Saggi di patogenicità

Infezione su mela

Questo saggio è stato eseguito per valutare la capacità di accrescimento invasivo del patogeno attraverso manifestazioni dell’imbrunimento della mela. Dai risultati ottenuti dalle osservazioni delle porzioni di mela inoculate con i due singoli trasformanti Δste2, i tre doppi trasformanti Δste2 Δfmk1, Fol 4287 WT e Fol 4287 Δfmk1 è emerso che i singoli trasformanti sono risultati in grado di infettare la mela dando luogo ad un imbrunimento confrontabile con quello ottenuto con il ceppo wild type, senza mostrare alcuna differenza nelle capacità patogeniche. I doppi trasformanti, invece, non sono in grado di infettare la mela, Risultati

patogenico nei confronti della mela stessa (Fig.21). Fol 4287 Δfmk1, infatti, viene normalmente utilizzato in questo tipo di saggio come controllo negativo di infezione.

Figura 21 Saggio di patogenicità su mela. L’infezione si manifesta come

imbrunimento della porzione del frutto in corrispondenza della zona di inoculo.

Infezione su piante di pomodoro

Il secondo saggio di patogenicità è stato condotto su piante di pomodoro ed è stata verificata la capacità del trasformante di infettare l’ospite e causare malattia. L’evolversi dell’infezione è stata valutata sulla base di 5 stadi fondamentali utilizzati per catalogare la patologia (§ 3.15.1; Tab.6). In questo test i trasformanti Δste2 sono risultati in grado di infettare perfettamente la pianta di pomodoro e causare tutti i sintomi della malattia fin quasi alla morte dell’ospite, così come osservato per il wild type. I trasformanti Δste2 Δfmk1 non sono stati in Risultati

grado di infettare le piante né, quindi, di causare la patologia, comportandosi esattamente come il controllo negativo Δfmk1 e il controllo di H2O (Fig.22).

Figura 22 Saggio di infezione su piante di pomodoro: andamento nel tempo

della malattia. Non si riscontrano differenze significative tra i trasformanti Δste2 e il ceppo wild type, mentre tutti gli altri ceppi si comportano come l’H2O.

Adesione alle radici

L’ultimo test di patogenicità condotto su Fol 4287 WT e sui trasformanti Δste2, Δfmk1 e Δste2 Δfmk1 ha riguardato la capacità di aderire alle radici di piante di pomodoro. L’adesione alle radici da parte del fungo si manifesta con l’accrescimento massivo del ceppo attorno alle strutture ipogee formando un micelio generalmente di colore bianco con riflessi viola, facilmente individuabile anche ad occhio nudo (Fig.23). Il Risultati

trasformante Δste2 è risultato in grado di aderire alle radici di pomodoro come il ceppo wild type mentre, come atteso, il trasformante Δfmk1 e il doppio trasformante Δste2 Δfmk1 non sono stati in grado di aderire alle radici.

Figura 23 Saggio di adesione alle radici di pomodoro: foto allo stereoscopio.

Risultano bene in evidenza il micelio del ceppo wild type e di Δste2 attorno alle radici, così come la mancata adesione da parte di Δfmk1 e di Δste2 Δfmk1.

4.3.2 Saggi fisiologici

Crescita su differenti substrati

Il test è stato condotto inoculando il ceppo wild type e i trasformanti Δste2, Δfmk1 e Δste2 Δfmk1 su diversi substrati di crescita: YPGA (NaCl: 1.2M, 0.8M, 0.4M), SM-MES-CR (25μg/ml, 50 μg/ml) e SM-MES- CFW(20μg/ml, 40 μg/ml). Dall’osservazione delle colonie cresciute sui differenti substrati si evince che tutti e 4 i ceppi testati non mostrano differenze di crescita alcuna, o quantomeno apprezzabili ad occhio nudo (Fig.24).

