Ruolo della troponina I cardiaca nella regolazione della funzione cardiaca

La contrazione del muscolo striato è principalmente regolata dalla presenza di un particolare complesso proteico denominato “tropomiosina”, localizzato a livello dei filamenti sottili di actina; tale complesso è essenzialmente costituito da due componenti distinti: tropomiosina e troponina.

Il complesso della troponina è costituito da tre componenti, ognuno con una funzione specifica: la troponina C (TnC) lega il Ca2+ con alta affinità, la troponina I (TnI) inibisce l’attività ATP-asica della miosina e la troponina T (TnT) media il binding del complesso della troponina alla tropomiosina (72).

La troponina I costituisce dunque l’unità “inibitoria” del complesso della troponina, è pertanto associata ai filamenti sottili di actina e ostacola le interazioni actina-miosina attraverso l’inibizione dell’attività ATP-asica della miosina (73). Nel muscolo striato sono state descritte tre isoforme distinte della troponina I, codificate da tre geni differenti; due isoforme sono caratteristiche delle fibre muscolari scheletriche rapide e lente (fsTnI, fast skeletal, e ssTnI, slow skeletal, rispettivamente) mentre una sola isoforma è espressa specificamente nel muscolo cardiaco (cTnI, cardiac). La troponina I è costituita da circa 181-211 residui aminoacidici e l’isoforma cardiaca presenta una caratteristica estensione di circa 30 residui all’estremità N-terminale, assente nelle altre isoforme (72).

L’espressione dei geni della troponina I è strettamente legata ai diversi stadi dell’ontogenesi: entrambe le isoforme cTnI e ssTnI sono espresse nel cuore fetale umano, dopo la nascita, invece, la il gene della ssTnI viene “spento” mentre viene potenziata l’espressione dell’isoforma cardiaca che diventa progressivamente l’isoforma esclusiva del cuore (dal nono mese di vita in poi) (72).

La cTnI gioca un ruolo importante nel controllo e nella modulazione delle dinamiche sarcomeriche e presenta una struttura bastoncellare e flessibile costituita da alcune regioni distinte: un’estensione N-terminale cardiaco-specifica di circa 30 residui aminoacidici, un “braccio IT”, una regione inibitoria (Ip), una “switch region” (H3) e un dominio C- terminale mobile (Fig. 19). La regione del “braccio IT” è caratterizzata dalla presenza di due α-eliche che interagiscono con il lobo C della TnC e con l’α-elica del dominio C- terminale della TnT; fatta eccezione per il “braccio IT”, la struttura della cTnI appare flessibile e la “switch region” e il dominio mobile al C-terminale possono subire transizioni strutturali a seconda dello stato del Ca2+ legato al sito regolatorio specifico di binding nel lobo N della TnC (74). Durante la fase diastolica (rilassamento) la regione inibitoria e il dominio mobile C-terminale della cTnI interagiscono con l’actina inibendo la formazione dei cross-bridges actina-miosina; in particolare, il binding della regione inibitoria sembra indurre un cambiamento strutturale nell’actina impedendo in questo modo le interazioni forti actina-miosina, mentre il dominio mobile C-terminale potrebbe contribuire ad incrementare la concentrazione locale di molecole di cTnI sull’actina facilitando l’interazione della regione inibitoria (74). Il binding del Ca2+

al sito regolatorio della TnC induce l’esposizione di una regione idrofobica nel lobo N rendendo così possibile il legame della “switch region” (H3) della cTnI alla TnC con conseguente distacco della regione inibitoria e del dominio mobile dall’actina. La regione inibitoria

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subisce in questo modo uno switch conformazionale, assume una struttura più allungata che consente l’interazione della cTnI con la regione linker centrale della TnC con conseguente stabilizzazione dello stato attivo del complesso troponinico. La regione del “braccio IT” sembra essere coinvolta nell’attivazione dei miofilamenti in seguito alla formazione dei cross-bridges actina-miosina (74).

Normalmente la cTnI gioca un ruolo importante nel controllo della contrattilità cardiaca, inibendo le interazioni actomiosiniche durante la fase diastolica, in presenza di bassi livelli di Ca2+intracellulare. Durante la sistole, il consistente aumento della concentrazione citosolica e il successivo binding del Ca2+alla TnC inducono modificazioni conformazionali nella struttura della cTnI con conseguente annullamento dell’influenza inibitoria, promozione della formazione dei cross-bridges actomiosinici e contrazione miocardica. Con il declino dei livelli citosolici del Ca2+ ai valori diastolici e successiva dissociazione del Ca2+ dalla TnC, l’azione inibitoria della cTnI sull’interazione actina-miosina viene ripristinata; questa proteina costituisce dunque un regolatore chiave nella contrazione e rilassamento del muscolo cardiaco, fungendo da linker tra il binding Ca2+-TnC e l’attivazione delle reazioni di cross-bridge con i filamenti sottili (73).

