5.3 Congelamento e scongelamento
6.1 Saggio del Ca 2+
Sia lo ione calcio sia cAMP sono secondi messaggeri fondamentali nella cascata di segnali
postsinaptici associata al sistema glutammatergico; di conseguenza è stato di interesse valutare una loro potenziale variazione in presenza di T1AM.
Mediante il Cayman Chemical Calcium Assay kit è stata valutata la concentrazione intracellulare di Ca2+ nelle linee cellulari NG108-15 e U87-MG in seguito a trattamento con T1AM.
Il trattamento è stato eseguito con T1AM per 24h a concentrazioni diverse, rispettivamente con 0.1µM, 1µM e 10 µM. Il dosaggio è stato effettuato sul lisato cellulare e il valore della
concentrazione è stato normalizzato rispetto alla quantità di proteine totali presenti nel campione. In figura 12 sono illustrati i risultati ottenuti nelle due linee cellulari: complessivamente sia nelle NG108-15 sia nelle cellule U87-MG non si osservano variazioni significative della concentrazione di calcio intracellulare alle varie dosi di T1AM analizzate. Nella linea NG108-15 si osserva una tendenza alla riduzione che però, come precedentemente indicato, non raggiunge la significatività.
Figura 12: Saggio del calcio sulle cellule NG108-15 e U87-MG trattate con T1AM a diverse concentrazioni 0.1 µM, 1µM e 10µM per 24h. (Control=DMEM + DMSO; i valori sono espressi come media ± SEM; n=4 per gruppo).
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6.2 Dosaggio dell’AMPciclico
Il secondo messaggero cAMP è una molecola che presenta un’emivita molto breve. Nel saggio abbiamo dosato la sua concentrazione dopo un trattamento di 24h con T1AM a diverse
concentrazioni (0.1µM, 1µM e 10 µM), allineandoci con le tempistiche delle altre procedure sperimentali. La reazione di sintesi del cAMP è catalizzata dall’adenilato ciclasi che utilizza come substrato ATP. Il segnale del cAMP è neutralizzato dalle fosfodiesterasi che idrolizza la molecola ad AMP. Di conseguenza, la concentrazione di cAMP presente nella cellula in un determinato momento è funzione del rapporto tra le velocità di catalisi dei due enzimi: la sua velocità di sintesi e la sua velocità di idrolisi. La biosegnalazione associata al cAMP e, quindi, la sua concentrazione è stata trovata spesso modificata in numerose patologie croniche, tra cui asma, tumori, diabete, depressione e patologie autoimmuni.
Anche in questo saggio, la produzione di cAMP è stata misurata nel lisato cellulare e la
concentrazione è stata normalizzata rispetto alle proteine totali cellulari. Come indicato nei grafici di figura 13, nella linea U87-MG si evidenzia una variazione significativa di cAMP ad una
concentrazione di T1AM 0.1 µM, mentre nella linea NG108-15 non si osservano variazioni significative della concentrazione di cAMP.
Figura 13: Saggio cAMP NG108-15 e U87-MG trattate con T1AM a diverse concentrazioni 0.1 µM, 1µM e 10µM per 24h. (Control=DMEM + DMSO. I valori sono espressi come media ± SEM di 2-3 esperimenti. n=5 per gruppo.)
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6.3 Western blot
Gli esperimenti condotti tramite western blotting hanno portato a completare e concludere
un’indagine precedentemente avviata in altre tesi sperimentali, continuando a porre a confronto gli effetti della T1AM sulla variazione di espressione delle proteine nelle linee cellulari utilizzate come modelli in questo lavoro di tesi sperimentale, NG108-15 e U87-MG.
Le proteine di cui è stata analizzata la variazione di espressione sono le seguenti: ERK e p-ERK, PKC, CaMKII e pCaMKII, CREB e p-CREB, c-FOS e SIRT-1.
