INDICE
1. INTRODUZIONE
11.1 Il mating negli Ascomycota 1
1.1.1 Il locus MAT nel fungo modello S.cerevisiae 1 1.1.2 Il locus MAT nei funghi filamentosi 5 1.1.3 Feromoni e recettori nel fungo modello S. cerevisiae 8 1.1.4 Feromoni e recettori nei funghi filamentosi 18 1.2 Profilo di un fungo patogeno: Fusarium oxysporum 22
1.2.1 Biologia 22
1.2.2 La tracheomicosi 25
1.2.3 La trasduzione del segnale 28
2. SCOPO DEL LAVORO
313. MATERIALI E METODI
333.1 Materiale Biologico 33
3.2 Substrati di coltura 34
3.3 Soluzioni e composti chimici 36
3.4 Oligonucleotidi sintetici 38
3.5 Condizioni di crescita e mantenimento degli organismi 40 3.6 Coltura dei campioni per analisi di espressione
qRT-PCR 42
3.7 Isolamento degli acidi nucleici 43
3.7.1 Estrazione del DNA plasmidico da Escherichia coli
3.7.2 Estrazione del DNA da Fusarium oxysporum con CTAB 44 3.7.3 Estrazione del RNA da Fusarium oxysporum con Tripure 45
3.8 Quantificazione degli acidi nucleici 48
3.8.1 Quantificazione mediante elettroforesi 48 3.8.2 Quantificazione mediante spettrofotometro 48 3.9 Reazione a catena della polimerasi (PCR) 49
3.9.1 PCR-standard 49
3.9.2 Trascrizione inversa con Oligo dT 50
3.9.3 qRT-PCR 51
3.10 Taglio ed eluizione di bande da gel di agarosio 55 3.11 Costruzione dell’inserto per la trasformazione 57
3.12 Protoplasti di F. oxysporum 60
3.13 Trasformazione di F. oxysporum 63
3.14 Screening dei trasformanti 67
3.14.1 PCR dei putativi trasformanti 67
3.14.2 Sotuhern-Blot 67
3.15 Caratterizzazione fenotipica dei trasformanti 73
3.15.1 Saggi di patogenicità 73
3.15.2 Saggi fisiologici 76
4. RISULTATI
814.1 Analisi di espressione qRT-PCR 81
4.1.1 Identificazione di geni ortologhi di ste2, ste3, α-feromone e
a-feromone in F.oxysporum 81
4.1.2 qRT-PCR 86
4.2 Silenziamento del gene Δste2 mediante trasformazione di Introduzione
4.3 Caratterizzazione fenotipica dei trasformanti Δste2 e Δfmk1 Δste2 93 4.3.1 Saggi di patogenicità 93 4.3.2 Saggi fisiologici 97
5. DISCUSSIONE
1056. BIBLIOGRAFIA
115 Introduzione1. INTRODUZIONE
1.1 Il mating negli Ascomycota
1.1.1 Il locus
MAT nel fungo modello S.cerevisiae
Si ipotizza che i funghi siano comparsi per la prima volta sulla Terra durante l’Era Precambriana, circa 1,5 miliardi di anni fa. Quello degli Ascomycota risulta essere il maggiore tra i Phyla fungini, che si differenziò da quello dei Basidiomycota in un periodo di tempo compreso fra 968 milioni e 1,208 miliardi di anni fa (Heckman et al., 2001; Hedges et al., 2004). Negli Ascomycota le due classi principali (Pezizomycotina e Saccharomycotina) annoverano alcune tra le più conosciute e meglio caratterizzate specie fungine. Queste vanno dai funghi filamentosi patogeni per gli animali (es.: Aspergillus fumigatus) e piante (es.: Magnaporthe grisea) fino ai lieviti unicellulari (es.: Saccharomyces cerevisiae) fondamentali in ambito biotecnologico (Heitman et al., 2007).
La riproduzione sessuale nei funghi può avvenire attraverso un meccanismo eterotallico (funghi sterili) o omotallico (funghi auto-fertili). Nelle specie eterotalliche, la riproduzione è resa possibile solamente tra due gruppi sessualmente compatibili, morfologicamente
riguarda le specie omotalliche, ciascun ceppo può auto-riprodursi. Alcuni funghi sono pseudo-omotallici, ovvero i ceppi sono auto-fertili ma i nuclei che vanno incontro a fusione devono appartenere a differenti mating types (Coppin et al., 1997; Kronstad and Staben, 1997). Ceppi di S. cerevisiae isolati in natura sono un esempio di un’insolita forma di pseudo-omotallismo, dal momento che organismi aploidi possono cambiare mating type, così da permettere, in seguito, la fusione di nuclei di tipo opposto.
Con il termine mating type si definiscono tutte quelle attività specifiche di una cellula che sono necessarie per passare da una fase aploide ad una diploide per poi continuare fino alla meiosi. Il mating type negli Ascomycota è determinato prevalentemente da due possibili sequenze di DNA al locus mating type (MAT). Nel tempo si sono evoluti diversi sistemi affinché fosse garantito il mantenimento di sessi differenti di due o più mating types. In molte specie fungine i processi di riconoscimento cellula-cellula e di fusione sono mediati da molecole peptidiche diffusibili, specifiche per l’accoppiamento. A queste molecole è stato attribuito il nome di feromoni, in analogia con le sostanze chimiche rilasciate da insetti e mammiferi, che possono scatenare specifiche risposte a dosaggi molto bassi. La prova evidente dell’esistenza dei feromoni deriva dall’osservazione secondo la quale sostanze diffusibili possono agire a distanza producendo un effetto Introduzione
cellula-specifico (Levi, 1956). Il mating fra due cellule aploidi coinvolge un set di reazioni complesso che assicurano l’espressione coordinata di geni necessari al controllo del processo di fusione cellulare e alla conseguente cariogamia. Il requisito imprescindibile per la fusione nucleare è che le cellule si trovino nella stessa fase del ciclo cellulare; l’arresto del ciclo cellulare in fase G1 è una delle prime risposte ai feromoni in lievito (Bolker and Kahmann, 1993).
L’analisi dei loci MAT appartenenti a differenti specie di funghi filamentosi ha portato alla definizione di un idiomorfo, che denota sequenze non correlate in quanto a struttura ma presenti nello stesso locus omologo (Metzenberg and Glass. 1990). Ad oggi questo termine è comunemente utilizzato per indicare strutture alternative al locus MAT in altri funghi. Gli idiomorfi MAT codificano per fattori di trascrizione che regolano l’identità cellulare. Negli Ascomycota, nonostante il contenuto genico e l’ordine in cui essi sono disposti nel locus MAT varino sensibilmente, la posizione del locus stesso è sorprendentemente ben conservata (Heitman et al., 2007). In molti Pezizomycotina il locus MAT si colloca fra omologhi di APN2 (codificante per una endonucleasi/DNA liasi) e SLA2 (codificante una proteina che si lega all’actina). Un’organizzazione di questo tipo si ritrova in specie appartenenti alle classi dei Sordariomycetes (Neurospora crassa e Gibberella zeae), degli Eurotiomycetes (Coccidioides immitis e Histoplasma capsulatum) e dei Introduzione
Lecanoromycetes (Xanthoria polycarpa) (Scherrer et al., 2005). Le analisi dei mating in S. cerevisiae hanno fornito un modello di comprensione dei pathways sessuali non solo negli ascomiceti ma anche in molti altri funghi. La struttura molecolare del locus MAT, che si trova sul cromosoma III, è stata caratterizzata per la prima volta in S. cerevisiae, in cui è stato mostrato come isolati a ed α siano distinguibili in base alla sequenza presente al locus MAT (Astell et al., 1981). L’idiomorfo MATα codifica per due proteine distinte, α1 e α2, mentre MATa codifica per la proteina a1. Le informazioni di a ed α si ritrovano anche in altri due loci vicini ai telomeri del cromosoma III: la cassetta HMLα e HMRa. Questi loci si trovano in regioni eterocromatiche, e sono silenziati (non espressi). α1 (α-box motif), α2 (homeodomain motif) e a1 (homeodomain motif) sono regolatori trascrizionali che controllano l’espressione dei geni dei feromoni, dei recettori e di altri fattori coinvolti nel mating. In cellule aploidi MATα, α1 induce l’espressione di funzioni di mating α, mentre α2 agisce da repressore delle funzioni di mating. In cellule aploidi MATa le funzioni di mating a sono espresse costitutivamente. Nelle cellule diploidi, la proteina a1 si lega ad α2 per generare un repressore che silenzia le funzioni aploidi-specifiche, α1 incluso. Una cellula aploide può cambiare mating type rimpiazzando le informazioni al locus MAT con sequenze provenienti da HMLα o da HMRa (Heitman et al., 2007).