Figura 24 Crescita del ceppo wild type e dei trasformanti Δste2, Δfmk1 e Δste2 Δfmk1 su differenti substrati (YPGA NaCl 1,2M; SM-MES-CFW 40 μg/ml; SM-MES-CR 50 μg/ml).

Saggio di penetrazione del cellophane

Il test di penetrazione del cellophane è stato condotto al fine di valutare la capacità di produrre enzimi cellulosolitici e di superare una superficie rigida attraverso una penetrazione attiva. Dopo sei giorni di incubazione a 28°C i trasformanti Δste2 sono risultati in grado di attraversare il cellophane e formare una colonia vigorosa sul substrato sottostante così come osservato per il wild type (Fig.25). I doppi trasformanti Δste2 Δfmk1 così come il controllo negativo Δfmk1 non sono stati in grado di attraversare la barriera di cellophane a seguito della mancata produzione di enzimi cellulosolitici o a causa dell’incapacità di esercitare una pressione adeguata su una superficie rigida.

Figura 25 Crescita del ceppo wild type e dei trasformanti Δste2, Δfmk1 e Δste2 Δfmk1.

Saggio di agglutinazione

Al fine di verificare la capacità di fusione vegetativa da parte dei singoli e dei doppi trasformanti in confronto ai ceppi wild type e Δfmk1, è stato condotto un test di agglutinazione delle ife in cui è stata rilevata la formazione di eventuali agglomerati miceliari da parte dei ceppi fungini. Il trasformante Δste2 è risultato in grado di formare agglomerati miceliari, ma in maniera sensibilmente ridotta rispetto al ceppo wild type, differenza apprezzabile pure ad occhio nudo anche se non quantificabile senza ulteriori analisi. Gli agglomerati, nonostante la ridotta produzione, sono risultati particolarmente resistenti alla rottura meccanica. Il ceppo Δfmk1 e i doppi trasformanti Δste2 Δfmk1 non sono stati in grado di formare agglomerati miceliari, indicando deficienze nella fusione vegetativa(Fig.26).

Figura 26 Saggio di agglutinazione: foto allo stereoscopio. Si nota una ridotta

capacità da parte del ceppo Δste2 di fondere rispetto al ceppo wild type, mentre Δfmk1 e Δste2 Δfmk1 non sono in grado di formare agglomerati miceliari.

Saggio di fusione vegetativa

Attraverso il saggio di fusione vegetativa è stato possibile quantificare la frequenza con la quale i vari ceppi fondono; quindi non solo si è discriminato tra ceppi in grado di formare agglomerati miceliari e quelli non in grado di fondere (come già visto nel saggio di agglutinazione), ma è stato anche possibile stimarne le differenze. Dall’analisi al Risultati

microscopio ottico risulta che la capacità di dar luogo a fusioni ifali da parte del trasformante Δste2 è circa la metà di quella del ceppo wild type mentre, come era già noto, il ceppo Δfmk1 e i doppi trasformanti Δste2 Δfmk1 non sono assolutamente in grado di formare aggregati miceliari (Fig.27).

Figura 27 Saggio di fusione. Il silenziamento del gene Δste2 riduce di quasi la

metà la capacità di formare aggregati miceliari rispetto al wild type. Come già noto, i ceppi Δfmk1 e Δste2 Δfmk1 non sono in grado di formare agglomerati miceliari.

Chemiotropismo

Il saggio del chemiotropismo ha permesso di valutare la capacità dei Risultati

chemio-attrattive: glucosio 55 mM, glutammato di sodio 295 mM, α- feromone 378.05 μM, estratto di ife 10x, essudato di radici di pomodoro 1x.