Per la valutazione dell’espressione e della fosforilazione delle principali proteine d’interesse è stato effettuato un Western Blot su lisati provenienti da cellule che sono state infuse con T1AM, a
concentrazioni 0.1µM, 1µM e 10 µM, per una durata di 24h, come descritto in ‘Materiali e Metodi’.
6.3.1 NG 108-15
Nelle cellule NG108-15 è stata valutata la variazione di ERK, pERK e SIRT-1 in risposta al T1AM (0,1 µM, 1 µM e 10 µM).
La proteina ERK non ha subito variazioni significative in seguito al trattamento con la T1AM.
Figura 14: Blot rappresentativo e densità ottica di ERK. Variazione dell’espressione proteica di ERK in cellule NG 108-15
trattate con T1AM a concentrazioni di 0,1 µM, 1 µM e 10 µM. (Control=DMEM+DMSO; i valori sono espressi come media ± SEM; n=4 per gruppo).
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La forma fosforilata di ERK (pERK), in figura 15, non ha mostrato variazioni in risposta al trattamento con T1AM.
Come indicato in figura 16, è stato ottenuto lo stesso risultato per l’analisi del rapporto pERK/ERK, con una variazione significativa della forma fosforilata rispetto a quella non fosforilata al
trattamento con T1AM alla concentrazione di 1 µM.
Figura 15: Blot rappresentativo e densità ottica di pERK. Variazione dell’espressione proteica di pERK in cellule
NG 108-15 trattate con T1AM a concentrazioni di 0,1 µM, 1 µM e 10 µM per 24h. (Control=DMEM + DMSO; i valori sono espressi come media ± SEM; n=4 per gruppo).
Figura 16: Rapporto tra l’espressione di pERK e ERK in cellule NG108-15 trattate con T1AM a concentrazioni di 0,1 µM, 1 µM ,10 µM. (Control=DMEM + DMSO; i valori sono espressi come media ± SEM; n=4 per gruppo).
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È stato di interesse valutare la variazione di espressione di alcune proteine nucleari come SIRT-1, c- fos e CREB, che possono dipendere dall’attivazione del sistema glutammatergico.
Nelle cellule NG108-15, T1AM non ha indotto significative variazioni nell’espressione di SIRT-1, in seguito a trattamenti della durata di 24h (Figura 17).
L’espressione di c-fos, nelle NG 108-15, non ha mostrato variazioni di espressione significative. Figura 17: Blot rappresentativo e densità ottica di Sirt-1. Variazione dell’espressione proteica di Sirt-1 in cellule
NG 108-15 trattate con T1AM a concentrazioni di 0,1 µM, 1 µM e 10 µM per 24h. (Control=DMEM + DMSO; i valori sono espressi come media ± SEM; n=4 per gruppo).
Figura 18: Blot rappresentativo e densità ottica di c-fos. Variazione dell’espressione proteica di c-FOS in cellule
NG 108-15 trattate con T1AM a concentrazioni di 0,1 µM, 1 µM e 10 µM per 24h. (Control=DMEM + DMSO; i valori sono espressi come media ± SEM; n=4 per gruppo).
44 6.3.2 U87-MG
Gli esperimenti descritti per la linea NG108-15 sono stati estesi alle cellule U87-MG sulle quali è
stato effettuato il medesimo trattamento con T1AM a concentrazioni di 0,1 µM, 1 µM, 10 µM. In questa linea, per completare l’analisi dell’espressione delle proteine sono stati svolti western blot
utilizzando anticorpi contro le seguenti proteine: ERK, pERK, SIRT-1, c-fos, CREB e p-CREB. Anche in questo caso si è valutata l’espressione proteica delle principali proteine coinvolte nel sistema glutammatergico.
ERK non ha mostrato una variazione di espressione in seguito al trattamento con T1AM.