1.1.2 Il locus
MAT nei funghi filamentosi
Il locus MAT è stato caratterizzato in molti ascomiceti filamentosi sia omotallici che eterotallici, inclusi membri delle classi dei Sordariomycetes (Fusarium, Gibberella, Neurospora, Podospora, e Magnaporthe), dei Leotiomycetes (Pyrenopeziza e Rhynchosporium), dei Dothideomycetes (Cochliobolus) e degli Eurotiomycetes (Aspergillus, Coccidioides e Histoplasma) (Debuchy and Coppin, 1992; Foster and Fitt, 2003; Fraser and Heitmann, 2006; Glass et al., 1988; Paoletti et al., 2005; Yun et al., 2000; Yun et al., 1999). La nomenclatura utilizzata varia molto da specie a specie, ma la struttura generale è simile. Gli organismi eterotallici hanno un singolo locus MAT con due idiomorfi. Turgeon e Yoder (2000) hanno proposto di designare il locus MAT come MAT1 e i due idiomorfi come MAT1-1 e MAT1.2, e che i geni appartenenti ai due idiomorfi fossero indicati con il simbolo dell’idiomorfo, seguito da un trattino e da un numero (es., MAT1-1-1). L’idiomorfo MAT 1-1 codifica per una proteina con un α-box motif (MAT1-1-1), equivalente a quella di S. cerevisiae. MAT1-1 contiene altri due geni, MAT1-1-2 e MAT1-1-3 (dominio HMG). L’idiomorfo MAT1-2 codifica per la proteina MAT1-2-1 (dominio HMG), equivalente al gene MTLa2 dell’idiomorfo MATa in S. cerevisiae. I geni MAT1-1-1 e MAT1-2-1 regolano il mating in molti ascomiceti filamentosi. MAT1-1-2 e MAT1-1-3 sono richiesti in stadi successivi nel corso dello sviluppo (Heitman et al., 2007). Tra gli ascomiceti filamentosi Introduzione
si trovano molte specie omotalliche; diverse di queste sono strettamente correlate a specie eterotalliche. Le specie omotalliche portano i geni di entrambi gli idiomorfi sullo stesso cromosoma, ed entrambi sono indispensabili per la auto-fertilità (Lee et al., 2003). Per esempio in G. zeae, fungo omotallico, MAT1-1-1, MAT1-1.-2, MAT1-1-3, e MAT1-2-1 si trovano nella stessa posizione sul cromosoma, mentre gli stessi geni in G. fujikuroi, fungo eterotallico, sono dislocati nei due distinti idiomorfi. Inoltre, confrontando i due idiomorfi di F. oxysporum con quelli di G. fujikuroi si evince che i primi codificano per 4 geni MAT omologhi a quelli di G. fujikuroi (Fig.1). Putativi introni di uno si ritrovano anche nell’altro nella stessa posizione (Tab.1). Il confronto delle sequenze ottenute tramite sequenziamento dei prodotti di RT-PCR conferma la rimozione degli introni. Inoltre i risultati di RT-PCR permettono di concludere che i geni di F. oxysporum, fungo asessuato, vengono normalmente espressi. Probabilmente lo studio dei geni MAT potrebbe aiutare a comprendere le cause dell’asessualità di questo fungo (Yun et al., 2000). Anche Candida albicans, ascomicete patogeno per l’uomo del quale non si conosce il ciclo sessuale, possiede i geni MAT (Sharon et al., 1996); questa scoperta avvalora la tesi secondo la quale i funghi asessuati derivino da quelli che invece si riproducono sessualmente ed anche che possano sporadicamente dar luogo a forme di riproduzione sessuale (Taylor et al., 1999).
Figura 1 Organizzazione dei loci MAT nel fungo omotallico G. zeae,
nell’eterotallico G. fujikuroi e nel fungo asessuato F. oxysporum. Le frecce indicano la direzione dei trascritti e i limiti delle ORF; le punte di freccia segnalano gli introni.
Tabella 1 Dimensioni dei prodotti dei geni MAT (numero di aminoacidi) e degli
introni ad essi associati (numero di bp) nei funghi G. zeae, G. fujikuroi e F. oxysporum.
Quale dei due meccanismi (omotallismo o eterotallismo) rappresenti la condizione ancestrale, rimane una delle più importanti questioni finora irrisolte. Nauta and Hoekstra (1992) suggeriscono che nei Sordariomycetes l’evoluzione da etero- a omotallismo sia più probabile rispetto al passaggio opposto. Le sequenze e l’organizzazione degli idiomorfi di N. crassa, P. anserina, F. oxysporum, G. fujikuroi, e M. grisea sono talmente simili da suggerire che tutte queste specie possano derivare da un progenitore comune eterotallico. Un evento di ricombinazione tra sequenze condivise al di fuori dei due idiomorfi potrebbe aver dato luogo al singolo locus MAT che ritroviamo in G. zeae e Sordaria macrospora (Heitman et al., 2007).
1.1.3 Feromoni e recettori nel fungo modello
S. cerevisiae
In S. cerevisiae esistono due mating types, a ed α. Il mating type è determinato dal locus MAT che codifica per proteine che controllano l’espressione di geni specifici. Tra questi geni differenzialmente espressi in cellule a o α ci sono quelli essenziali per il riconoscimento cellula-cellula e la successiva fusione, i geni codificanti per i feromoni e i rispettivi recettori. Le cellule a secernono a-feromone e Ste2 (il recettore di α-feromone), mentre le cellule α secernono α-feromone e Ste3 (il recettore di a-feromone). In seguito alla fusione di cellule a con cellule Introduzione
α vengono silenziati i geni specifici per il mantenimento della condizione aploide e, al contempo, vengono espressi i geni necessari per la meiosi e la produzione di spore. L’interazione tra feromoni e recettori di opposto mating type da luogo ad una serie di risposte tra le quali: arresto del ciclo cellulare in fase G1, alterazioni morfologhiche (formazione di shmoo), induzione dell’espressione di vari geni.
Tra questi si trovano geni che codificano per gli stessi feromoni e recettori, il gene STE6 coinvolto nel trasporto di a-feromone, e geni codificanti per agglutinine a ed α (Herskowitz, 1989).
α-feromone
α-feromone è codificato da due geni strutturali molto simili, MFα1 e MFα2 (Kurjan and Herskowitz, 1982; Singh et al., 1983). I precursori di α-feromone, rispettivamente di 165 e 120 aminoacidi, contengono molte ripetizioni della sequenza di α-feromone. Questi precursori vengono glicosilati e processati seguendo una classica via di segregazione fino a produrre l’α-feromone maturo: la proteasi Kex2 riconosce il legame lys-arg ed è coinvolta nel processamento delle ripetizioni in posizione C-terminale. I residui lys-arg esposti alla proteasi Kex2 vengono rimossi dalla carbossi-peptidasi Kex1. Il risultato è un feromone maturo di 13 aminoacidi (Fig.2) (Fuller et al., 1986).
a-feromone
La struttura di a-feromone è caratterizzata da una naturale idrofobicità conferita dal gruppo isoprenilico al residuo di cisteina C-terminale (Fig. 2). a-feromone è codificato da due geni, MFa1 e MFa2, i quali codificano per precursori di 34 e 36 aminoacidi (Brake et al., 1985; Michaelis and Herskowitz, 1988). Questi possiedono un sito per la prenilazione al C-terminale, il motivo CAAX, dove C sta per cisteina, A per un aminoacido alifatico, e X per un aminoacido qualsiasi. I precursori vanno incontro ad una serie di modifiche post-traduzionali: S-farnesilazione del residuo di cisteina ad opera di Ram2p e Ram1p (farnesil-transferasi α e β), proteolisi del residuo AAX ad opera di Rce1p, carbossimetilazione della cisteina esposta da parte di Ste14p (metil-transferasi) e successivi due step proteolitici da parte di Ste24p (aminopeptidasi 1) e Ste23p (aminopeptidasi 2). Il feromone maturo infine viene secreto direttamente attraverso la membrana via Ste6p, un trasportatore ATP-dipendente (Davey et al., 1998; Kurjan, 1993; Michaelis et al., 1992).
Figura 2 Struttura dei feromoni di S. cerevisiae.
Il recettore Ste2 è strutturalmente correlato all’altro recettore, Ste3, e alla famiglia di recettori rodopsina/β-adrenergiche in quanto sono tutti accomunati dal possedere sette putativi domini transmembrana (Stryer and Bourne, 1986). Ulteriori membri di questa famiglia includono i recettori per l’AMP ciclico (Klein et al., 1988), per la serotonina (Julius et al., 1988) e il peptide neuro-trasmettitore sostanza k (Masu et al., 1987). La struttura dei due recettori è composta da tre domini (Fig.3): il dominio N-terminale, probabilmente extra-cellulare; il dominio centrale, che contiene i sette segmenti transmembrana intervallati; il dominio terminale che probabilmente è intracellulare. Il dominio C-terminale è coinvolto nella regolazione della risposta al feromone ma non è necessario per il legame con il feromone e per la trasduzione del segnale (Konopka and Jenness, 1991).