Dai risultati ottenuti (Fig.28) emerge che il ceppo wild type, come era logico attendersi, risponde positivamente all’attrazione esercitata da parte di tutte le sostanze chemio-attrattive utilizzate nel test. Il mutante Δfmk1, invece, risente dell’attrazione esercitata da parte di tutti quei composti il cui stimolo viene recepito nella via di ricezione del segnale dei feromoni (estratto di ife, essudato di radici, α-feromone), ma non risponde all’attrazione di glucosio e glutammato di sodio in quanto composti recepiti attraverso il pathway dei nutrienti, in cui la mapkinasi fmk1 svolge un ruolo determinante nella regolazione della cascata del segnale. Il trasformante Δste2, così come il wild type, risponde positivamente all’interazione con glucosio, glutammato (pathway dei nutrienti) ed estratto di ife (pathway dei feromoni), mentre risulta insensibile all’essudato di radici e ad α-feromone. Infine, come atteso, il doppio trasformante Δste2 Δfmk1 mostra un comportamento analogo al ceppo Δfmk1 riguardo all’interazione con glucosio e glutammato; inoltre, al pari di Δste2, risulta insensibile all’essudato di radici e ad α- feromone, mentre risponde positivamente all’attrazione esercitata da parte dell’estratto di ife.

Figura 28 Saggio del chemiotropismo. Il silenziamento del gene ste2 rende i

trasformanti insensibili ad α-feromone e all’essudato di radici, mentre continuano a rispondere positivamente all’interazione con l’estratto di ife.

Saggio di germinazione

In questo saggio è stata valutato l’effetto di sostanze chemio-attrattive sulla frequenza germinativa dei quattro ceppi fungini in esame (Fig.29). Rispetto ai parametri rilevati dal ceppo wild type il mutante Δfmk1 mostra una drastica riduzione nella frequenza germinativa rispetto a tutte le sostanze chemio-attrattive, mentre il trasformante Δste2 riporta valori paragonabili al wild type, e in alcuni casi anche superiori (H2O,

glucosio e α-feromone); inoltre dimostra di non risentire del Risultati

provenienti da α-feromone e dall’essudato di radici, come invece avviene nel saggio del chemiotropismo. Il doppio trasformante Δste2 Δfmk1 infine, mostra un comportamento alquanto anomalo poiché non subisce una drastica riduzione nella frequenza germinativa pari a quella del mutante Δfmk1 (come invece avremmo dovuto attenderci), bensì presenta valori nettamente superiori, anche se inferiori di quelli riportati dal wild type.

Figura 29 Saggio di germinazione. Il silenziamento del gene ste2 non mostra

ripercussioni sul comportamento dei trasformanti Δste2, mentre i doppi trasformanti Δste2 Δfmk1 presentano valori superiori a quelli del singolo mutante Δfmk1.

5. DISCUSSIONE

Il mating type negli Ascomycota è determinato prevalentemente da due possibili sequenze di DNA al locus mating type (MAT). Gli organismi eterotallici hanno un singolo locus MAT con due idiomorfi (MAT1-1 e MAT1-2), mentre le specie omotalliche portano i geni di entrambi gli idiomorfi sullo stesso cromosoma, ed entrambi sono essenziali per la auto-fertilità (Lee et al., 2003). Dal confronto tra gli idiomorfi del fungo asessuato F. oxysporum e quelli del fungo eterotallico G. fujikuroi, risulta che essi presentano geni omologhi con un elevato indice di similarità. Inoltre un’analisi RT-PCR ha permesso di concludere che i rispettivi geni degli idiomorfi di F. oxysporum vengono effettivamente espressi. Anche in C. albicans, altro fungo asessuato, è stata riscontrata la presenza dei geni MAT; ciò da credito alla tesi secondo la quale i funghi asessuati derivino da quelli che si riproducono sessualmente e che possano sporadicamente dar luogo a forme di riproduzione sessuale (Taylor et al., 1999). Inoltre la similarità delle sequenze e nell’organizzazione degli idiomorfi di N. crassa, P. anserina, F. oxysporum, G. fujikuroi, e M. grisea è talmente chiara da suggerire una origine comune per queste specie. Fonti autorevoli sostengono che nei Sordariomycetes l’evoluzione da etero a omo-tallismo sia da ritenere più plausibile rispetto all’evento Discussione

contrario (Nauta and Hoekstra, 1992). Tutto questo aiuta a capire l’importanza che ha avuto, e che probabilmente continuerà ad avere in futuro, lo studio dei geni MAT per la comprensione dei meccanismi evolutivi interni al genere Fusarium e delle cause dell’asessualità di F. oxysporum (Yun et al., 2000).