Figura 19: Blot rappresentativo e densità ottica di ERK. Variazione dell’espressione proteica di ERK in cellule U87-MG trattate con
T1AM a concentrazioni di 0,1 µM, 1 µM e 10 µM per 24h. (Control=DMEM + DMSO; i valori sono espressi come media ± SEM; n=4 per gruppo).
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La forma fosforilata di ERK (pERK) non presentava variazioni di espressione in seguito al trattamento con T1AM.
Non sono state osservate significative variazioni d’espressione nel rapporto tra la forma fosforilata di ERK e la forma non fosforilata.
Figura 20: Blot rappresentativo di pERK. Variazione dell’espressione proteica di pERK in cellule U87-MG trattate con T1AM a
concentrazioni di 0,1 µM, 1 µM e 10 µM per 24h. (Control=DMEM + DMSO; i valori sono espressi come media ± SEM; n=4 per gruppo).
Figura 21: Rapporto tra l’espressione di pERK e ERK in cellule U87-MG trattate con T1AM a concentrazioni di 0,1 µM, 1 µM ,10 µM per 24h. (Control=DMEM + DMSO; i valori sono espressi come media ± SEM; n=4 per gruppo).
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L’analisi della SIRT-1 non ha evidenziato una variazione di espressione al trattamento con T1AM alle diverse concentrazioni.
c-fos è risultata aumentata nella sua espressione in seguito a trattamento con T1AM ad una concentrazione di 1 µM.
Figura 22: Blot rappresentativo e densità ottica di Sirt-1. Variazione dell’espressione proteica di Sirt-1 in cellule
U87-MG trattate con T1AM a concentrazioni di 0,1 µM, 1 µM e 10 µM per 24h. (Control=DMEM + DMSO; i valori sono espressi come media ± SEM; n=4 per gruppo).
Figura 23: Blot rappresentativo di c-FOS. Variazione dell’espressione proteica di c-FOS in cellule U87-MG trattate con T1AM a
concentrazioni di 0,1 µM, 1 µM e 10 µM per 24h. (Control=DMEM + DMSO; i valori sono espressi come media ± SEM; n=4 per gruppo). (* indica p<0.05)
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L’analisi di CREB ha mostrato una riduzione dell’espressione proteica nei trattamenti con T1AM a concentrazioni di 10 µM.
La forma fosforilata di CREB (pCREB), invece, non ha subito variazioni in seguito al trattamento con T1AM.
Figura 25: Blot rappresentativo e densità ottica di pCREB. Variazione dell’espressione proteica di CREB in cellule U87-MG trattate
con T1AM a concentrazioni di 0,1 µM, 1 µM e 10 µM per 24h. (Control=DMEM + DMSO; i valori sono espressi come media ± SEM; n=4 per gruppo).
Figura 24: Blot rappresentativo e densità ottica di CREB. Variazione dell’espressione proteica di CREB in cellule U87-MG
trattate con T1AM a concentrazioni di 0,1 µM, 1 µM e 10 µM per 24h. (Control=DMEM + DMSO; i valori sono espressi come media ± SEM; n=4 per gruppo). (* indica p<0.05).
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Il rapporto fra la forma fosforilata e la non fosforilata di CREB non mostra un aumento di espressione in risposta al trattamento con T1AM.
Figura 26: Rapporto tra l’espressione di pCREB e CREB in cellule U87-MG trattate con T1AM a concentrazioni di 0,1 µM, 1 µM,
10 µM per 24h. (Control=DMEM + DMSO; i valori sono espressi come media ± SEM; n=4 per gruppo).
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Con l’ingresso di ioni calcio, durante i fenomeni di LTP, si assiste all’attivazione delle proteine CAMPKII e pCAMPKII. Abbiamo valutato l’espressione di queste proteine e del loro rapporto tra la forma fosforilata e la non fosforilata. Non sono state osservate variazioni di espressione
significative delle proteine CAMPKII e pCAMPKII. Il rapporto tra la forma fosforilata e la non fosforilata non ha mostrato variazioni di espressione.