Figura 3 Struttura primaria e ripiegata dei recettori Ste2 e Ste3 di S. cerevisiae.
Interazione feromone-recettore e trasduzione del segnale
In S. cerevisiae,ma più in generale in tutti i funghi, ci sono vie di trasduzione del segnale ben conservate che controllano aspetti fondamentali per la vita degli stessi, come la crescita, lo sviluppo e la riproduzione. Le cascate MAPK (Mitogen Activated Protein Kinase) sono alcune delle più importanti tra queste vie di trasduzione del segnale (Rispail et al., 2009). Esse sono composte da tre moduli su più livelli che comprendono una MAP Kinase-Kinase-Kinase (MAPKKK), una MAP Kinase-Kinase (MAPKK) ed una MAPK, la quale viene attivata da una Introduzionedoppia fosforilazione a carico dei residui di treonina e tirosina (Chang and Karin, 2001). I recettori Ste2 e Ste3 sono legati ad una proteina G, un complesso eterotrimerico composto da una sub-unità Gα (Gpa1) legata a GDP e alla sub-unità Gβγ (Ste4 e Ste18). Quando un feromone stabilisce un legame con il rispettivo recettore, scatena la dissociazione della subunità Gα dalla sub-unità Gβγ, permettendo a ste4 e ste18 di trasmettere il segnale alle sottostanti componenti della via di trasduzione (Wang and Dohlman, 2004).
La componente sottostante è il fattore Cdc24, il quale attiva la proteina G Cdc42, che a sua volta attiva la chinasi PAK-simile Ste20 e la proteina Ste50, le quali a loro volta cooperano per l’attivazione delle successive componenti. Bem1 è una proteina con dominio SH3 che lega il complesso Ste5 MAPK con attivatori a monte e specifici substrati a valle, consentendo in questo modo una efficiente trasmissione del segnale per l’arresto del ciclo cellulare in fase G1 (Lyon et al., 1996).
Il modulo MAPK del pathway di risposta ai feromoni in S. cerevisiae è composto dalla MAPKKK Ste11, dalla MAPKK Ste7, e dalla MAPK Fus3 (Wang and Dohlman, 2004). Ste11 è attivo nella cascata Fus3 ma anche in quella Kss1 dove fosforila la MAPKK ste7; possiede un dominio α (SAM) coinvolto nell’interazione con Ste50. In S. cerevisiae la MAPK Fus3 è essenziale per il mating mentre il suo ortologo, insieme a quello di Kss1, giocano un ruolo cruciale durante la fase d’infezione in molti Introduzione
funghi patogeni per le piante come M. grisea, F. graminearum e U. maydis (Xu and Hamer, 1996; Jenczmionka et al., 2003; Brachmann et al., 2003). La proteina Ste5 gioca un ruolo essenziale nella via di trasduzione del segnale dei feromoni in S. cerevisiae, in quanto recluta il complesso Ste11-Ste7-Fus3 alla membrana citoplasmatica (Pryciak and Huntress, 1998) e stimola la fosforilazione attraverso cambiamenti conformazionali, effetti di prossimità e oligomerizzazioni (Qi and Elion, 2005).
Una volta fosforilata, la proteina Fus3 attiva gli effettori a valle, ovvero Ste12, Far1 o Sst2, portando all’arresto del ciclo cellulare, alla crescita polarizzata e alla formazione di strutture di fusione specializzate chiamate shmoos (Elion et al., 1993). Ste12 è un importantissimo fattore di trascrizione a valle della cascata di risposta ai feromoni. Esso stabilisce un legame con elementi di risposta ai feromoni (PREs) nelle sequenze di attivazione a monte dei geni target; inoltre, in collaborazione con Tec1, regola i geni coinvolti nella crescita invasiva (Madhani and Fink, 1997).
Far1 è un fattore mediatore dell’arresto del ciclo cellulare in risposta ai feromoni (Peter et al., 1993), e durante la fase di mating è il fattore che regola la crescita polarizzata legando la sub-unità eterotrimerica Gβγ (Butty et al., 1998). Sst2, infine, è un regolatore della trasmissione del segnale di Gpa1, che regola la desensibilizzazione dei feromoni e Introduzione
previene la segnalizzazione indipendente dei recettori (Dohlman et al., 1996). Rispail et al., (2009), nel loro studio hanno messo a confronto la via di trasduzione del segnale dei feromoni di S. cerevisiae con quella di altre nove specie fungine (Fig.4): Ashbya gossypii e Candida albicans (hemiascomycetes), Schizosaccharomyces pombe (archiascomycetes), Aspergillus fumigatus, Fusarium graminearum, Magnaporthe grisea e Neurospora crassa (euascomycetes), Rhyzopus oryzae (zygomycetes) e Ustilago maydis (basidiomycetes). Dal confronto è emerso che mentre la maggior parte dei fattori facenti parte della cascata MAPK risultano perfettamente conservati tra S. cerevisiae e i funghi filamentosi, alcuni componenti come ad esempio la proteina Ste5 sono limitati solo ai Saccharomycotina (Fig.5). L’incorporazione di nuovi domini che in S. cerevisiae sono mancanti, come il dominio RA in Ste11, il residuo di zinco in Ste12, o il dominio omologo alla plecstrina e i domini VWA in Far1, potrebbero rappresentare un adattamento funzionale dei funghi filamentosi dal momento che essi si sono evoluti per occupare differenti nicchie ecologiche, incluso il loro ruolo di agenti patogeni.
Figura 4 Vista schematica della via di trasduzione del segnale dei feromoni (che
condivide alcuni fattori con la via dei nutrienti riportata sulla destra) nelle specie fungine S.cerevisiae, A. gossypii, C. albicans, S. pombe, A. fumigatus, F. graminearum, M. grisea, N. crassa, R. oryzae e U. maydis. I colori indicano il grado di conservazione delle varie componenti: in blu i fattori comuni a tutte le specie in esame; in verde tutti eccetto gli zygomycetes; in arancione tutti eccetto i basidiomycetes, in giallo solo gli hemiascomycetes; in rosso tutti eccetto gli euascomycetes.
Figura 5 Immagine in scala degli ortologhi di Ste12 (A) e Far1 (B), con i domini
bene in evidenza, appartenenti alle specie fungine in esame.
1.1.4 Feromoni e recettori nei funghi filamentosi
Dagli studi finora effettuati risulta che feromoni e recettori sono essenziali per la fertilità sessuale negli ascomiceti eterotallici. In N. crassa la delezione di pre-1, gene codificante per il recettore omologo di Ste2 in S. cerevisiae, causa sterilità femminile del mating type MATa poiché i tricogini risultano incapaci di crescere in direzione degli spermazi e successivamente fondersi (Kim and Borkovich, 2004). La delezione di entrambi i geni precursori dei feromoni causa sterilità nel maschio del corrispondente mating type in quanto gli spermazi non risultano più in grado di attrarre i tricogini femminili (Kim and Borkovich, 2006). Risultati simili si ottengono con i mutanti di P. anserina (Coppin et al., 2005) e C. parasitica (Turina et al., 2003).
Per S. macrospora, ascomicete omotallico, è stata riportata la presenza sia dei due feromoni che dei rispettivi recettori (Mayrhofer et al., 2006), ma la singola mutazione di uno dei feromoni o dei recettori non ha comportato alcun effetto sullo sviluppo di ascospore o corpi fruttiferi. Una doppia mutazione a carico dei feromoni produce una drastica riduzione della auto-fertilità, mentre la doppia mutazione a carico dei recettori porta a una completa sterilità.
Nel fungo omotallico Emericella nidulans, da una singola mutazione a carico di uno dei due recettori risulta una marcata riduzione della auto-fertilità, e la doppia mutazione dei recettori porta alla auto-sterilità.
Nonostante ciò, il doppio mutante rimane in grado di riprodursi con altri individui, suggerendo che i recettori siano richiesti specificatamente per la auto-fertilità (Seo et al., 2004). Fino a tre anni fa il meccanismo della riproduzione sessuale e il ruolo dei feromoni non erano noti in nessuna delle specie appartenenti all’ordine Gibberella/Fusarium.