Feromoni e recettori sessuali sono codificati da geni la cui espressione è controllata dalle proteine prodotte dagli idiomorfi MAT1-1 e MAT1-2. L’interazione tra feromoni e recettori di opposto mating type (α- feromone/Ste2 o a-feromone/Ste3) da luogo ad una serie di risposte tra le quali: arresto del ciclo cellulare in fase G1, alterazioni morfologhiche (formazione di shmoo), induzione dell’espressione di vari geni (Herskowitz, 1989). La via di trasduzione del segnale dei feromoni è stata ben caratterizzata in S. cerevisiae. In questo fungo è stata osservata la presenza di una cascata di segnali MAPK molto ben conservata, composta da tre moduli su più livelli che comprendono una MAP Kinase Kinase Kinase (Ste11), una MAP Kinase Kinase (Ste7) ed una MAPK (Fus3), la quale viene attivata da una doppia fosforilazione a carico dei residui di treonina e tirosina (Rispail et al., 2009).

Rispetto a S.cerevisiae, in F. oxysporum la via di trasduzione del segnale dei feromoni rimane ad oggi un mistero, dal momento che non è noto neppure quali siano i recettori che legandosi ai rispettivi feromoni, danno inizio alla cascata del segnale. Fino ad oggi si conoscevano Discussione

solamente due delle componenti facenti parte della cascata del segnale, ovvero le proteine di membrana Msb2 e Sho1, le quali sembrano svolgere un ruolo nella ricezione del segnale nella via dei feromoni, così come precedentemente documentato in § 1.2.3. Per queste ragioni l’attività sperimentale che ha portato alla stesura della presente tesi di laurea ha avuto come scopo quello di studiare la via di trasduzione del segnale dei feromoni in F. oxysporum, in particolare indagando circa il possibile ruolo della proteina di membrana Ste2 come recettore di α- feromone, così come già noto in S. cerevisiae. Tramite l’uso delle banche dati (Fusarium Comparative Database) nella prima parte del seguente lavoro sono stati identificati in F. oxysporum i loci FOXG_10633.2, FOXG_02147.2, FOXT_08636 e chr5 supercontig2:89345-90381, omologhi di ste2, ste3, α-feromone e a-feromone, codificanti per proteine rispettivamente di 380, 495, 524 e 59 aminoacidi. Dall’analisi filogenetica condotta col software MEGA4 al fine di valutare le distanze filogenetiche intercorrenti tra le varie specie fungine in esame, risulta sempre una forte similarità tra le sequenze di F. oxysporum e quelle di G. zeae; differenze che aumentano, come del resto era prevedibile, spostandosi verso specie filogeneticamente sempre più distanti come N. crassa fino a S. cerevisiae. In G.zeae sono stati condotti test volti a valutare i livelli di espressione dei quattro geni, mediante l’utilizzo di costrutti GFP reporter (Lee et al., 2008); in base a questo studio è emerso che: ppg1, omologo del Discussione

