Scopo della tesi

Lo scopo della mia tesi è valutare i livelli di espressione e fosforilazione di alcune proteine regolatrici coinvolte direttamente od indirettamente con i meccanismi precedentemente osservati nelle A549, dal mio gruppo di ricerca (Pesi et al. 2018 manoscritto in preparazione).

A tal proposito ho utilizzato la stessa linea cellulare di adenocarcinoma dell’epitelio alveolare umano nota come A549. Ho coltivato due linee cellulari, cellule controllo (pS-Cont) ingegnerizzate con un plasmide che codifica per una sequenza priva di target intracellulare dove la cN-II è normalmente espressa e cellule ingegnerizzate con un plasmide, in cui è inserito uno short-hairpin, per silenziare il gene che codifica per la cN-II (pScN-II). Il silenziamento di circa il 60% è stato valutato con il metodo radio-enzimatico. I due tipi cellulari sono stati coltivati sia in assenza che in presenza di 2-DG (20 mM), inibitore della glicolisi, al fine di indagare su eventuali alterazioni metaboliche e funzionali legate alla diversa espressione della proteina. Studi precedenti sulle A549 hanno evidenziato che il silenziamento parziale modificava il metabolismo cellulare da glicolitico ad uno più ossidativo, causava una diminuzione della proliferazione cellulare ed una marcata riduzione della sintesi proteica (Pesi et al. 2018 manoscritto in preparazione). Per meglio comprendere i meccanismi alla base di queste alterazioni sono stati analizzati specifici marker proteici quali: p53 totale e fosforilata, mTOR totale e fosforilata, PGC1-alpha, ERK1/2 totale ed ERK1/2 fosforilata, p70S6K totale e fosforilata. Durante le osservazioni previamente fatte al microscopio confocale ed anche al microscopio ottico è stata notata la presenza di microvescicole che potrebbero essere connesse con l’attivazione del meccanismo autofagico (Pesi et al. 2018 manoscritto in preparazione), a tal proposito è stata valutata la presenza di LC3- II.

Alla luce dei risultati precedentemente ottenuti dal mio gruppo di ricerca che suggeriscono un’attenuazione di alcune delle caratteristiche metaboliche delle cellule tumorali, è stata saggiata la mobilità cellulare.

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2.1 Materiali.

Cocktail di inibitori di protease (PIC), ATP, acido 2,3-bisfosfoglicerico, D-glucosio, fenilmetil sulfonil fluoruro (PMSF), sodio fluoruro, sodio ortovanadato, β-glicerofosfato, sodio pirofosfato, dimetilsulfossido (DMSO), acido perclorico, cristal violetto (Sigma, Milano, Italia), 2-deossiglucosio (2dG) (Carbosynth Ltd. Berkshire, UK);[8-14C]; Inosina (6000 dpm/nmol)(Moravek Biochemicals e Radiochemicals, Brea, Usa);

Dulbecco’s modified Eagle’s medium (high glucose) (DMEM), penicillina, streptomicina, siero di bovino

fetale (FBS), glutammina e tripsina sono stati acquistati da Euroclone (Milano, Italia); il Sistema di rivelazione della chemiluminescenza è stato acquistato da Millipore, (Massachusetts, USA) ed ECL mix (Euroclone, Littleton, Colorado, USA). Gli anticorpi primari specifici: per mTOR (L2AD4), per mTOR-p (Ser2448), per p53 (1C12), p53-p (ser15), LC3B (D11) XP, p70S6K-p (Thr 389), p70S6K, p44/42 Mapk (ERK1/2)(137F5),anticorpo di coniglio per Beta-Actina (D6A8) sono stati acquistati da Cell Signaling (Danvers, Massachusetts, USA); mentre gli anticorpi primari specifici per PGC1a (NBP1-04676) ed ERK1/2 (NBP1-19924) sono stati acquistati da Novus Biologicals (Littleton, Colorado, USA); gli anticorpi secondari IgG coniugati con HRP anti-ratto e anti-coniglio sono stati acquistati da Cell Signaling (Danvers, Massachusetts, USA). Le cellule A549 di controllo (pScont) e le cellule parzialmente silenziate per il gene cN-II (pScN-II) sono state fornite dal Prof. Lars Petter Jordheim dell’Università di Lione e successivamente testate mediante PCR per contaminazioni di Mycoplasma. Tutti gli altri reagenti erano di purezza analitica.

2.2 Metodi.

Ogni esperimento effettuato in questo lavoro di ricerca è stato eseguito almeno in triplicato.