Figura 27: Blot rappresentativo e densità ottica di CAMKII e pCAMKII. Variazione dell’espressione proteica di CAMPKII e
pCAMKII in cellule U87-MG trattate con T1AM a concentrazioni di 0,1 µM, 1 µM e 10 µM per 24h.
Grafico rappresentativo del rapporto tra pCAMKII e CAMKII. (Control=DMEM + DMSO; i valori sono espressi come media ± SEM; n=4 per gruppo).
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La proteina chinasi C (PKC) è implicata nei fenomeni di induzione dell’LTP e del mantenimento. Nella linea U87-MG in seguito a trattamento con T1AM non ci sono state variazioni significative dell’espressione di PKC.
6.4 Saggio per il dosaggio del glucosio
La T1AM è una molecola in grado di alterare il metabolismo energetico e indurre uno shift dal metabolismo glucidico a quello lipidico. Nel saggio al glucosio si valuta il consumo energetico della cellula; le sue variazioni possono evidenziare i cambiamenti del suo stato metabolico in presenza di T1AM. Dati precedenti indicano che la T1AM è in grado di ridurre il consumo di glucosio nelle cellule NG108-15 ma non nella linea U87-MG (Sacripanti et al, non pubblicato).
Il saggio è stato esteso alle linee U87-MG e NG 108-15 incubate con β-amiloide 25-35 10 µM. L’analisi è stata effettuata in cellule trattate 4h con T1AM, e il risultato è stato normalizzato con la concentrazione proteica del lisato cellulare. Nella linea NG108-15 il trattamento con T1AM 1 µM in associazione con la β-amiloide ha mostrato un aumento significativo del consumo di glucosio rispetto al controllo.
Nella linea U87-MG il trattamento con sola β-amiloide a 10µM ha indotto una variazione significativa del consumo di glucosio rispetto al controllo. Diversamente, l’associazione della T1AM 1 µM e della β-amiloide ha mostrato un significativo aumento del consumo di glucosio dalle cellule, se paragonato però al trattamento con β-amiloide 25-35. Anche con questo saggio si
Figura 28: Blot rappresentativo di PKC. Variazione dell’espressione proteica di PKC in cellule U87-MG trattate con T1AM a
concentrazioni di 0,1 µM, 1 µM e 10 µM per 24h. (Control=DMEM + DMSO; i valori sono espressi come media ± SEM; n=4 per gruppo).
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evidenzia la diversa risposta delle due linee cellulari sia al trattamento con solo β-amiloide sia in presenza di T1AM, indicando un’azione di contrasto verso la β-amiloide evidenziata soprattutto nella linea U87 MG. Decisamente in contrasto con quanto già evidenziato nella linea NG108-15 dove i dati in presenza di sola T1AM indicavano una riduzione, mentre in associazione alle β-amiloide, si osserva un aumento del consumo anche se alla sola concentrazione 1 µM.
Figura 29: Dosaggio del glucosio presente nel mezzo delle cellule U87-MG e delle NG108-15 trattate con T1AM a concentrazioni di
0,1 µM, 1 µM e 10 µM in associazione con la β-amiloide a concentrazione di 10 µM. (* indica p≤0,05, **indica p≤0,01); (Gruppo di controllo=DMEM + DMSO; §p≤0.05 vs β -amiloide; i valori sono espressi come
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7. Discussione
La 3-iodotironamina o T1AM è una tironamina, presumibilmente derivata dalla decarbossilazione e dalla deiodinazione dell'ormone tiroideo tiroxina (T4)75.
Uno dei suoi potenziali meccanismi di azione si esplica attraverso l’interazione con un recettore accoppiato a proteine G, appartenente alla sottoclasse Gs, il recettore delle amine in traccia
(TAAR)1. Non sono state però escluse, interazioni con altri target, come trasportatori di membrane plasmatiche o i trasportatori di ammine biogeniche vescicolari76.
