Glia e dolore neuropatico
Capitolo 7 Scopo della ricerca
Il dolore cronico, in particolare il dolore neuropatico, spesso non è trattato adeguatamente con farmaci analgesici attualmente in uso.
Lo scopo della ricerca è stato quello di caratterizzare modelli animali di dolore neuropatico per lo studio preclinico del dolore cronico.
Al fine di indagare i meccanismi fisiopatologici responsabili della percezione algica, della sua cronicizzazione e dell’induzione dei fenomeni neuroprotettivi, caratterizzeremo due modelli animali di neuropatia; la neuropatia indotta mediante legatura del nervo sciatico e la neuropatia indotta da oxaliplatino nei suoi aspetti comportamentali, morfologici e molecolari. In entrambi i modelli valuteremo l’iperalgesia, l’allodinia e la coordinazione motoria.
Nel modello della legatura lassa del nervo sciatico di ratto, la legatura viene fatta vicino alla triforcazione del nervo con un filo di sutura. Il dolore acuto si manifesta subito dopo l’operazione con sintomi infiammatori probabilmente causati dal filo di sutura. Per studiare il dolore cronico abbiamo utilizzato un altro modello di dolore indotto da un agente chemioterapico che prevede il trattamento di ratti per 21 giorni con oxaliplatino 2.4 mgkg-1 per via intraperitoneale [Cavaletti et al., 2001].
L’oxaliplatino è un farmaco antitumorale di prima scelta nella terapia del cancro metastatico colon-rettale [Culy et al., 2000]. Il suo utilizzo in associazione con 5- fluoro-uracile e leucovorina, è stato proposto anche nel cancro alle ovaie, al pancreas, al seno e ai polmoni e nei linfomi non-Hodgkin [Grothey, 2005]. Alle dosi clinicamente raccomandate, l’oxaliplatino ha un profilo di tossicità migliore rispetto ai suoi congeneri platino-derivati: infatti, risulta avere minori effetti collaterali a carico dei sistemi renale, uditivo ed ematologico [Culy et al., 2000]. Nonostante ciò, un numero sempre maggiore di pazienti non è in grado di
121 terminare i cicli dell’intero trattamento a causa dello sviluppo di una neuropatia e dolore neuropatico indotti proprio dal chemioterapico.Ad oggi, i farmaci disponibili per la cura del dolore neuropatico, quali antiepilettici e antidepressivi, riescono a controllare, almeno in parte, il fenomeno doloroso, ma nessuno di questi riesce ad intervenire direttamente sul danno tessutale nervoso alla base dell’insorgenza della sintomatologia dolorosa. D’altra parte la sovrapposizione esistente tra le vie segnalatorie del dolore e quelle dei processi neuroconservativi rende difficile raggiungere il duplice obbiettivo di curare lo stato doloroso e riparare il danno tissutale. Tra i meccanismi fisiopatologici responsabili del dolore, crescenti evidenze vanno a favore del ruolo della glia: la glia risulta implicata sia nell’induzione e nel mantenimento del dolore neuropatico che nella rigenerazione del danno tessutale [Scholz e Woolf, 2007; Mika, 2008; Vallejo et al., 2010].
Nei tessuti degli animali trattati analizzeremo le alterazioni a carico del sistema nervoso periferico e centrale mediante l’analisi istologica ed immunoistochimica in microscopia ottica e immunofluorescente in microscopia confocale. In particolare si cercherà di misurare i livelli di espressione di antigeni, quali CD68, NF200 e ATF3 i quali entrano in gioco in caso di danno. Infatti il Cluster di Differenziazione 68 (CD68) è una glicoproteina che si lega a lipoproteine di bassa densità ed è espressa specificamente nei monociti e nei macrofagi pertanto ci darà indicazioni. Il Neurofilamento 200 (NF200) è un filamento intermedio specificamente espresso nei neuroni dove durante la crescita neuronale sembra controllare direttamente il diametro assonico. Il fattore di attivazione della trascrizione 3 (ATF3) è una proteina che presenta due isoforme: una più corta (deltaZip2) che non è in grado interagire col DNA e stimola la trascrizione presumibilmente sequestrando dei cofattori inibitori del promotore, e una più lunga che ha l’effetto contrario, ovvero reprime piuttosto la trascrizione a partire dai medesimi promotori. In diversi studi, ATF3 è utilizzato come marker di danno nervoso in quanto la sua espressione sembra aumentare nel danno nervoso periferico [Hubbard et al., 2008].
122 La componente gliale verrà valutata prendendo in considerazione i vari tipi cellulari che caratterizzano sia il SNP che il SNC. Quindi verranno considerate le cellule satelliti dei gangli spinali, la microglia e gli astrociti nel midollo spinale e in alcune aree cerebrali maggiormente implicate nella trasmissione algica. La glia sarà identificata mediante l’espressione della glutamina sintetasi (GS) presente nelle cellule satelliti gangliari, mediante l’utilizzo della proteina gliale fibrillare acida (GFAP) espressa negliastrociti e della molecola 1 legante calcio ionizzato (Iba1) espressa nelle cellule microgliali.
La GS (glutamina sintetasi) catalizza la conversione dell’ammoniaca e del glutamato in glutamina. E’ un ottamero formato da subunità di 45 kDa la cui funzione è quella di detossificare il cervello dall’ammoniaca. Questo enzima presenta un importante ruolo nella regolazione metabolica del neurotrasmettitore glutamato e la sua attività è regolata dalla adenilazione.
La GFAP (proteina gliale fibrillare acida)è uno dei filamenti intermedi che si pensava fosse specifica per gli astrociti. Più tardi è stato dimostrato che la GFAP è localizzata nei fibroblasti glomerulari e peritubulari del rene di ratto, nelle cellule di Leydig dei testicoli, nei cheratinociti cutanei, negli osteociti, nei condrociti (in particolare delle epiglottidi, nei bronchi e cartilagini di epiglottide e bronchi) e nelle cellule stellate di pancreas e fegato. Nonostante il numero di studi effettuati utizzandola come cellula marker,si pensa che la GFAP aiuti a mantenere la struttura e la forma degli astrociti ma la loro funzione primaria rimane tuttora non compresa pienamente.
L’Iba1 (molecola 1 legante calcio ionizzato) è una proteina della famiglia EF di 17 KDa specifica dei macrofagi e della microglia, i cui livelli di espressione aumentano durante l'attivazione di queste cellule. La proteina è il prodotto del gene Aif1,altamente espressa nel testicolo e nella milza, ma debolmente espressa anche nel cervello, nel polmone e nel rene. Tra i tipi cellulari del SNC, il gene Iba1 è stato visto essere specificamente espresso nella microglia.
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