concentrazioni del composto 18 e a due tempi diversi (20 e 90 minuti, tempo necessario per la formazione del legame calcolato sostituendo le costanti K2 e Kd nelle equazioni precedentemente
descritte). Dopo 20 minuti, i valori d’intensità di fluorescenza ottenuti erano più bassi dei valori ottenuti dopo 90 minuti, come mostrato anche dai grafici riportati in figura 23.
40 Fig. 23 Cellule di glioma umano trattate con il ligando irreversibile fluorescente 18 per il TSPO. Le cellule sono state incubate con il composto 18 a due diversi tempi,
20 minuti (A) e 90 minuti (B) in assenza o presenza di Ro 5-4684.
È interessante notare che dopo 20 minuti di incubazione, il Ro 5-4864 è stato capace di spiazzare il composto 18 con la stessa entità per tutte le concentrazioni saggiate, dimostrando così la specificità del composto 18 per il TSPO. Viceversa negli esperimenti eseguiti in tempi più lunghi, il Ro5-4864 si è dimostrato incapace di spiazzare il composto 18, mostrando così l’irreversibilità del legame con il recettore.
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4.3 CONCLUSIONI
In questo lavoro di tesi è stato possibile definire l’ordine di reazione e le costanti cinetiche dell’interazione tra i ligandi saggiati ed il TSPO. I dati sperimentali ottenuti dimostrano che tutti i ligandi presi in esame sono caratterizzati da un’interazione irreversibile con il recettore.
Inoltre dati ottenuti in cellule U87MG su cui sono stati condotti esperimenti di spettroscopia fluorescente eseguiti per il composto 18 rivelano la sua alta affinità, specificità e capacità di dare legami covalenti con il TSPO. I nuovi ligandi irreversibili al TSPO possono rappresentare mezzi utili sia per lo studio molecolare del recettore stesso che per la sua caratterizzazione e misurazione dei suoi livelli di espressione in ambito diagnostico.
In particolare il composto fluorescente 18 potrebbe essere usato come marcatore per valutare l’espressione del TSPO in biopsie di pazienti affetti da patologie dove si abbia un’alterata densità del TSPO.
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BIBLIOGRAFIA
Atkins P., De Paula J., Elementi di Chimica fisica, Terza edizione italiana,
Bologna, Zanichelli. 2007.
Buck J. R., McKinley E. T., Hight M. R., Fu A., Tang D., Smith R. A., Tantawy M.
N., Peterson T. E., Colvin D., Ansari M.S., Baldwin R. M., Zhao P., Guleryuz S., and Mannin H. C. Quantitative, preclinical PET imaging of TSPO expression in glioma using [18F]PBR06. J Nucl Med., 2011, 52(1): 107-114.
Casellas P., Galiegue S., Basile A.S. Peripheral Benzodiazepine Receptorsand
Mitochondrial Function. Neurochemestry International, 2002, 40 (6): 475-486.
Denora N., Laquintana V., Trapani A., Suzuki H., Sawada M., Trapani G.. New
Fluorescence Probes Targeting the Mitochondrial Located Translocator Protein 18 KDa (TSPO) as Activated Microglia Imaging Agents. Pharm Res. ,2011, 28:2820- 2832.
Gavish M., Bachman I., Shoukrun R., Katz Y., Veenman L., Weisinger G., Weizman.
Enigma of the Peripheral Benzodiazepine Receptor. Pharmacological Reviews , 1999, 51(4): 630-646
43 Harmut W.M. Lueddens, Amy Hauck Newman, Kenner C. Rice, Phil Skolnick. AHN
086: An irreversible Ligand of “Peripheral” Benzodiazepine Receptor. Molecular Pharmacology, 1986, 29: 540-545.
Martini C., Lucacchini A. Affinity Labeling of Adenosine A1 Binding Sites.
Neurochemestry, 1987, 49 (3): 681-684.
Moore W. J., Chimica Fisica, Padova, Piccin-Nuova Libreria. 1990.
Papadopoulos V., Lecanu L., Brown R.C., Han Z., Yao Z.X. Peripheral-Type
Benzodiazepine Receptor in Neurosteroid Biosynthesis, Neuropathology and Neurological Disorders. Neuroscience, 2006, 138 (3): 749-756.
Sega E. I., Low P. S., Tumor detection using folate receptor-targeted imaging
agents. Cancer Metastasis Rev, 2008, 27:
Taliani S., Simorini F., Sergianni V., La Motta C., Da Settimo F., Cosimelli B.,
Abignente E., Greco G., Novellino E., Rossi L., Gremigni V., Spinetti F., Chelli B., Martini C. New Fluorescent 2-Phenylindolglyoxylamide Derivates as Probes Targeting the Peripheral-Type Benzodiazepine Receptor: Design, Synthesis and Biological Evaluation. J. Med. Chem. 2007, 50: 404-407.