Studi precedenti hanno dimostrato come T1AM è in grado di manifestare diversi effetti, sia sistemici1-18 sia specifici sul sistema nervoso22. A questo livello, data la sua somiglianza con i neurotrasmettitori monoaminergici, è stato ipotizzato che T1AM interagisse con il trasporto di monoamina con effetti neuromodulatori78.
È stato osservato, poi, che T1AM può avere capacità neuroprotettiva in caso di danno ischemico26. Inoltre, Manni et al. nel 201328, in modelli murini, hanno osservato come T1AM possa determinare
un miglioramento dell'apprendimento e della memoria dopo iniezioni intracerebrali, con un meccanismo che potrebbe implicare l'attivazione del segnale delle ERKs.
A livello cellulare, il meccanismo d’azione di T1AM è in grado di mediare effetti sia a breve
termine, presumibilmente modificando lo stato di fosforilazione delle chinasi coinvolte nella cascata metabolica, sia a lungo termine, modificando l’espressione di determinati geni25-65-66-69.
Col fine di approfondire gli effetti della T1AM in relazione ai meccanismi cellulari alla base di apprendimento e memoria, lo scopo di questa tesi è stato quello di valutare i possibili effetti sulla variazione dei secondi messaggeri e sull’espressione delle proteine associate al sistema
glutammatergico, il principale sistema eccitatorio che svolge un ruolo chiave nella regolazione della neuroplasticità e della memoria ed è spesso compromesso nei disturbi neurologici.
Per condurre questo studio sono stati utilizzati come modelli sperimentali in vitro due linee cellulari neuronali: NG108-15 e U87-MG. Si tratta di linee tumorali che permettono una rapida analisi dei risultati.
Entrambe le linee esprimono i recettori implicati nella via glutammatergica, ma solamente la linea U87-MG esprime il recettore TAAR1, recettore per la T1AM.
In questo modo la linea NG108-15 permette di valutare eventuali ulteriori effetti della T1AM non derivanti dall’interazione diretta con il recettore.
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Abbiamo iniziato questo studio valutando potenziali variazioni di concentrazioni di secondi
messaggeri quali cAMP e calcio intracellulare. Come noto, il calcio introdotto attraverso l’apertura dei canali recettori del glutammato induce l’attività dell’adenilato ciclasi, che, a sua volta,
determina un aumento della quantità di cAMP presente nel citosol, attivando la PKA. Il calcio, inoltre, è un importante effettore allosterico di altre chinasi, come la chinasi CaMKII e PKC, la chinasi ERK e la fosforilazione delle proteine CaMKII ed ERK, che tutte insieme promuovono il flusso attraverso la cascata postsinaptica del sistema glutammatergico.
Dal nostro studio è emerso che la T1AM non induce variazioni di calcio all’aumentare della concentrazione, in nessuna delle due linee cellulari considerate. Il saggio utilizzato dà una valutazione complessiva della concentrazione di calcio intracellulare ma non permette di
individuare le potenziali variazioni tra i vari compartimenti cellulari. Per chiarire questo aspetto sarebbe necessario l’utilizzo di metodiche più specifiche.
Risultati simili sono stati ottenuti analizzando la produzione di cAMP, sebbene siano state riscontrate alcune differenze. Analisi quantitative dei livelli del secondo messaggero nei due modelli hanno mostrato come solo nella linea U87-MG si può riscontrare un aumento significativo dei livelli di cAMP, sebbene limitato alla presenza della concentrazione più bassa (0.1 µM) di T1AM presa in esame.
Le variazioni di produzione di cAMP da parte di T1AM è già stata oggetto di indagine e
discussione: nonostante il recettore TAAR1 sia un recettore accoppiato a proteina Gs, raramente è stato riscontrato un suo aumento dopo trattamento con cAMP, come per altro osservato da Chiellini et al. nel 200781, su cellule cardiache di ratto, che non hanno mostrato variazioni significative di cAMP dopo infusione con T1AM.