In condizioni fisiopatologiche, alterazioni della funzione cardiaca contrattile potrebbero essere legate a cambiamenti nella risposta dei miofilamenti al Ca2+ e/o a cambiamenti nell’intensità o durata delle correnti cellulari di Ca2+

, il cui ruolo centrale nella regolazione della contrazione e rilassamento muscolare risulta peraltro ben riconosciuto. Attualmente, tuttavia, è stato dimostrato come anche le proprietà dei miofilamenti possano contribuire significativamente alla modulazione dinamica della funzione Figura 19. Modello raffigurante le interazioni dei componenti del complesso troponinico nello stato diastolico (rilassamento), in presenza della fosforilazione (PP) dei residui Ser23/Ser24 nell’elica di fosforilazione dell’estensione N- terminale cardiaco-specifica della cTnI, costituita inoltre da un’elica linker ricca in prolina e una regione acida. Tm, tropomiosina, cTnI, troponina I cardiaca, cTnT, troponina T cardiaca, H3, “switch region” legante la cTnC, Ip, regione inibitoria. Il dominio (II) della cTnC corrisponde al dominio regolatorio (lobo-N) di binding del Ca2+. Durante la diastole la regione N-terminale fosforilata della cTnI interagisce con la regione inibitoria. Solaro RJ et al.,

Biochemical and Biophysical

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contrattile: un’alterata funzione dei filamenti sottili potrebbe per esempio giocare un ruolo importante nella disfunzione contrattile associata a scompenso cardiaco (73). La fosforilazione, mediata da numerose protein-chinasi differenti, della cTnI in specifici residui di serina e treonina costituisce uno dei principali meccanismi fisiologici responsabili delle alterazioni delle proprietà dei miofilamenti; cambiamenti nello stato di fosforilazione della cTnI sono stati infatti riportati in alcuni cuori umani scompensati e potrebbero essere il risultato di uno squilibrio tra attività chinasiche e fosfatasiche (73). Numerosi studi hanno dimostrato come la fosforilazione PKA-mediata dei siti Ser23 e Ser24 presenti nell’estensione N-terminale di 30 residui aminoacidici, caratteristica dell’isoforma cardiaca della troponina I, sia associata ad un’attenuazione della risposta sarcomerica al Ca2+ e ad un incremento delle cinetiche di formazione dei cross-

bridges, conferendo così alla cTnI un ruolo critico nella regolazione fisiologica della

funzione cardiaca contrattile (74). La fosforilazione della cTnI ai siti Ser23/Ser24 sembra diminuire la sensibilità dei miofilamenti al Ca2+ risultando quindi un fattore significativo nel rilassamento cardiaco, una modificazione post-traduzionale importante per il normale mantenimento della forza e della frequenza delle risposte ventricolari. Gli effetti funzionali di tale fosforilazione potrebbero manifestarsi in seguito all’alterazione delle interazioni inter- e intra-molecolari dell’isoforma cardiaca: la principale interazione inter- molecolare è l’interazione relativamente debole della cTnI non-fosforilata con il dominio regolatorio (lobo N) della TnC, responsabile dell’alta affinità del lobo N della TnC per il binding del Ca2+. La fosforilazione PKA-mediata della cTnI ai siti Ser23/Ser24 indebolisce ulteriormente l’interazione cTnI (estensione N-terminale cardiaco-specifica)- TnC (lobo N) con conseguente riduzione dell’affinità del lobo N per il Ca2+

e aumento della dissociazione del Ca2+ dal complesso troponinico. L’estensione N-terminale fosforilata (Ser23/Ser24) si dissocia dunque dal lobo N della TnC risultando così più flessibile e in grado di interagire con la regione inibitoria: la dissociazione del Ca2+ dal dominio regolatorio della TnC induce un cambiamento conformazionale della regione inibitoria con conseguente indebolimento dell’interazione di tale regione con l’actina dei filamenti sottili e alterazione delle reazioni di formazione dei cross-bridges (74).

In condizioni patologiche quali l’ipertrofia ventricolare cronica e lo scompenso cardiaco, la disfunzione contrattile è stata da sempre associata ad alterazioni nell’espressione e nelle proprietà di proteine chiave nella regolazione dell’omeostasi intracellulare di Ca2+ (per lo più SERCA-ATPasi e scambiatore Na+/Ca2+); attualmente, tuttavia, numerosi studi hanno fornito evidenza di come anche anomalie patologiche nelle proprietà dei miofilamenti possano essere implicate nello sviluppo di un fenotipo disfunzionale. Alterazioni di alcune delle principali proteine contrattili, come la miosina con la sua catena pesante e leggera e l’isoforma cardiaca della TnI, sembrano giocare un ruolo significativo nella riduzione dell’attività ATPasica miofibrillare e della forza contrattile, diminuzione della velocità di accorciamento muscolare e frequenza di formazione dei cross-bridges,anomalie osservate nell’ipertrofia ventricolare “maladattativa” e scompenso cardiaco (73). Un incremento della fosforilazione PKA-mediata della cTnI ai siti Ser23/Ser24 potrebbe determinare dunque una drastica riduzione della sensibilità dell’apparato contrattile al Ca2+

con conseguente diminuzione della tensione contrattile e dell’attività ATPasica, effetti probabilmente risultanti dalla ridotta affinità della cTnI-

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fosforilata per la TnC, la quale lega il Ca2+ con minore affinità. La fosforilazione dei residui Ser23/Ser24 induce dunque significative modificazioni conformazionali nella struttura della cTnI indebolendone l’interazione con la TnC e il binding del Ca2+

ai siti regolatori della TnC con conseguente desensibilizzazione dei miofilamenti al Ca2+ e disfunzione contrattile (72).

1.4 MODELLI ANIMALI DI IPERTENSIONE ARTERIOSA