Per la prima volta nel 2008, Lee et al., hanno verificato la presenza dei geni precursori di feromoni (ppg1 e ppg2) e recettori (pre1 e pre2) nel genoma di G. zeae e grazie ad un test condotto utilizzando costrutti GFP reporter hanno valutato i livelli di espressione dei quattro geni (Tab.2). ppg1, omologo del precursore di α-feromone in S. cerevisiae, risulta fortemente espresso nei conidi in germinazione e nelle ascospore rilasciate dai periteci, e debolmente espresso nelle altre strutture. Il rispettivo recettore, pre2, viene espresso in tutte le strutture eccetto nel micelio non indotto. ppg2, omologo del precursore di a-feromone, risulta non essere mai espresso in nessuna cellula, mentre il rispettivo recettore pre1 viene espresso debolmente solo nelle ascospore mature.
Tabella 2 Saggio di espressione dei precursori dei feromoni e dei recettori di G.
zeae in differenti tipi di strutture di età diverse cresciute su carrot agar. DAI: giorni dopo l’inoculo. L’induzione dello sviluppo sessuale è stata effettuata lavando il micelio con 500 μl di una soluzione 2.5% di Tween 60.
Dal momento che ppg2 e pre1 sono funzionali nei funghi eterotallici è stato ipotizzato che in G. zeae siano vestigia non funzionali del recente cambiamento evolutivo da uno stile di vita eterotallico ad uno omotallico (Yun et al., 2000). Da test effettuati con mutanti di ppg1 e di pre2, nonostante, come dimostra il test di espressione, siano normalmente espressi, risulta che né il feromone né tanto meno il recettore sono indispensabili per lo sviluppo sessuale. Questo modello differisce molto da quello rappresentato dai funghi eterotallici come N. crassa, P. anserina e C. parasitica nei quali recettori e feromoni sono indispensabili per la riproduzione. Ma G. zeae differisce anche dai funghi omotallici come S. Introduzione
macrospora e Aspergillus nidulans, nei quali è richiesto che almeno uno dei recettori sia funzionante. Perciò, G. zeae risulta essere il primo ascomicete in cui è stata dimostrata l’inutilità di feromoni e recettori per quanto riguarda lo sviluppo sessuale (Lee et al., 2008).L’unico ruolo che la coppia ppg1/pre2 appare svolgere è legato alla riproduzione e alla chemio-attrazione di cellule femminili da parte di quelle maschili. Evidentemente G. zeae deve avere un meccanismo alternativo, indipendente dai feromoni, per attivare la via di trasduzione del segnale dei feromoni.
1.2 Profilo di un fungo patogeno:
Fusarium
oxysporum
1.2.1 Biologia
Il genere Fusarium, conosciuto anche grazie ai teleomorfi Nectria e Gibberella, annovera al suo interno fitopatogeni molto noti, caratterizzati da una vasta gamma di strategie di infezione per mezzo delle quali causano gravi malattie in numerose specie vegetali (Desjardins, 2003; Di Pietro et al., 2003; Goswami and Kistler, 2004). Senza ombra di dubbio F. oxysporum viene considerato come la specie economicamente più importante all’interno del genere Fusarium proprio a causa dell’ampio spettro di ospiti vegetali che è in grado di attaccare e le ingenti perdite che può causare quando infetta una pianta.
Pare che F. oxysporum nel corso della sua lunga evoluzione si sia riprodotto, forse esclusivamente, in maniera asessuata. Questa è la ragione per cui al giorno d’oggi non è conosciuto il teleomorfo di questo microrganismo, la cui riproduzione asessuata avviene mediante spore di tre tipi: macroconidi, microconidi e clamidospore (Fig. 6). I macroconidi, dalla caratteristica forma a falce, sono ialini e plurisettati, vengono prodotti su conidiofori riuniti in sporodochi. I microconidi, anch'essi ialini e plurisettati, possono essere mono o bicellulari e sono prodotti su corti conidiofori del micelio aereo. Le clamidospore, Introduzione
strutture particolari di sopravvivenza caratterizzate da una parete spessa e leggermente bruna, consentono al fungo di sopravvivere in stato di quiescenza in condizioni ambientali sfavorevoli, come la carenza idrica o la mancanza di nutrienti. Infatti, con il manifestarsi di queste condizioni ambientali, il fungo attiva la produzione di queste spore, che avviene nelle ife in posizione terminale o intercalare e in singole cellule dei macroconidi.
Le clamidospore restano nello stato di quiescenza anche per diversi anni, fino al manifestarsi delle condizioni ambientali favorevoli, in particolare in presenza di essudati radicali dell'ospite: solo allora queste germinano producendo un ifa che darà origine ad un nuovo micelio (Nelson et al., 1981).
Questo fitopatogeno suscita notevole interesse nella ricerca a causa dell’ampia diffusione in molteplici habitat e poiché dà luogo a notevoli danni alle coltivazioni sia di interesse agrario che floricolo o vivaistico. Tra forme di lotta le più diffuse sono l’utilizzo di varietà resistenti e la disinfezione o induzione di soppressione di suoli contaminati (Michielse and Rep, 2009).
Figura 6 Spore di F. oxysporum: (A) macroconidi; (B) microconidi; (C)
clamidospore.
Dal momento che, fino a prova contraria, si riproduce esclusivamente in maniera asessuata, F. oxysporum viene ritenuto un complesso di specie: una collezione di linee clonali all’interno del genere Fusarium. In quanto tale, costituisce un gruppo cui appartiene anche il complesso di specie F. fujikuroi che annovera specie con rispettivi teleomorfi di Gibberella, come F. verticillioides e F. fujikuroi (Guadet et al., 1989). Nel 2007 il Broad Institute ha portato a termine il sequenziamento del genoma di un isolato di F. oxysporum (http://www.broad.mit.edu/annotation/genome/ fusarium_group/MultiHome.html).
Il 90% del genoma di F. oxysporum può essere allineato con quello di F. verticillioides, e la media della similarità delle sequenze di DNA delle regioni allineate corrisponde al 90%. Ciascuna forma specialis consiste in una o più linee clonali che corrispondono ai gruppi di compatibilità vegetativa (VCGs) (Katan and Di Primo, 1999). Quando una forma specialis annovera diverse linee clonali, generalmente significa che esse Introduzione
non hanno una origine monofiletica; ciò suggerisce che la patogenicità nei confronti di una qualche specie vegetale si è sviluppata molte volte in maniera indipendente (Baayen et al., 2000; O’Donnell et al., 1998). Sebbene l’attenzione di molti patologi vegetali sia rivolta, come è naturale che sia, sugli isolati patogeni, in realtà molti ceppi isolati dal terreno sono non-patogeni (Recorbet et al., 2003); a tutt’oggi non è ancora chiaro se questi ceppi non-patogeni ubiquitari in tutto il mondo possano evolvere in forme patogene, e in che modo ciò possa eventualmente accadere.
1.2.2 La tracheomicosi
F. oxysporum è l’agente causale della tracheomicosi, una malattia letale che mette in atto attraverso l’invasione dell’apparato radicale e la successiva colonizzazione del tessuto xilematico (Fig.7) (Tjamos and Beckman, 1989). Questo microrganismo mostra una apparente interazione gene-per-gene con diversi ospiti vegetali; è possibile che questa interazione gene-per-gene sia correlata all’esistenza di numerosi ceppi ospite-specifici, chiamati formae speciales (Katan and Di Primo, 1999). I siti di infezione sono localizzati soprattutto nelle vicinanze degli apici delle radici principali e laterali.
Figura 7 Fasi di infezione di F. oxysporum su pianta di pomodoro: (A) adesione
alle radici e penetrazione; (B) invasione del tessuto corticale della radice; (C) colonizzazione del sistema vascolare; (D) formazione di clamidospore.
In genere il patogeno penetra attraverso i peli radicali o le cellule dell’epidermide situate nella zona di distensione cellulare, subito dietro il meristema radicale, che è protetto dalla cuffia radicale chiamata anche pileoriza. Il patogeno si muove inter-cellularmente ed extra-cellularmente attraverso i tessuti del parenchima radicale, entrando nel meristema primario e invadendo le trachee differenziate del protostele (MacHardy and Beckman, 1981; Baayen et al., 1989). Studi effettuati (Elgersma et al., 1972; Chambers and Corden, 1963) su piante di Introduzione
pomodoro suscettibili a Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici (Fol) hanno evidenziato che le ife sono confinate nel protoxilema e metaxilema durante le prime fasi di infezione. A questa fase iniziale segue una fase di esplosiva colonizzazione con una enorme produzione di spore, seguita poi da una rapida colonizzazione di tutti gli elementi xilematici sia primari che secondari. All’interno dei vasi xilematici, il patogeno, avendo a disposizione una grande quantità di nutrienti, cresce e sporula molto velocemente. Le prime sostanze accessibili sono le pectine e le cellulose presenti nelle pareti del lume dei vasi, che il fungo riesce a metabolizzare grazie alle cellulasi e pectinasi. Inoltre, nel fluido vascolare sono presenti grandi quantità di carboidrati, aminoacidi e sali minerali facilmente accessibili. Diffondendosi nel sistema vascolare il fungo causa alterazioni del flusso vascolare e rilascia delle tossine responsabili dei principali sintomi: nanismo, appassimento, giallume e necrosi. Queste tossine possono interferire con le risposte di difesa dell’ospite in modo da poterle superare. Questi diversi sintomi si possono manifestare contemporaneamente o in successione. Sintomi analoghi però possono derivare anche da altre malattie, ad esempio i marciumi radicali. Per questo motivo si deve individuare un sintomo più specifico e costante, ovvero l’imbrunimento dell’apparato vascolare, che viene assunto come elemento diagnostico.