2.2.1 Colture cellulari.

Le linee cellulari di adenocarcinoma alveolare umano A549 sono state transfettate stabilmente con un plasmide contenente uno short-hairpin RNA non-targeting come controllo o con un plasmide contenente uno short- hairpin RNA in grado di silenziare parzialmente il gene cN-II, rispettivamente (A549 pScont e A549 pScN-II) (Cividini et al. 2015b). Le linee cellulari sono state mantenute in terreno DMEM high glucose (25 mM) addizionato con il 10% di FBS, 1% di glutammina, 100 U/ml di penicillina e 100 U/ml di streptomicina. Le cellule sono state mantenute in incubatore umidificato alla temperatura di 37°C e ad una concentrazione di CO2 pari al 5% e coltivate sia in presenza che in assenza di 2-deossiglucosio (20 mM).

2.2.2 Preparazione dell’estratto acellulare.

Le cellule di controllo (pScont) e le cellule parzialmente silenziate per il gene cN-II (pScN-II) sono state piastrate alla densità di 2x106 cellule/pozzetto in piastre del diametro di 100 mm. Dopo 12 ore, le cellule sono state incubate con 20mM di dG per 6 e 24 ore rispettivamente. Al termine del trattamento, le cellule sono state lavate in PBS, tripsinizzate, centrifugate (500xg per 5 minuti) ed il pellet è stato successivamente risospeso in 400 µl di Tris-HCl 100 mM pH 7.4, addizionato con il cocktail di inibitori di proteasi, 10 mM di NaF, 30 mM di β-glicerolfosfato e 10 mM di Na-pirofosfato come inibitore della fosfatasi.

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L’estratto proteico grezzo ottenuto al termine di 3 cicli successivi di congelamento/scongelamento, è stato centrifugato a 10000×g per 40 minuti a 4 °C.

Il supernatante è stato raccolto ed aliquotato. Un’aliquota è stata utilizzata per valutare il contenuto proteico, determinato con il metodo Bradford (Bradford 1976). Un’ulteriore aliquota di sovranatante è stata utilizzata per il dosaggio dell’attività fosfotransferasica.

2.2.3 Saggio del Bradford.

Il contenuto proteico è stato valutato mediante l’utilizzo del metodo Bradford (Bradford 1976), che consiste in un saggio colorimetrico basato sul confronto della densità ottica del campione con quella di una quantità nota di una proteina standard, nel nostro caso la BSA (albumina sierica bovina).

Le otto concentrazioni note di BSA sono state utilizzate per costruire una curva di calibrazione, misurandone l’assorbanza a 595 nm, mediante uno spettrofotometro. 5 e 10µl di estratto proteico vengono sciolti in 795 e 790µl di acqua mescolati e aggiunti a 200µl reattivo di Bradford (BioRad) in ogni provetta.

Il reattivo di Bradford si lega alle proteine in una forma anionica blu che assorbe a 595 nm. I valori di assorbanza ottenuti mediante analisi spettrofotometrica consentono la quantizzazione della concentrazione proteica del campione.

2.2.4 Proliferazione cellulare metodo del Cristal Violetto.

Per la valutazione della proliferazione cellulare è stata utilizzata la tecnica di colorazione al cristal violetto (Chiba et al. 1988). Tale metodica si basa sul principio per cui il colorante cristal violetto (intercalante) è in grado di legare il DNA la cui sintesi aumenta in corso di proliferazione cellulare. Quindi il tasso di proliferazione cellulare è correlato in misura direttamente proporzionale alla quantità di colorante legata al DNA.

Le cellule di controllo e le cellule silenziate per cN-II, sono state piastrate alla densità di 2 x 104 _{cellule per} pozzetto in un volume di 0.6 ml in tre piastre da 24 pozzetti, 12 ore prima del trattamento. Trascorso il tempo indicato, le cellule sono state incubate con dG 20mM e dopo 0, 24 e 48 ore è stato aspirato il terreno di coltura. Successivamente le cellule sono state colorate con una soluzione 0,1% di cristal violetto in metanolo per 30 minuti a 37 °C in leggera agitazione. Al termine dell’incubazione le piastre sono state lavate accuratamente per tre volte con acqua distillata e lasciate asciugare. A ciascun pozzetto sono stati aggiunti 0.6 ml di acido acetico al 10% mantenuto per 15 minuti a temperatura ambiente in leggera agitazione. Per l’analisi quantitativa, sono stati trasferiti 100µl di soluzione da ciascun pozzetto in una piastra da 96 pozzetti. La lettura dell’assorbanza è stata effettuata alla lunghezza d’onda di 596 nm utilizzando un lettore di micropiastra automatico EL 808 (Bio-Tek Instruments).