precursore di α-feromone in S. cerevisiae, risulta fortemente espresso nei conidi in germinazione e nelle ascospore rilasciate dai periteci, e debolmente espresso nelle altre strutture; pre2, recettore di ppg1, viene espresso in tutte le strutture eccetto nel micelio non indotto; ppg2, omologo del precursore di a-feromone, risulta non essere mai espresso in nessuna cellula, mentre il rispettivo recettore pre1 viene espresso debolmente solo nelle ascospore mature. Una volta confermata la presenza nel genoma di F. oxysporum dei geni codificanti per feromoni e rispettivi recettori, il passaggio successivo ha previsto di verificare che essi venissero correttamente espressi per fugare il dubbio che la loro presenza all’interno del genoma fosse semplicemente ascrivibile ad un lascito dell’evoluzione, cioè che si trattasse di sequenze nucleotidiche comunque presenti ma che nel corso del tempo avevano perso le proprie funzioni geniche. Perciò sono state effettuate due analisi di qRT-PCR: una a diversi time course per osservare la variazione dell’espressione dei geni in esame nel tempo e l’altra in diversi substrati di crescita (mezzo povero SM, SM+C, SM+N e SM+C+N) per valutare la variazione dell’espressione dei quattro geni quando il fungo cresceva in mezzi più o meno ricchi di nutrienti. Dalla prima analisi risulta una elevata espressione di ste2 e a-feromone a T0, mentre nei successivi

rilievi questi geni manifestano livelli di espressione molto bassi, paragonabili a quelli di ste3 e α-feromone. Quindi, se da un lato è stato Discussione

raggiunto lo scopo di dimostrare che i quattro geni vengono effettivamente espressi in F. oxysporum, dall’altro lato risulta difficile formulare ipotesi riguardo al motivo delle differenze di espressione tra le due coppie di feromoni-recettori a T0. Nella seconda analisi, invece,

ste2, ste3 e α-feromone mantengono livelli di espressione sempre molto bassi, mentre a-feromone viene espresso ad un livello fino a mille volte superiore in substrato povero SM, valore che tende a scendere progressivamente col passaggio in mezzi SM+C e SM+N, fino a risultare paragonabile a quello degli altri tre geni in presenza del substrato SM+C +N. In questo caso si può ipotizzare che in F. oxysporum, a-feromone possa svolgere un ruolo nell’adattamento ad una condizione di carenza di nutrienti, come suggerito dalla progressiva riduzione dei livelli di espressione del gene in substrati sempre più ricchi di nutrienti.

Per indagare circa il possibile ruolo della proteina di membrana Ste2 come recettore di α-feromone, i ceppi di Fol 4287 WT e di Fol 4287 Δfmk1 da noi utilizzati sono stati sottoposti a silenziamento genico del gene putativo omologo di ste2 di S. cerevisiae, individuato attraverso le indagini bioinformatiche appena descritte. Attraverso il processo di trasformazione genetica è stato possibile ottenere due singoli e tre doppi trasformanti (i primi denominati ceppi Δste2 e i secondi ceppi Δste2 Δfmk1), contenenti il putativo gene ste2 inattivato mediante sostituzione con il gene per la resistenza all’Igromicina B, come Discussione

confermato dai risultati delle analisi Southern-Blot. Questa tecnica di silenziamento genico è stata già utilizzata con successo per lo studio di geni implicati nella fusione vegetativa, come i geni fmk e fso in Fol (Rosales and Di Pietro 2008).

Poiché in F. oxysporum non sono noti i recettori di membrana che attivano la via di trasduzione del segnale dei feromoni e della patogenicità, sono stati indagati i possibili ruoli del gene silenziato nella patogenicità e nella fisiologia attraverso saggi comparativi condotti sul ceppo wild type, sul mutante Δfmk1, sui mutanti Δste2, e sui doppi mutanti Δste2 Δfmk1. Sulla base dei risultati ottenuti dai saggi di patogenicità condotti su mela e piante di pomodoro è stato possibile concludere che il gene ste2 non gioca un ruolo nell’infezione degli ospiti e nella adesione alle radici, come evidenziato dal comportamento dei trasformanti Δste2 che sono risultati perfettamente confrontabili con quello del wild type, e dei trasformanti Δste2 Δfmk1 rispetto al mutante Δfmk1. Quindi la differenza con il gene fmk1, la cui inattivazione mostra una totale perdita della capacità infettiva (Rosales and Di Pietro, 2008), potrebbe essere dovuta al fatto che i due geni appartengono a vie metaboliche differenti.