1.2.3 La trasduzione del segnale
Utilizzando strategie di genetica diretta e inversa, negli ultimi anni sono stati identificati vari processi e geni coinvolti nella patogenesi (Michielse and Rep, 2009). Può non sorprendere il fatto che i processi di trasduzione del segnale si trovino tra questi, dal momento che, per determinare la malattia, i funghi hanno bisogno di rispondere in maniera appropriata all’ambiente della pianta e adattare la propria morfologia, la fisiologia, il metabolismo e lo spettro di metaboliti e proteine secrete. In F. oxysporum le cascate del segnale cAMP-PKA (cyclic adenosine monophosphate- protein kinase A) e MAPK (mitogen-activated protein kinase) hanno ricoperto un ruolo molto importante in questo processo di adattamento.
Una MAPK (FMK1) e le sub-unità α (FGA1) e β (FGB1) di una proteina G sono indispensabili per una completa patogenicità (Di Pietro et al., 2003). Di recente è stato identificato ed analizzato un secondo gene codificante la sub-unità α (FGA2) di una proteina G. Al contrario di quanto avviene con i mutanti ΔFGA1 di F. oxysporum f.sp. cucumerinum nei quali la patogenicità risulta ridotta, la delezione di FGA2 porta ad una totale perdita di patogenicità nei confronti di piante di cetriolo (Jain et al., 2005). Inoltre le alterazioni nella morfologia delle colonie e nella sporulazione osservate nei mutanti ΔFGA1 non vengono riscontrate nei mutanti ΔFGA2. Queste osservazioni indicano che Fga1 e Fga2 rivestono Introduzione
ruoli distinti, con specifiche funzioni, e che entrambi sono indispensabili per l’adattamento del microrganismo all’ambiente della pianta.
Recentemente è stato studiato il ruolo della trasduzione del segnale nella fusione ifale (VHF) di gruppi di compatibilità vegetativa e il ruolo della VHF nel processo di patogenicità (Rosales and Di Pietro, 2008). Sebbene sia stato rilevato che VHF e patogenicità condividono alcune componenti della via di trasduzione del segnale, la VHF non è indispensabile per la patogenesi, dal momento che il mutante ΔFSO1-mancante del gene FSO1, essenziale perché avvenga una corretta VHF- risulta essere virulento nei confronti di piante di pomodoro. Per cercare di rendere sempre più chiaro il meccanismo di rilevamento e di adattamento del patogeno alla pianta, sarà di notevole importanza scoprire in futuro i segnali e i ligandi che innescano le vie di trasduzione del segnale di cAMP-PKA e MAPK (Michielse and Rep, 2009).
Rispetto a S. cerevisiae in cui è stata ben caratterizzata, in F. oxysporum la via di trasduzione del segnale dei feromoni rimane ad oggi un mistero. Secondo studi di chemiotropismo condotti presso il Dipartimento di Genetica dell’Università di Cordoba, risulta che in F. oxysporum sono presenti due distinte vie di trasduzione del segnale, una dei feromoni e l’altra dei nutrienti (Fig.8).
Figura 8 Confronto delle vie di trasduzione del segnale dei feromoni e dei
nutrienti in S. cerevisiae e in F. oxysporum.
Ad oggi si conoscono solo alcune delle componenti facenti parte della cascata di trasduzione del segnale in queste due vie: Msb2 e Sho1 sono proteine di membrana che sembrano svolgere un ruolo nella ricezione del segnale nella via dei feromoni anche se esse, come appare dagli studi di chemiotropismo, non sono le proteine recettrici dei feromoni; FMK1 è una MAPK indispensabile per la completa patogenicità di F. oxysporum (Di Pietro et al., 2003), e insieme all’effettore Ste12, gioca un ruolo fondamentale nella trasduzione del segnale nella via dei nutrienti.
2. SCOPO DEL LAVORO
L’attività sperimentale che ha permesso la stesura della seguente tesi di laurea è stata svolta presso i laboratori del Dipartimento di Genetica dell’Università di Cordoba (Spagna) sotto la guida del Prof. Antonio Di Pietro e del Dott. David Turrà.
Scopo delle ricerche condotte è stato quello di studiare la via di trasduzione del segnale dei feromoni in Fusarium oxysporum, in particolare indagando circa il possibile ruolo della proteina di membrana Ste2 come recettore di α-feromone, così come già noto in S. cerevisiae. A tal fine, l’attività sperimentale ha previsto: l’individuazione, mediante ricerche in banca dati, di un gene in F. oxysporum putativo omologo di ste2; l’ottenimento, mediante inattivazione genica, di mutanti Δste2 del ceppo F. oxysporum f. sp. lycopersici (Fol) 4287 WT e del suo mutante Δfmk1; la caratterizzazione fenotipica dei mutanti ottenuti, mediante test fisiologici e di patogenicità. Tra questi test in particolare quello del chemiotropismo ha ricoperto un ruolo determinante, permettendo di valutare in via definitiva attraverso quale recettore fosse recepito il segnale di α-feromone.
Infine, è stata condotta un’analisi qRT-PCR per valutare i livelli di espressione dei geni putativi omologhi di ste2, ste3, α-feromone e
feromone (previamente identificati mediante ricerche in banca dati) in Fol 4287 WT.
3. MATERIALI E METODI
3.1 Materiale Biologico
Il materiale biologico utilizzato nel presente lavoro e di seguito riportato, è depositato presso il Dipartimento di Genetica dell’Università di Cordoba (Spagna).
Funghi
- Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici (Fol) (DGA):
• Fol 4287 WT
• Fol 4287 Δfmk1: Trasformante di Fol 4287 WT silenziato nel gene fmk, il quale codifica per una mapkinasi.
Batteri
- Escherichia coli: ceppo portante il plasmide pGem-T-M13 contenente
il gene di resistenza all’Igromicina (hph)
Piante
- Lycopersicon esculentum cv Monika: suscettibile a Fol razza 2
3.2 Substrati di coltura
Tutti i substrati di coltura di seguito riportati sono stati utilizzati per l’accrescimento e il mantenimento degli isolati microbici. Tali substrati hanno subito un processo di sterilizzazione in autoclave a 1,2 atm e 121°C per 20 minuti.
• Mezzo liquido LB: Triptone (10g . L-1); Estratto di lievito (5g . L-1);
NaCl (5g . L-1); H2O (fino a volume).
• Potato Dextrose Broth (PDB): PDB (Difco) (24g . L-1); H2O (fino a
volume). Quando richiesto aggiungere Igromicina B (20µg . ml-1) o
Fleomicina (2μg . ml-1) al substrato una volta raffreddato.
• Potato Dextrose Agar (PDA): PDA (Difco) (39g . L-1); H2O (fino a
volume). Quando richiesto aggiungere Igromicina B (55µg . ml-1) o
Fleomicina (5.5μg . ml-1) al substrato una volta raffreddato.
• Top-Agar (0,4%): Agar (0,4 g. L-1); H2O (fino a volume).
• Mezzo Minimo (MM) di rigenerazione: K2HPO4 (1g . L-1); MgSO4
7H2O (0,5g . L-1); KCl (0,5g . L-1); NaNO3 (2g. L-1); Glucosio (20g . L-1);
Saccarosio (200g . L-1); Agar (Oxoid) (15g . L-1); H2O (fino a volume).
• MM Puhalla NaNO3 (25 mM): K2HPO4 (1g . L-1); MgSO4 7H2O (0,5g .
L-1); KCl (0,5g . L-1); NaNO3 (2,125g. L-1); Saccarosio (30g . L-1); Agar
• YPGA (NaCl): Estratto di lievito (3g . L-1); Peptone (10g . L-1); Glucosio
(20g . L-1); Agar (Oxoid) (15g . L-1); NaCl (0,4M, 0,8M o 1,2M); H2O
(fino a volume).
• Mezzo per analisi di espressione qRT-PCR: PDB (20ml . L-1); Acido
glutammico 25 mM (4,224g . L-1); H2O (fino a volume).
