SAGGIO ELISA PER L’ IL-6 E PER IL FATTORE MCP-

I test per rilevare la presenza di IL-6 e MCP-1 è stata effettuata sui surnatanti e con diversi tempi di stimolazione, come riportato in letteratura (24). Le cellule sono state coltivate in piastre da 24 pozzetti, co-stimolate con TNF-α (1-10ng/mL) e DB103 (10 e 50 µmol/L), e apigenina (10 µmol/L) per 24 ore. Le concentrazioni impiegate sono state stabilite basandosi su studi precedenti ( 2,3) che dimostravano che il composto è ben tollerato dalle cellule anche alla concentrazione di 50µmol/L, mentre apigenina a concentrazioni superiori a 10µmol/L risultano tossiche per le cellule anche dopo 24 ore. Finito il tempo di stimolazione, il surnatante è stato prelevato dai pozzetti, centrifugato a 3000rpm per 15 minuti, e congelato a -20°C fino all’analisi con quantikine ELISA (Quantikine® ELISA, R&D Systems, Inc. Minneapolis, MN USA ).

Brevemente, questo saggio immunoenzimatico è un doppio sandwich ELISA che utilizza un anticorpo monoclonale specifico (per IL-6 o MCP-1) legato al fondo dei pozzetti di una piastra da 96 a cui si legano gli antigeni (IL-6 o MCP-1) contenuti nello standard o nei campioni. Dopo un primo lavaggio per allontanare le sostanze non legate, viene aggiunto un anticorpo policlonale legato ad un enzima perossidasico, specifico per il bersaglio. Dopo aver ripetuto la fase di lavaggio per rimuovere gli anticorpi non legati, si aggiunge una soluzione di substrato per la perossidasi e si svilupperà una colorazione proporzionale alla quantità di bersaglio che si è legato durante lo step iniziale. Una volta bloccata la reazione di colorazione si può misurare l’intensità del colore allo spettrofotometro. I risultati ottenuti vengono confrontati con una curva standard e riportati come pg/mL.

Dopo aver preparato tutti i reagenti e la curva di riferimento secondo le istruzioni dei kits, si procede come segue. Aggiunta del campione in ciascun pozzetto di una piastra da 96 pozzetti precotata con l’anticorpo monoclonale specifico. Incubazione per due ore a temperatura ambiente, lavaggio per 3 volte ed incubazione per un’ora con il l’anticorpo policlonale coniugato con la perossidasi. Successivo lavaggio ed incubazione per 30 minuti con il substrato della perossidasi. Formazione del

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colore e blocco con acido solforico. Infine, lettura allo spettrofotometro a 450 nm (con correzione della lunghezza d’onda per una lettura più accurata a 540 o 570 nm).

3.4 MULTIPLEX IMMUNOASSAY

Il saggio di immuno-adsorbimento enzimatico ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) è stato per lungo tempo il principale strumento per il rilevamento di analiti di interesse in campioni biologici sia per la ricerca che per la diagnostica clinica. Tuttavia tale tecnologia ha alcune limitazioni: richiede una quantità relativamente grande di campione ed è soggetta a fenomeni di aspecificità e background elevato. Inoltre, la maggior parte dei saggi ELISA si basano su amplificazione enzimatica del segnale al fine di ottenere una sensibilità più elevata. Tale amplificazione non è sempre lineare e può quindi alterare i risultati. Negli ultimi anni è emersa una nuova tecnologia che offre i vantaggi dell’ELISA, ma consente una maggiore produttività e flessibilità, utilizzo di un volume ridotto di campione e costi relativamente più bassi. La tecnologia Luminex xMAP si basa sull’uso di microsfere che permettono dosaggi sia in singolo che in multiplo per la determinazione qualitativa e quantitativa di proteine ed acidi nucleici.

Questa tecnica coinvolge circa 100 microsfere colorate (biglie di polistirene) create con l'uso di due coloranti fluorescenti a rapporti distinti. Queste microsfere possono essere ulteriormente coniugate con un reagente specifico per una determinata analisi biologica. I reagenti possono includere antigeni, anticorpi, oligonucleotidi, substrati enzimatici o recettori (ogni microsfera ha un colore fluorescente distinto per un determinato anticorpo e questo colore identifica una regione in uno spettro di fluorescenza).

Una volta che gli anticorpi di “cattura” sono stati legati alle microsfere si passa all’esecuzione del saggio che prevede l’incubazione delle microsfere con il campione in esame. Durante questa prima incubazione si forma un complesso microsfera-anticorpo primario -target. Per la quantificazione del target è necessario utilizzare un anticorpo secondario che porta una seconda marcatura fluorescente.

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Gli anticorpi secondari utilizzati sono stati biotinilati e attraverso un’incubazione con streptavidina- ficoeritrina è stata ottenuta la marcatura secondario

Lo strumento di lettura (Luminex X100, Bio-rad) sfrutta lo stesso principio del citofluorimetro per rilevare reazioni che avvengono sulla superficie delle microsfere fluorescenti e determinare la concentrazione dell'analita misurando la fluorescenza del colorante.

Fig.16: gli anticorpi di “cattura” legati alle microsfere

3.5 MILLIPLEX MAP KIT: ANGIOPOIETINA-2, IL-8, VEGF

Le cellule sono state coltivate in piastre da 24 pozzetti, co-stimolate con TNF-α (1-10ng/mL) e DB103 (10 e 50 µmol/L) ed apigenina (10 µmol/L) per 24 ore. Le concentrazioni impiegate sono state stabilite basandosi su studi precedenti (2,3) che dimostravano che il composto è ben tollerato dalle cellule anche alla concentrazione di 50µmol/L, mentre le concentrazioni di apigenina superiori a 10µmol/L risultavano tossiche alle cellule anche dopo 24 ore. Finito il tempo di stimolazione, il

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surnatante è stato prelevato dai pozzetti, centrifugato a 3000rpm per 15 minuti per eliminare i detriti, e congelato a -20°C fino all’analisi con milliplex map kit.

Come controllo e come diluente degli standards è stato utilizzato il medium serum free (MSF).

Figura17: preparazione degli standard

Dopo aver preparato tutti i reagenti e la curva di riferimento secondo le istruzioni dei kit, abbiamo aggiunto quantità appropriate di Standard o Controllo in una piastra da 96-wells, con quantità equivalenti di campione e microsfere in ciascun pozzetto.

Dopo overnight (16-20 ore) di incubazione a 2-8 °C su un agitatore per piastre, la piastra, posizionata su uno specifico supporto magnetico che tiene ancorate le sfere magnetiche in ciascun pozzetto, è stata lavata e sono stati aggiunti gli anticorpi secondari in ciascun pozzetto. Dopo 1 ora di incubazione in agitazione è stata aggiunta streptavidina-ficoeritrina in ciascun pozzetto. Dopo

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un’ulteriore incubazione di 30 minuti a temperatura ambiente, il contenuto è stato gentilmente rimosso (tenendo la piastra sul supporto magnetico) e per ogni pozzetto sono stati aggiunti 100 µl di Drive Fluid (fluido di azionamento) in cui le sfere sono state risospese.

Infine, la piastra è stata letta su un Luminex 200 ™, o MAGPIX e con il software xPONENT17, le concentrazioni di angiopoietina -2, IL-8 e VEGF sono state calcolate sui rispettivi standards di riferimento.