Considerato che le stesse dosi di T1AM non sono riuscite a determinare variazioni significative nei valori di calcio intracellulare, non è da escludere che le differenze riscontrate siano riconducibili all’interazione specifica con il recettore TAAR1, presente esclusivamente nella linea U87-MG.
Per proseguire lo studio e valutare effetti a valle della cascata di interesse, è stata condotta una serie di esperimenti di Western Blot, atti a completare la valutazione della variazione di espressione proteica dei principali effettori coinvolti nella via glutammatergica.
Per cominciare, è stata valutata la variazione dell’espressione della MAP chinasi ERK e della sua forma fosforilata. ERK è nota per essere in grado di attivare il cAMP-responsive element binding protein (CREB) e altri fattori di trascrizione, elementi essenziali all’espressione e al consolidamento nel processo noto come Long Term Potentiation (LTP)78-79-80. Il trattamento è stato valutato allo scadere delle 24h e i risultati hanno mostrato un aumento del
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rapporto tra la forma fosforilata e la sua forma non fosforilata in corrispondenza di concentrazioni pari a 1 µM. Sebbene il trend sia evidente in entrambe le linee analizzate, solo la linea NG108-15 ha mostrato un incremento statisticamente significativo del rapporto, che tende a ristabilirsi alla concentrazione di 10 µM. Dunque, così come osservato in vivo in modelli murini da Manni et al.28, si conferma anche in vitro un coinvolgimento di pERK nel processo molecolare innescato da T1AM. In seguito, sono state analizzate le variazioni relative all’espressione delle proteine nucleari a valle, tra le quali CREB e la sua forma fosforilata rappresentano, insieme a c-fos, gli attori principali. Riguardo CREB e pCREB, nella linea U87-MG l’analisi ha registrato un decremento significativo della forma non fosforilata, esclusivamente in corrispondenza della concentrazione massima testata, mentre non si hanno differenze riguardo pCREB.
Saggi sul rapporto pCREB/CREB, condotti precedentemente a questa tesi, nella linea NG108-15 non hanno evidenziato variazioni significative del rapporto. Questo dimostra un’ulteriore differenza tra i due modelli cellulari in risposta al trattamento con T1AM.
L’analisi condotta su c-fos ha mostrato un trend simile in entrambe le linee, con un incremento della sua espressione in corrispondenza della concentrazione di 1 µM, che risulta significativo nel caso della linea U87-MG. Considerata la durata del trattamento e il noto coinvolgimento degli effettori ERK da parte di T1AM82, tali risultati suggeriscono un suo ruolo attivatore di meccanismi di potenziamento sinaptico.
Al fine di andare a completare studi precedentemente effettuati sulla linea NG108-15, sulla linea U87-MG abbiamo valutato la variazione dell’espressione di CaMKII, la sua forma fosforilata (pCaMKII) e PKC. In linea con i risultati ottenuti mediante saggi di calcio, trattamenti con T1AM non hanno determinato variazioni nell’espressione delle suddette proteine nella linea U87-MG. L’ultima componente presa in considerazione è stata SIRT-1, una deacetilasi implicata nella
regolazione dell’espressione genica e con funzioni neuroprotettive70-72-73. In entrambe le linee, la T1AM non ha indotto variazioni nell’espressione dell’enzima.
Studi condotti precedentemente nel medesimo laboratorio avevano dimostrato la capacità delle T1AM di indurre variazioni sul metabolismo cellulare83. In questo studio, la capacità di consumo del substrato è stata valutata in presenza di β-amiloide, molecola in grado compromettere lo stato metabolico cellulare e di causare anomalie sinaptiche caratteristiche della malattia di Alzheimer84. Interessante notare come il trattamento con T1AM determina effetti benefici in entrambe le linee analizzate. Nello specifico, concentrazioni di 1 µM nella linea U87-MG sono in grado di ripristinare performance cataboliche basali, altrimenti compromessi dalla presenza Aβ. La stessa
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mostrano una minore capacità delle cellule U87-MG di utilizzare il glucosio con un trattamento con β-amiloide, mentre tale effetto sembra migliorare con l’aggiunta di T1AM.