• SM: MgSO4 7H2O (0,2g . L-1); KH2PO4 (0,4g . L-1); KCl (0,2g . L-1); FeSO4
(0,01g . L-1); ZnSO4 (0,01g . L-1); MnSO4 (0,01g . L-1); H2O (fino a
volume). Quando richiesto aggiungere Glucosio (10g. L-1) (SM+C),
NH4NO3 (1g. L-1) (SM+N), o entrambi (SM+C+N).
• SM-MES: MgSO4 7H2O (0,2g . L-1); KH2PO4 (0,4g . L-1); KCl (0,2g . L-1);
FeSO4 (0,01g . L-1); ZnSO4 (0,01g . L-1); MnSO4 (0,01g . L-1); Glucosio
(10g. L-1); NH4NO3 (1g. L-1); MES 50 mM (0,66g H2O. L-1); (fino a
volume).
3.3 Soluzioni e composti chimici
Le soluzioni di seguito riportate hanno subito un processo di sterilizzazione in autoclave a 1,2 atm e 121°C per 20 minuti, oppure mediante filtrazione attraverso filtri con pori di 0,22 μm di diametro.
• gDNA extraction Buffer CTAB: Tris-Base (1.21 g); EDTA (0,744 g);
NaCl (8.18 g); CTAB (2 g); H20 (50 ml). Sciogliere a 60°C e portare a
pH=8.00 con NaOH, conservare a 37°C dopo la sterilizzazione.
• STET: Tris HCl 50mM; EDTA 50mM; Triton X-100 0,1% (v/v);
Saccarosio 8% (p/v). Correggere a pH=8.0.
• STC: Sorbitolo 0,8M (188 ml); CaCl2 2H20 50mM (10 ml); Tris HCl 1M
pH=7.5 (2 ml).
• PEG: Peg 4000 60% (30 g); MOPS 0,6M (6.279 g); H20 (10 ml).
Scaldare a 50°C e sterilizzare per filtrazione.
• TEC: Tris 1M pH=7.5 (0,5 ml); EDTA 0.5M (0.1 ml); H20 (48 ml). Dopo
la sterilizzazione aggiungere CaCl2 1M (2 ml).
• OM: MgSO4 7H20 1.2M (180 ml); Na2HPO4 0.1M (20 ml). Portare a
pH=5.8-6.0 con acido ortofosforico e sterilizzare per filtrazione.
• Tampone 10x SSC: NaCl 1.5M; Citrato sodico 0.15M. Correggere a
pH= 7.0.
• Buffer 1: acido maleico 0.1M; NaCl 0.15M. Correggere a pH=7.5. • Buffer 2: agente bloccante (1% p/v) (Roche) in Buffer 1
• Buffer 3: Tris-HCl 0.1M; NaCl 0.1M. Correggere a pH=9.5.
• Rosso congo (CR) (Sigma): Rosso congo 25 mg/ml (1% p/v in H20).
• Bianco di calcofluoro (CFW) (Sigma): Bianco di calcofluoro 25 mg/ml
(1% p/v in H20); KOH (0.5% p/v); glicerolo (83% v/v).
3.4 Oligonucleotidi sintetici
I primers utilizzati in questo lavoro per le reazioni di PCR (Tab. 3) sono stati disegnati con l’aiuto del programma Oligo (versione 6.65, Molecular Biology Insight, Inc. USA) analizzando di ciascuno di essi la stabilità interna, la formazione di dimeri e forcine, così come diversi parametri fisici e chimici (Tm, Td, % G+C, % A+T). Gli oligonucleotidi sono stati sintetizzati da diverse case commerciali (MWG-Biotech e Bonsai Technologies).
Tabella 3 Sequenze degli oligo utilizzati per le reazioni di PCR.
Utilizzo Primer Sequenza 5’-3’
Igromicina (hph) gpdA15B CGAGACCTAATACAGCCCCT trpter8B GGATCCAAACAAGTGTACCTGTGCATTC Hyg-G CGTTGCAAGACCTGCCTGAA Hyg-Y GGATGCCTCCGCTCGAAGTA knockout ste2
Ste2 PFO GCAGGCACAAAGAACAGCAAT
Ste2 PFN GTGGCAGAGGAGAGAGCTATAG Ste2 PFN2 ATTACACCAGCAGTGTTTGCC Ste2 PR TAAAGATTGGAAGTGAAAGGGG Ste2 PRGPDA15B TGGTCGTTGTAGGGGCTGTATTAGG TCTCGATAAAGATTGGAAGTGAAA GGGG Ste2 TR TCAACATCAACAAGCGAAAGAG Ste2 TRN AACTTAGGGGCTCTGAGGATG
Ste2 TFTrpter8B TTTACCCAGAATGCACAGGTACACTTGTTT
AGACCAAAACAAAACTTCTAGCG qRT-PCR act-2 GAGGGACCGCTCTCGTCGT act-q6 GGAGATCCAGACTGCCGCTCAG Ste2-for CTCATCTGGCATCTCATCTC Ste2-rev AGGGTGAGGGATGCTGCTT Ste3-for TATGGTCTTCTTCGTCCTGG Ste3-rev CAAAGGGCTGAAGAGGAAATG Alpha-for AACGCCCTCCACGCAACTC Alpha-rev AGCATCGGGGAAGAAGGTTT Afer-for CCTTCCACCAAGAACACCAC Afer-rev GGGGTTTGACCGTTGGCAG Materiali e metodi
3.5 Condizioni di crescita e mantenimento
degli organismi
Escherichia coli
Gli isolati batterici sono stati incubati a 37°C in colture liquide LB +Ampicillina (50 μg/ml) mantenute in agitazione a 120-250 rpm. La prolungata conservazione degli stessi è stata effettuata a -80°C in mezzo liquido LB con glicerolo al 15% (v/v).
Fusarium oxysporum
Gli isolati fungini sono stati incubati a 28°C e, nel caso di mezzi colturali liquidi, la coltura è stata mantenuta in agitazione a 170 rpm. La conservazione dei diversi ceppi fungini è stata effettuata filtrando una coltura di 4-5 giorni cresciuta in PDB, attraverso un filtro di naylon (Monodur, diametro dei pori 10-15 µm) per separare il micelio dalle spore. Il filtrato è stato centrifugato a 12000 rpm per 10 minuti. Il pellet (microspore) è stato sospeso in acqua sterile e glicerolo al 30% (v/v) e conservato a -80°C. Questa sospensione di spore è stata utilizzata come inoculo per ottenere spore fresche per i diversi saggi sperimentali. Per Fol 4287 Δfmk1 vale la stessa procedura anche se è necessario aggiungere fleomicina (2μg . ml-1) al PDB e portare a pH=8 con NaOH
10N.
Lycopersicon esculentum
Per ottenere le plantule di pomodoro da utilizzare nel corso dell’attività sperimentale, sono stati sterilizzati i semi in ipoclorito di sodio al 20% per 20 minuti, successivamente lavati tre volte con acqua distillata per 10 minuti e seminati in vermiculite. Successivamente sono stati incubati a 28°C nella camera di crescita con tubi al neon da 36W, con un fotoperiodo di 14 ore di luce.
3.6 Coltura dei campioni per analisi di
espressione qRT-PCR
Tramite analisi qRT-PCR è stata investigata l’espressione di 4 geni (ste2, ste3, α-feromone e a-feromone) di colonie di Fol 4287 WT cresciute in differente substrati, in particolare in PDB (20 ml . L-1)+acido glutammico
25mM con il quale sono stati effettuati i vari time course (T0, T6, T12, T24,
T48, T72, T96), ovvero il tempo (espresso in ore) durante il quale le spore
fresche sono state lasciate a incubare nel suddetto substrato di crescita. Inoltre dai T24 sono stati eseguiti switches per ulteriori 24 ore in substrato povero SM, in SM+C, in SM+N e in SM+C+N (§ 3.2). Per ogni time course e per ognuno dei substrati di crescita utilizzati è stato allestito un triplicato biologico al fine di conferire valenza statistica ai risultati ottenuti. Nel dettaglio, spore fresche di Fol 4287 WT filtrate a partire da una coltura in PDB così come descritto nel capitolo 3.5, sono state utilizzate come inoculo per la messa in coltura dei campioni per le analisi di espressione. I T0 sono stati ottenuti semplicemente
congelando in N2 liquido parte delle spore non appena filtrate dalla
coltura in PDB e poi conservate a -80°C. Per i rimanenti time course e per i vari switches, invece, sono state inoculate 2.5.106 spore.ml-1 e, al
momento della filtrazione, si è proceduto rapidamente come descritto per T0. I campioni così ottenuti sono stati utilizzati per l’estrazione di
3.7 Isolamento degli acidi nucleici
3.7.1 Estrazione del DNA plasmidico da
Escherichia coli
(minipreps)
L’estrazione del DNA plasmidico è stata effettuata secondo il seguente protocollo a partire da una coltura batterica (§ 3.5) di 12-14 ore:
1. Centrifugare i campioni per 3 minuti a 12000 rpm.
2. Scartare il surnatante e risospendere il pellet in 200 μl di STET. 3. Aggiungere 4 μl di lisozima (50 mg.ml-1) per provocare la lisi
cellulare e 2 μl di RNasi A (10 mg.ml-1) per eliminare eventuali
contaminazioni di RNA.
