Particelle di silice mesoporosa
La microscopia confocale permette di ottenere immagini in 3D della cellula poiché analizza i diversi piani lungo l’asse z. Le due immagini sopra riportate si riferiscono allo stesso piano.
Sovrapponendo le due immagini è possibile notare che la colocalizzazione tra la silice e gli endosomi precoci avvenga dopo 15minuti: è, infatti, presente una doppia colorazione in alcuni punti della cellula.
Merged
La colorazione gialla denota la presenza della silice a livello degli endosomi precoci dopo 15 minuti dalla messa in contatto con le cellule. Tale comportamento è mantenuto anche dopo 30 minuti e un’ora
.
Endosomi precoci e nanoparticelle di silice mesoporosa
Facendo il merged delle due immagini, si nota ancora una volta colocalizzazione a livello degli endosomi precoci dopo 30 minuti dalla messa in contatto della silice con le cellule.
Colocalizzazione: merged dopo 30 minuti
Dall’immagine seguente di colocalizzazione si nota come gli spot verdi e rossi siano mantenuti ben distinti e non ci sia una sovrapposizione molto marcata dopo 1 ora.
Endosomi precoci e nanoparticelle di silice mesoporosa dopo un’ora
Merged
La silice è presente a livello degli endosomi tardivi dopo 15 minuti e 30 minuti.
Endosomi tardivi e nanoparticelle di silice mesoporosa dopo 15 minuti
Merged: time points 15 minuti
L’effetto della colocalizzazione è molto marcato guardando al time point di 30minuti. Infatti, sovrapponendo le immagini riguardanti lo stesso piano della silice e degli endosomi tardivi si nota tale effetto.
Merged dopo 30minuti
La silice mesoporosa colocalizza con gli endosomi tardivi, il segnale di merged è molto più marcato rispetto al time point di 15minuti. La colocalizzazione non è mantenuta nel time points di un’ora.
Endosomi tardivi e nanoparticelle di silice mesoporosa dopo un’ora
Merged dopo un’ora
Guardando alla localizzazione a livello dei lisosomi il solo time point di un’ora dà colocalizzazione a livello dei lisosomi. I time points di 15minuti e 30minuti non sono qui riportati.
Lisosomi e silice mesoporosa dopo un’ora
Merged dopo un’ora
Come è possibile notare dall’immagine sopra riportata, la colocalizzazione a livello dei lisosomi risulta molto marcata.
In definitiva, si può pertanto affermare che l’ingresso della silice all’interno delle cellule MDA-‐ MB-‐231 avviene seguendo il pathway endocitotico che prevede presenza della silice dapprima all’interno degli endosomi precoci, e una volta all’interno della cellula, il destino cellulare che l’attende conduce ai lisosomi.
Sono state utilizzate anche le cellule Hela, derivanti da adenocarcinoma del tessuto cerviceo, per rilevare la presenza di un diverso comportamento della silice quando posta a contatto con una diversa linea cellulare. In questo caso si è definito il destino della silice mesoporosa guardando alla localizzazione a livello degli endosomi tardivi. La microscopia in fluorescenza ha permesso di definire più compartimenti cellullari. Infatti, in verde (A) sono marcati gli endosomi tardivi mentre in rosso (B) è marcata la silice. La terza immagine (C) mostra ancora una volta in verde gli endosomi tardivi mentre in blu il nucleo cellulare.
A. endosomi tardivi, B. silice mesoporosa, C. Merged: nucleo cellulare ed endosomi tardivi
Le immagini di seguito riportate mostrano, invece, la silice e il nucleo cellulare (D). Com’è possibile notare non si ha una sovrapposizione tra il segnale derivante dalla silice e quello derivante dal nucleo cellulare: non si ha, quindi, localizzazione della silice a livello nucleare. Diversamente, invece, la silice è presente a livello degli endosomi tardivi (E) poiché il segnale rosso, della silice, si sovrappone a quello verde degli endosomi tardivi.
A B
Merged :
D. silice mesoposa e nucleo cellulare, E. silice mesoporosa ed endosomi tardivi
Tale affermazione è confermata analizzando il grafico delle intensità dei segnali dovuti alla silice e agli endosomi tardivi. Prendendo, infatti, in considerazione il segnale lungo un dato asse, si ottiene il corrispondente grafico, definito curva d’intensità, che correla l’intensità del segnale delle due diverse sonde. Infatti, la curva d’intensità del segnale degli endosomi si sovrappone a quella della silice.
D E
Si può pertanto affermare, che le silici mesoporose entrano all’interno della cellula Hela seguendo il pathaway endocitotico.
Tale dato trova conferma con quanto riportato in letteratura [1,57].
4. Conclusioni
Le nanoparticelle di silice mesoporosa, sintetizzate tramite reazione di idrolisi e condensazione del precursore TEOS, per mezzo del CTAB come surfattante, sono state caratterizzate in modo da definirne le proprietà fisiche.
