IL SAGGIO ELISA E LA CELIACHIA

I saggi AGA e anti-tTG usati per la diagnosi della malattia celiaca sono saggi ELISA.

La tecnica ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) è un immunodosaggio sviluppato per la misurazione di microquantità di sostanze nei campioni, che lo rende utile nelle determinazioni analitiche di routine. Un saggio ELISA combina la specificità degli anticorpi con la sensibilità dei dosaggi enzimatici. Si parla di un saggio in fase solida quando viene sfruttata la capacità delle superfici di plastica (come il fondo dei pozzetti di una micropiastra) di legare quantità piccole ma rilevabili di proteine. Ogni piastra permette di saggiare contemporaneamente un elevato numero di campioni. Il saggio ELISA fornisce informazioni solo sulla presenza e/o concentrazione di una molecola, senza entrare nel merito delle sue proprietà biochimiche (es.

della tecnica ELISA è sempre più diffuso (48-49). In particolare è utilizzata per determinare la presenza (saggio qualitativo) o la concentrazione (saggio quantitativo) di un Antigene o di uno specifico Anticorpo nel campione da testare.

Si utilizzano quindi due varianti ELISA, diretto e indiretto, che si differenziano a seconda del componente che si vuole rilevare. Nel test diretto viene determinata la presenza dell'antigene, in quello indiretto la presenza di anticorpi contro un determinato antigene. Il saggio può essere inoltre competitivo o non competitivo.

ELISA Competitivo

Il metodo ELISA competitivo diretto viene utilizzato per la determinazione della presenza e/o concentrazione dell'antigene da ricercare.

Un anticorpo specifico per l’antigene da ricercare, detto capture antibody, viene purificato e legato (coattato) alla piastra. La fase di purificazione e la scelta delle varie componenti sono essenziali in quanto esse determineranno poi la sensibilità e la specificità del test. In generale la procedura del test è la seguente:

1. Si aggiunge al pozzetto coattato una soluzione contenente

l'antigene che si vuole dosare e un secondo antigene marcato con un enzima. Una parte degli anticorpi lega (stechiometricamente in base alle rispettive concentrazioni) l'antigene marcato ed una parte l'antigene non marcato.

2. Dopo lavaggio per allontanare le componenti non legate, viene

aggiunto nel pozzetto un substrato che è in grado di reagire con l'enzima eventualmente presente sull'antigene marcato e dare una reazione colorimetrica. Il risultato può essere sia qualitativo

concentrazione dell’antigene presente grazie all’utilizzo di una curva di calibrazione.

La competizione per il sito di attacco del capture-antibody è stechiometrica per cui, nelle condizioni operative, sarà l’antigene presente nel materiale biologico da testare a prevalere. In questo caso, il cromogeno aggiunto non sarà modificato per cui la presenza di antigene si sarà rilevata dalla mancanza di colore mentre l’eventuale sviluppo di colore sarà indicativo di assenza dell’antigene stesso.

Il sandwich ELISA diretto

Il test può essere usato per ricercare antigeni da liquidi biologici.

Un anticorpo, detto capture antibody, viene purificato e legato (coattato) alla piastra. La procedura di laboratorio è quindi la seguente:

1. Si aggiunge al pozzetto coattato la soluzione contenente

l’antigene, permettendo la formazione del complesso (antigene)- (capture–antibody).

2. Le molecole che non si sono legate vengono eliminate tramite lavaggi.

3. Si aggiunge un secondo anticorpo marcato, detto detection

antibody, permettendo il suo legame all’antigene ed il completamento del sandwich.

4. Dopo i lavaggi, l’eventuale presenza dell’antigene e la sua

concentrazione si rilevano misurando la variazione di colore del pozzetto di reazione in quanto l’avvenuta formazione del sandwich e quindi la presenza di enzima coniugato al detection- antibody fa virare il substrato cromogenico aggiunto nell’ultimo passaggio.

purificato (se disponibile) come standard, permette di determinare la quantità assoluta dell’antigene nel campione analizzato. Inoltre richiede due anticorpi che riconoscono epitopi diversi sull’antigene. Questo risultato può essere raggiunto sia utilizzando due anticorpi monoclonali con diversa specificità, oppure anticorpi policlonali (cioè che contengono molteplici specificità perché nella loro secrezione intervengono diverse cellule B che riconoscono regioni o epitopi diversi sull’antigene). I vantaggi di questo metodo sono nel fatto che l’antigene non deve essere purificato e vi è un elevato grado di specificità anche se non tutti gli anticorpi possono essere utilizzati. La sensibilità di questa tecnica dipende dal numero di molecole del capture antibody legato alla fase solida; dall’avidità, cioè dalla forza con cui un anticorpo multivalente si lega ad un antigene, del capture antibody per l’antigene; dall’avidità del detection antibody per l’antigene; dall’attività specifica del detection antibody.

Nella variante sandwich ELISA indiretto, l’antigene viene purificato e legato alla piastra. La procedura di laboratorio è la seguente:

1. Si aggiunge al pozzetto il siero/plasma da analizzare. Se presenti, le

immunoglobuline specifiche per l’antigene formano il complesso antigene-anticorpo.

2. Le molecole che non si sono legate vengono eliminate tramite

lavaggi.

3. Si aggiunge un secondo anticorpo marcato, che abbia specificità

per le immunoglobuline (IgA o IgG o IgM) del tipo che si vuole ricercare. Il secondo anticorpo si lega al complesso antigene- anticorpo immobilizzato sulla piastra.

4. l’eventuale presenza dell’anticorpo e la sua concentrazione si

rilevano misurando la variazione di colore del pozzetto di reazione in quanto l’avvenuta formazione del sandwich, e quindi la presenza di enzima coniugato al detection-antibody, fa virare il substrato cromogenico aggiunto nell’ultimo passaggio.

In questo tipo di ELISA però l’antigene deve essere altamente purificato per evitare interferenze. Questo metodo è veloce e accurato e permette di determinare la presenza di anticorpi contro l’antigene immobilizzato: gli anticorpi presenti possono essere quantificati grazie all’utilizzo di controlli positivi in concentrazioni note.

Per tutti i tipi di ELISA il substrato deve essere stabile, sicuro e non tossico, poco costoso.

Il metodo più utilizzato per la rivelazione dell’avvenuto legame antigene- anticorpo consiste nella coniugazione dell’anticorpo secondario con una molecola che può essere direttamente rivelata. In ELISA per la rilevazione della reazione utilizziamo anticorpi coniugati ad enzimi in grado di convertire un substrato incolore in un prodotto colorato.

 Fosfatasi alcalina : per anticorpi coniugati con la fosfatasi alcalina

si usa in genere il substrato p-nitrophenylphosphate (pNPP), che sviluppa un intenso colore giallo misurabile a 405-410 nm.

 Perossidasi (POD): per gli anticorpi coniugati con la perossidasi si

possono scegliere diversi substrati, tra i più utilizzati: 2,2- azinodiethyl-benzthiazoline sulfonate (ABTS), che sviluppa un colore blu-verde misurabile a 405-410 nm. o-phenylene diamine (OPD), sviluppa un colore arancio scuro misurabile a 492 nm, 3,3',5,5'-tetrametil benzidina (TMB).

La quantità di segnale generato dal legame del secondo anticorpo è proporzionale alla quantità di antigene presente nel campione testato. La concentrazione dell’anticorpo ricercato è ottenuta generando una curva standard e comparando l’attività ottenuta con il campione a quella ottenuta sulla curva standard.

CAPITOLO3