4. Incubare a temperatura ambiente per 10 minuti.
5. Incubare a 100°C per 45 secondi e successivamente centrifugare per 10 minuti a 12000g.
6. Recuperare il surnatante e aggiungere 10 μl di CTAB per far precipitare il DNA.
7. Incubare a temperatura ambiente per 5 minuti.
8. Centrifugare per 10 minuti a 12000g e scartare il surnatante.
9. Aggiungere 300 μl di una soluzione NaCl 1.2M, 750 μl di etanolo puro freddo e omogeneizzare bene.
10.Centrifugare per 10 minuti a 12000g, scartare il surnatante e lavare il pellet con etanolo 70% (v/v).
11.Lasciare seccare i campioni sotto cappa il tempo necessario e infine risospendere il pellet delicatamente in 20 μl di H2O mq.
3.7.2 Estrazione del DNA da
Fusarium oxysporum con CTAB
Il DNA degli isolati fungini utilizzati in questo lavoro è stato estratto nel seguente modo:
1. Per mezzo di un pestello polverizzare il micelio, ottenuto nelle modalità precedentemente descritte (§ 3.5), in un mortaio contenente azoto liquido e raccoglierlo con una spatola in un tubo eppendorf da 2 ml (anch’essi mantenuti in azoto liquido per evitare il più possibile sbalzi di temperatura che potrebbero compromettere l’integrità degli acidi nucleici).
2. Aggiungere 1 ml di buffer di estrazione gDNA CTAB e vortexare il tubo per rendere omogenea la soluzione.
3. Sotto una cappa aspirante aggiungere 4 μl di β-mercaptoetanolo e portare ad un volume di 2 ml con cloroformio:octanolo (24:1). 4. Invertire e vortexare il tubo per rendere omogenea la soluzione e
incubare a 65ºC per 30 minuti.
5. Incubare a temperatura ambiente per 15 minuti, vortexando ad intervalli regolari.
6. Centrifugare per 5 minuti a 13400 rpm. Dopodichè raccogliere il surnatante e trasferirlo in un nuovo tubo eppendorf.
7. Aggiungere 1 ml di etanolo puro e incubare a -20º C per 10 minuti.
8. Centrifugare il campione per 5 minuti a 13400 rpm e successivamente scartare il surnatante.
9. Aggiugnere 500 μl di etanolo puro, centrifugare di nuovo per 5 minuti a 13400 rpm e scartare il surnatante.
10.Porre il campione a seccare in uno speedvac per 10 minuti.
11.Risospendere il pellet in 50 μl di H2O mq previamente mantenuta
a una temperatura di 37º C a bagno maria.
12.Aggiungere 4 μl di RNAasi (20 mg/ml) e incubare per 60 minuti in una stufa a 37ºC.
13.Quantificare le concentrazioni di DNA ottenute per i vari campioni con lettura al Nanodrop ed elettroforesi in gel di agarosio 0,7%.
3.7.3 Estrazione del RNA da
Fusarium oxysporum con
Tripure
L’RNA degli isolati fungini utilizzati in questo lavoro è stato estratto nel seguente modo:
1. Per mezzo di un pestello polverizzare il micelio, ottenuto nelle modalità precedentemente descritte (§ 3.5), in un mortaio contenente azoto liquido e raccoglierlo con una spatola in un tubo Materiali e metodi
evitare il più possibile sbalzi di temperatura che potrebbero compromettere l’integrità degli acidi nucleici).
2. Avendo l’accortezza di mantenere sempre i campioni in ghiaccio aggiungere 1 ml di Tripure Isolation Reagent (Roche) a ciascun campione, invertire e vortexare il tubo per rendere omogenea la soluzione.
3. Incubare per 5 minuti in ghiaccio.
4. Centrifugare per 10 minuti a 13000 rpm ad una temperatura di 4ºC.
5. Raccogliere il surnatante e trasferirlo in un nuovo tubo eppendorf. 6. Aggiungere 200 μl di cloroformio.
7. Agitare per 15 secondi.
8. Incubare per 5 minuti in ghiaccio.
9. Centrifugare per 15 minuti a 13000 rpm ad una temperatura di 4ºC.
10.Raccogliere il surnatante, trasferirlo in un tubo eppendorf da 1,5 ml e aggiungere 0,6 ml di isopropanolo.
11.Mescolare per inversione, e incubare per 10 minuti in ghiaccio. 12.Centrifugare per 10 minuti a 13000 rpm ad una temperatura di
4ºC.
13.Eliminare il surnatante e aggiungere 1 ml di EtOH 75%.
14.Centrifugare per 5 minuti a 13000 rpm ad una temperatura di 4ºC.
15.Eliminare il surnatante e lasciare seccare i campioni sotto cappa. 16.Risospendere il pellet in 50 μl di H2O mq previamente mantenuta
a bagno maria ad una temperatura di 60º C. 17.Incubare per 15 minuti a 60º C.
18.Quantificare le concentrazioni di RNA ottenute per i vari campioni con lettura al Nanodrop ed elettroforesi in gel di agarosio 1,5%.
3.8 Quantificazione degli acidi nucleici
3.8.1 Quantificazione mediante elettroforesi
La separazione delle molecole degli acidi nucleici è stata effettuata mediante elettroforesi in gel di agarosio (“Agarose SPI”, Duchefa) disciolto in buffer TAE; sono stati preparati gel di agarosio allo 0,7% per separare le molecole di DNA, e all’1,5% per quelle di RNA. Per poter visualizzare gli acidi nucleici al transilluminatore con luce UV, è stato aggiunto bromuro di etidio (0.5 µgmL-1). Ogni campione è stato
mescolato con il tampone di caricamento in proporzione di 4:1 (v/v). Le corse elettroforetiche sono state effettuate in camere orizzontali con tampone TAE, ad un voltaggio costante di 1-4 Vcm-1.
I gel sono stati fotografati con una fotocamera digitale Kodak modello DC290 con filtro Wratten 22A. L'illuminazione inferiore era data da un transilluminatore a luce ultravioletta modello TCX (Vilber Lourmat). Per stimare la lunghezza dei frammenti di DNA è stato utilizzato il Marker Quick-Load® 1kb DNA Ladder (frammenti da 0.5 a 10 kb).
3.8.2 Quantificazione mediante spettrofotometro
La concentrazione dei campioni di DNA e RNA è stata determinata attraverso la densità ottica a una lunghezza d'onda di 260 nm, usando uno spettrofotometro Nanodrop® ND-1000.
3.9 Reazione a catena della polimerasi (PCR)
3.9.1 PCR-standard
Per l’amplificazione standard del DNA è stata utilizzata una polimerasi termostabile del kit Expand High Fidelity PCR System (Roche), che permette di evitare l’introduzione di nucletotidi erronei durante la reazione di amplificazione. La reazione è stata effettuata nelle condizioni descritte nella tabella di seguito riportata.
Tabella 4 Condizioni di amplificazione per la PCR standard. Tan: temperatura
alla quale i primers si appaiano all’elica di DNA stampo che varia tra 61-63°C; text: tempo di estensione della reazione, calcolato facendo corrispondere 1
minuto di estensione ad ogni kb di prodotto.
Fasi Temperatura Tempo N° di cicli
Denaturazione iniziale 94°C 5 min 1 Denaturazione 94°C 35 s Annealing Tan 35s 35 Extension 72°C text
Extension finale 72°C 7 min 1
Hold 10°C ∞
-Il mix di reazione era composto da:
• 2 mM di MgCl2
• 0.2 mM di ciascuno dei dNTPs
• 0.1 U.μl-1 di polimerasi High Fidelity
• Buffer 2x (Roche)
• DNA variabile da 50 a 200 ng
3.9.2 Trascrizione inversa con Oligo dT
Prima di procedere con la trascrizione inversa del filamento di RNA è stato necessario eliminare possibili residui di DNA dai campioni, attraverso l’impiego dell’enzima DNAsi. Inizialmente è stato preparato il seguente mix di reazione:
• 1 μg RNA • 1 μl di buffer • 1 μl di DNAsi
Successivamente, la procedura ha previsto le seguenti reazioni: 1. incubare a 37º C per 30 minuti.