Le immagini tramite FEG-‐SEM hanno permesso di definire le dimensioni delle nanoparticelle ed i dati ottenuti sono stati confermati ed implementati servendosi del fisisorbimento di azoto molecolare. In questo modo, è stato possibile definire l’area superficiale delle particelle e la dimensione dei pori. Quindi, è stato possibile confermare che le nanoparticelle sono mesoporose.
Il sistema caratterizzato è stato, pertanto, utilizzato per i diversi esperimenti in vitro. Innanzitutto, si è sondata la tossicità delle sole nanoparticelle: il surfattante è citotossico e pertanto tal esperimento è essenziale per confermare assenza di tossicità. Le nanoparticelle non sono tossiche per concentrazioni al di sotto di 500ug/ml, mentre risultano altamente tossiche alla concentrazione di 4mg/ml.
Ai test di tossicità sono seguiti test di citotossicità che hanno permesso di comparare il sistema nanoparticelle-‐farmaco rispetto al farmaco libero. Sulle colture cellulari, i test di citotossicità non hanno evidenziato maggiore efficacia terapeutica del nanosistema, con gruppi carbossilici o PEG, rispetto al farmaco libero.
Gli esperimenti di opsonizzazione hanno permesso di valutare l’interazione del nanovettore con le proteine del siero. In particolar modo, l’interazione con la BSA avviene in modo maggiore rispetto all’interazione con l’IgG sia che si considerino le nanoparticelle rivestite con gruppi PEG che carbossilici.
Gli esperimenti di immunofluorescenza confermano, invece, quanto riportato in letteratura: l’ingresso delle nanoparticelle di silice procede per mezzo del pathway endocitotico che conduce ai lisosomi. Una volta a livello dei lisosomi la silice è degradata rilasciando il farmaco
che sarà in parte degradato ed in parte sarà veicolato verso il nucleo cellulare dove andrà ad intercalarsi a livello del DNA.
In generale, i test in vitro di vitalità cellulare non definiscono un valore aggiunto al farmaco veicolato per mezzo delle nanoparticelle di silice mesoporosa: la vitalità cellulare non risulta, infatti, alterata in maniera preponderante.
Interessante potrebbero essere lo studio e l’applicazione di tale sistema in vivo. In questo modo, si potrebbe sondare l’eventuale tossicità ridotta del sistema nanostrutturato rispetto al farmaco in forma libera. Infatti, la doxorubicina, è cardiotossica e una somministrazione mirata e controllata nel tempo potrebbe ridurre gli effetti tossici e collaterali. Potrebbe, infatti, essere posta sulla superficie delle nanoparticelle di silice una componente organica che permetta di veicolare selettivamente il farmaco verso il tessuto tumorale.
Esperimenti di biodistribuzione e riduzione del volume del tumore potrebbero definire la doxorubicina veicolata per mezzo di un nanosistema più efficace rispetto al farmaco in forma libera.
A tal proposito, negli ultimi mesi si è lavorato focalizzandosi sulla produzione di nanoparticelle di silice che presentassero sulla superficie una componente organica, come un anticorpo, atta a permettere la veicolazione selettiva del farmaco una volta all’interno di un sistema complesso come il modello murino. Pertanto, l’anticorpo prescelto è stato il Cetuximab che è stato coniugato alle nanoparticelle tramite due diversi protocolli. Un primo protocollo prevedeva la coniugazione per messo di composti chimici quali EDC/NHS che provvedono a coniugare i gruppi silanolici presenti sulla superficie delle nanoparticelle con le componenti amminoacidiche dell’anticorpo. Un secondo protocollo si serviva, invece, di ossidazione utilizzando sodiocianoboroidruro. Per entrambe le classi di particelle, sono stati eseguiti test di tossicità su cellule MDA MB 231.
Tossicità silica con EDC-‐NHS
Il grafico sopra riportato, definisce la tossicità delle nanoparticelle di silice mesoporosa che presentano sulla superficie l’anticorpo Cetuximab coniugato attraverso l’utilizzo di EDC-‐NHS. Si veda come in questo caso le nanoparticelle siano tossiche anche a basse concentrazioni. In tale situazione molto probabilmente viene sondato anche l’effetto terapeutico dell’anticorpo stesso.
La tossicità delle nanoparticelle in cui la coniugazione dell’anticorpo è avvenuta servendosi di reazione ossidativa è, invece, ridotta. Si veda, infatti, il grafico di seguito riportato.
Tossicità silica con sodiocianoboroidruro
0 100000 200000 300000 400000 500000 4000 2000 1000 500 250 125 62,5 31,25 15,625 CTR N u m b er o f c el ls
Silica quantities [ug]
MSN: EDC-‐NHS
0 50000 100000 150000 200000 250000 300000 350000 400000 450000 500000 4000 2000 1000 500 250 125 62,5 31,25 15,625 CTR N u m b er o f c el lsSilica quantities [ug]