Per quanto riguarda i risultati ottenuti dai test fisiologici si rende necessario operare dei distinguo. Se da un lato, basandosi sui risultati dei test di crescita su differenti substrati e di penetrazione del Discussione

cellophane, si potrebbe concludere che il gene ste2 non ha un ruolo nella fisiologia di Fol, non si può dire la stessa cosa se consideriamo i successivi saggi di agglutinazione, fusione vegetativa, germinazione e chemiotropismo. Il trasformante Δste2, infatti, mantiene la capacità di crescere su diversi substrati e penetrare il cellophane (produzione di enzimi cellulosolitici e capacità di penetrazione di una superficie rigida), mostrando un comportamento uguale a quello del wild type; allo stesso modo il doppio trasformante Δste2 Δfmk1 segue il comportamento del trasformante Δfmk1, il quale non riesce a penetrare il cellophane. I saggi di agglutinazione e di fusione vegetativa, invece, mostrano chiaramente che il gene ste2 può giocare un ruolo nella fisiologia di Fol. Nel caso specifico si osserva una sensibile riduzione (di quasi la metà) nella capacità da parte del mutante Δste2 di formare agglomerati miceliari, indicando deficienze nella fusione vegetativa. Come era già noto, il ceppo Δfmk1 non è assolutamente in grado di formare aggregati miceliari; di conseguenza non lo sono neppure i doppi trasformanti Δste2 Δfmk1. In base ai risultati ottenuti è quindi possibile avanzare l’ipotesi secondo la quale, essendo stati alterati i meccanismi di fusione in seguito al silenziamento genico, questo fenomeno possa essere parzialmente sotto il controllo del gene ste2.

I risultati più interessanti ottenuti in questo lavoro riguardano i saggi di chemiotropismo e di germinazione. Nel primo caso non ci si Discussione

attendevano sorprese, come del resto non si sono avute, dai composti chemio-attrattivi che passano attraverso il pathway dei nutrienti, dove fmk1 svolge un ruolo determinante nella trasduzione del segnale. Infatti il trasformante Δste2 risente dell’attrazione da parte di glucosio e glutammato così come il ceppo wild type, mentre i doppi trasformanti Δste2 Δfmk1 risultano insensibili, in linea con quanto accade con il mutante Δfmk1. Per quanto riguarda la via di trasduzione del segnale dei feromoni, la valutazione della capacità di crescita in direzione delle sostanze chemio-attrattive testate (α-feromone, essudato di radici di pomodoro ed estratto di ife) permette di stabilire in maniera chiara e inequivocabile che la proteina di membrana Ste2 è il recettore di α- feromone, dal momento che i mutanti Δste2, al contrario del ceppo wild type, risultano insensibili all’interazione col feromone stesso. Identici risultati si ottengono testando le capacità chemio-attrattive dell’essudato di radici, indicando che Ste2 non solo è il recettore di α- feromone, ma anche di non precisate molecole contenute nell’essudato di radici di pomodoro. Al contrario, la risposta all’attrazione chemiotropica esercitata da parte dell’estratto di ife si manifesta in tutti e quattro i ceppi fungini testati indicando che Ste2 non è il recettore dell’estratto di ife pur essendo, quest’ultimo, un composto che viene normalmente recepito attraverso la via di trasduzione del segnale dei feromoni. Infine, osservando i risultati ottenuti dal saggio di Discussione

germinazione si evince che il traformante Δste2 riporta valori simili al ceppo wild type e a volte superiori, come nel caso di H2O, glucosio e α-

feromone. Inoltre dimostra di non risentire affatto del silenziamento genico subito quando si tratta di rispondere a stimoli provenienti da α- feromone e dall’essudato di radici, come invece avviene nel saggio del chemiotropismo. Ciò potrebbe indurre a pensare che α-feromone e