2. aggiungere 1 μl di EDTA 25 mM. 3. incubare a 65º C per 10 minuti.
Eliminati gli eventuali residui di DNA, è possibile procedere con il protocollo per la trascrizione inversa:
1. aggiungere 100 pmoli di Oligo dT, dNTPs 0.4 mM e H2O
deionizzata fino a 12 μl.
2. incubare a 65º C per 5 minuti. 3. incubare in ghiaccio per 2 minuti.
4. sottoporre i campioni ad un rapido spin in centrifuga alla massima velocità.
5. aggiungere buffer 5x (Invitrogen), Ditiotreitolo 5 mM (DTT) e 4 U.μl-1 di RNA guard (Amersham).
6. incubare a 37º C per 2 minuti.
7. aggiungere la trascrittasi inversa M-MLV (10 U.μl-1) (Invitrogen).
8. incubare a 37°C per 50 minuti.
9. incubare a 70°C per 15 minuti al fine di inattivare l’enzima. I campioni così ottenuti possono essere conservati a -80°C.
3.9.3 qRT-PCR
In una PCR quantitativa in tempo reale il numero di cicli necessario per raggiungere una certa quantità di ampliconi è proporzionale alla quantità di target iniziale. La quantità di ampliconi può essere arbitrariamente scelta in un qualunque punto dell’amplificazione esponenziale. Tutto ciò si basa sul presupposto che la PCR si comporti in maniera ideale, ovvero che il numero di ampliconi ad ogni ciclo di amplificazione raddoppi.
La quantificazione relativa ad un campione di riferimento (gene housekeeping) è fattibile solo se l’efficienza di amplificazione del gene di interesse è ragionevolmente simile a quella del gene di riferimento. Per questo, prima di poter procedere con la qRT-PCR è necessario testare l’efficienza dei primers, che in seguito verranno utilizzati per osservare i livelli di espressione dei quattro geni di interesse. Infatti per far si che si possano quantificare le differenze nell’espressione dei diversi mRNA è necessario che l’efficienza di amplificazione dei primers sia omogenea: in questo modo la reazione di amplificazione esponenziale della PCR sarà in rapporto lineare con le quantità di mRNA stampo utilizzate per la reazione.
Le reazioni di PCR sono state realizzate in triplicato, così da avere valenza statistica, e nelle condizioni indicate nella Tab. 5. Sono state utilizzate piastre multipozzetto da 96 pozzetti (BioRad) in un termociclatore iCycler iQ Real-time PCR System (BioRad). Per la reazione è stata preparata una mix con i seguenti reagenti per un volume finale di 15 μl:
• 7,5 μl iQ SYBR Green Supermix (BioRad) • 300 nM Primer 1
• 300 nM Primer 2 • 1-5 μl di cDNA
Le coppie di primers utilizzate nella reazione hanno amplificato i seguenti prodotti: 1. ste2: 199 bp 2. ste3: 302 bp 3. α-pheromone: 175 bp 4. a-pheromone: 127 bp
Una volta conclusa la PCR è stata realizzata una curva di denaturazione per analizzare i prodotti della reazione; per fare ciò è stato programmato il termociclatore in maniera tale da produrre un aumento di 0.5°C ogni 10 secondi, partendo da 55°C e salendo fino a 95°C.
Tabella 5 Condizioni di amplicazione per la qRT-PCR.
Fasi Temperatura Tempo N° di cicli
Denaturazione iniziale 94°C 5 min 1 Denaturazione 94°C 30 s Annealing 60°C 30 s 40 Extension 72°C 30 s Emissione di fluorescenza 80°C 20 s
Per il calcolo dell’efficienza (E) delle reazioni di qRT-PCR sono state Materiali e metodi
valore di E (che deve essere compreso tra 1.8 e 2.2 per assicurare condizioni di reazione ottimali) è stato calcolato dal coefficiente angolare della retta ottenuta dopo aver rappresentato il Log10 della
quantità di cDNA usato per l’amplificazione rispetto al ciclo soglia (Ct) di amplificazione, secondo l’equazione:
E=10(-1/coefficiente angolare)
I livelli di espressione relativa sono stati calcolati seguendo il metodo del 2-ΔΔCt (Livak and Schmittgen, 2001; Pfaffl, 2001):
Ri=2-ΔΔCt ΔΔCt=(Cti-Ctc)Tto-(Cti-Ctc)Rif
Ri: espressione relativa del gene di interesse rispetto al gene controllo I: gene di interesse
C: gene controllo
Rif: condizioni di riferimento Tto: condizioni di trattamento
3.10 Taglio ed eluizione di bande da gel di
agarosio
Laddove è risultato impossibile ottenere prodotti di amplificazione specifici si è proceduto al recupero delle bande di interesse direttamente da gel e successiva eluizione del DNA amplificato seguendo questo protocollo:
1. Per mezzo di un bisturi asportare dal gel di agarosio le bande di interesse e porle in eppendorf da 1,5 ml.
2. Pesare i campioni prelevati e aggiungere 100 μl della soluzione “Gene clean turbo salt solution” ogni 100 mg di campione.
3. Incubare a 55º C per il tempo necessario affinché le bande si sciolgano, ogni tanto invertendo i campioni per facilitare il processo.
4. Trasferire massimo 600 μl dei campioni in appositi “Gene clean turbo cartridge” dotati di filtro.
5. Centrifugare per 5 minuti a 14000 rpm.
6. Eliminare la fase liquida e ripetere le fasi 4 e 5 fino ad esaurimento dei volumi dei campioni.
7. Aggiungere 500 μl di “Turbo wash solution”. 8. Centrifugare per 5 minuti a 14000 rpm. 9. Eliminare la fase liquida.
10.Centrifugare per 4 minuti a 14000 rpm. 11.Passare il filtro in un nuovo tubo eppendorf.
12.Aggiungere 40 μl di “Gene clean turbo elution solution”. 13.Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
14.Centrifugare per 1 minuto a 14000 rpm. 15.Ripetere le fasi 12, 13 e 14.
16.Quantificare le concentrazioni di DNA ottenute per i vari campioni con lettura al Nanodrop ed elettroforesi in gel di agarosio.
17.Conservare i campioni a -23º C.
3.11 Costruzione dell’inserto per la
trasformazione
I ceppi Fol 4287 WT e Fol 4287 Δfmk1 sono stati trasformati eseguendo il knock-out del gene ste2 (Fig. 9), il quale è stato sostituito con il gene per la resistenza all’Igromicina (hph) (Fig. 10), utilizzato come marker selettivo. L’inserto di trasformazione (4822 bp) è costituito dalle regioni fiancheggianti il gene ste2 contenenti al loro interno il gene hph di resistenza all’antibiotico. Dal momento che la trasformazione dei protoplasti è risultata difficoltosa proprio per la notevole grandezza dell’nserto (nei gel di agarosio veniva riportata la presenza di frammenti aspecifici nonostante l’aumento della temperatura di annealing nella reazione di amplificazione), si è scelto di ovviare a questo problema e rendere più semplice la trasformazione avvalendoci della tecnica splitmarker, costruendo cioè non un singolo inserto bensì dividendolo in due parti: la regione fiancheggiante (Flanking) 5’, il promotore insieme a parte della cassetta hph (3096 bp), e la regione fiancheggiante (Flanking) 3’, il terminatore e la parte della cassetta hph mancante (2410 bp). Questi due inserti andranno ad ibridarsi e complementarsi all’interno dei protoplasti sostituendo interamente il gene ste2 che risulterà così silenziato.
Figura 9 Locus ste2 in Fol.
Figura 10 Inserto di trasformazione per il knock-out del gene ste2 in Fol 4287
WT e Fol 4287 Δfmk1.
hph
1020 bp
Flank 3’
996 bp
Flank 5’
1068 bp
1160 bp
gpdA
trpter
550 bp
Inizialmente sono state amplificate le regioni fiancheggianti 5’ e 3’ del gene ste2 utilizzando il protocollo di PCR precedentemente descritto. Sono stati impiegati 50 ng di gDNA del ceppo Fol 4287 WT ed i seguenti primers:
1. Flanking 5’: Ste2 PFO + Ste2 PRGPDA15B 2. Flanking 3’: Ste2 TFTrpter8B + Ste2 TR
Successivamente i prodotti di PCR sono stati quantificati mediante lettura allo spettrofotometro e corsa elettroforetica.
Il gene di resistenza all’Igromicina (hph) è stato ottenuto tramite una PCR-standard del plasmide pGem-T-M13. Sono stati utilizzati 25 ng di pDNA e i primers gpdA15B e trpter8B. Anche questo prodotto di PCR è stato quantificato nelle modalità precedentemente descritte.