In conclusione, da questo studio si evidenzia che il trattamento con T1AM è in grado di indurre variazioni nella cascata glutammatergica. Nella linea NG108-15, concentrazioni di T1AM 1 µM hanno determinato variazioni significative nel rapporto pERK/ERK e hanno determinato un aumento di consumo di glucosio in presenza di β-amiloide.
Nella linea U87-MG, T1AM è risultato essere in grado di promuovere l’espressione di c-FOS, evento correlabile con fenomeni di plasticità sinaptica la cui natura non può essere però valutata al meglio in questo modello cellulare.
Infine, in entrambe le linee il trattamento con T1AM ha determinato effetti protettivi, andando ad antagonizzare, in particolare nella linea U87-MG, l’azione compromettente della β-amiloide nelle performance cataboliche cellulari.
La ricerca di nuovi agenti terapeutici vòlta a rendere più efficiente la trasmissione glutammatergica, spesso compromessa in patologie neurodegeneative, potrebbe essere una nuova strategia
farmacologica.
Da tenere in considerazione resta, di fatto, la diversità delle risposte dei modelli sperimentali; occorre, quindi, estendere lo studio degli effetti protettivi della T1AM ad altri modelli: dalle linee cellulari utilizzate ad altri modelli in vitro così come a modelli in vivo, da cui sarà possibile generare effetti diversi. Saranno quindi necessarie ulteriori indagini per valutare e chiarire l’intero meccanismo d’azione mediato dalla T1AM sul sistema nervoso.
Esperimenti successivi potranno focalizzarsi su linee primarie derivate da specifiche aree cerebrali, col fine di mimare al meglio dinamiche realistiche che si svolgono a livello del SNC.
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Bibliografia
1. Scanlan, T. S. et al. “3-iodothyronamine is an endogenous and rapid-acting derivative of thyroid hormone” Nat. Med. 10(06), 638-42, 2004.
2. S.-Y. Wu, W. L. Green, W.-S. Huang, M. T. Hays, and I. J. Chopra, “Alternate pathways of thyroid hormone metabolism.,” Thyroid, vol. 15, no. 8, pp. 943–58 2005.
3. M. Y. Zhu and A. V Juorio, “Aromatic L-amino acid decarboxylase: biological
characterization and functional role.,” Gen. Pharmacol., vol. 26, no. 4, pp. 681–696, 1995. 4. Dratman, MB “On the mechanism of action of thyroxin, an amino acid analog of tyrosine.”, J.
Theor Biol. 46(01), 255-70 1974.
5. Piehl. S, Heberer T, Balizs G., Scanlan TS, Köhrle J., “Development of a validated liquid chromatography/tandem mass spectrometry method for the distinction of thyronine and thyronamine constitutional isomers and for the identification of new deiodinase substrates. Rapid Commun Mass Spectrom” 22:3286–3296 2008.
6. Pietsch. C, T. S. Scanlan, and R. J. Anderson, “Thyronamines are substrates for human liver sulfotransferases.,” Endocrinology, vol. 148, no. 4, pp. 1921–7, 2007.
7. Aksoy. IA, Sochorovà V, Weinshilboum RM, “Human liver dehydroepiandrosterone
sulfotransferase: nature and extend of individual variation.” Clin Pharmacol Ther 54:498-506, 1993.
8. Berry M. D. et al. “Mammalian central nervous system trace amines. Pharmacologic
amphetamines, physiologic neuromodulators” Journal of Neurochemistry, vol. 90, Issue 2 no.