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2.2.5 Saggio dell’attività fosfotransferasica della 5’-Nucleotidasi citosolica di tipo

II.

L’attività fosfotransferasica della CN-II è stata determinata preparando prima di tutto la miscela di reazione che comprende: IMP 22 mM, MgCl2 500 mM, BPG 50 mM, [8-14C] INO (4000 dpm/nmole) 8,13 mM, Tris- HCl 100 mM pH 7,4. La reazione parte con l’aggiunta al tempo 0’ di 10 e 20 µg di estratto alla miscela di reazione; si prelevano poi 8 µl e si versano su dischetti di carta a scambio ionico DE-81 carichi positivamente, in grado di legare l’IMP prodotto. Lo stesso procedimento viene ripetuto ai tempi 10’, 20’, 30’, prelevando dalla miscela mantenuta a 37° C. I dischetti sono sottoposti a tre lavaggi, di cui il primo di 15 minuti in ammonio formiato 1 mM, mentre gli altri due in acqua deionizzata per 10 minuti. Una volta asciutti, i dischetti sono posti in provette da 1 ml all’interno delle quali vengono inseriti 8 ml di liquido di scintillazione Hi safe II; la radioattività viene rilevata con uno scintillatore β-counter (Tozzi et al. 1991).

2.2.6 Western Blotting.

Per il Western Blotting sono state piastrate 2x106 cellule in piastre da 100 mm in presenza ed assenza di 2- deossiglucosio (20 mM) per 6 e 24 ore. Dopo il trattamento di 6 e 24 ore, il mezzo di coltura è stato aspirato e le cellule sono state lavate con 1 ml di PBS freddo contenente il cocktail di inibitori di proteasi addizionato con PMSF 1 mM, sodio ortovanadato 1 mM, sodio pirofosfato 5 mM e β-glicerolfosfato 20 mM. Successivamente le cellule sono state raccolte utilizzando un raschietto. Le cellule eventualmente rimaste nella piastra, sono state prelevate con un ulteriore lavaggio con 1 ml di PBS arricchito con il cocktail di inibitori di proteasi. Le cellule sono state poi centrifugate 700×g per 5 min a 4°C. Il pellet ottenuto dopo centrifugazione è stato risospeso in 200 µl di buffer di lisi contenente 150 mM di NaCl, 50 mM di NaF, 0.5 mM di EDTA pH 8.0, 0.5 % di Triton X-100 1 mM di PMSF, 1 mM di sodio ortovanadato, 5 mM sodio pirofosfato, 20 mM β- glicerolfosfato in 25 mM di Tris-Cl pH 7.4. Le provette contenenti le cellule ed il buffer di lisi sono stati agitati vigorosamente per 1 min e mantenute in ghiaccio per 10 min prima della centrifugazione a 10000xg per 40 min a 4°C. Il sovranatante infine viene raccolto e congelato a - 80° C. La concentrazione delle proteine è stata determinata allo spettrofotometro con il metodo di Bradford. La frazione proteica (30 µg per pozzetto) è stata separata mediante corsa elettroforetica SDS-PAGE (sodio dodecilsolfato-poliacrilammide gel elettroforesi) in un gel al 12% di poliacrilammide a 200 V per 45 min. Al termine della corsa, le proteine sono state trasferite su membrane di polivinilidene fluoruro (PVDF) a 90 V per 1 ora, usando il sistema di trasferimento Bio-Rad. Dopo il trasferimento delle proteine, le membrane sono state bloccate in 5% di albumina di siero bovino (BSA) (w/v) sciolto in Tampone Tris Salino-T (TBS addizionato con 0.1% (v/v) Tween-20) per le proteine fosforilate o in 5% di latte scremato (w/v) sciolto in TBS-T (TBS addizionato con 0.1% (v/v) Tween-20) per quelle non fosforilate. Le membrane sono state poi incubate con l’anticorpo primario overnight a 4°C. Il legame dell’anticorpo primario alla proteina di interesse è stato evidenziato incubando la membrana con uno specifico anticorpo secondario coniugato con la perossidasi (HRP) per 1 h a temperatura ambiente. L’HRP in presenza dell’ECL mix catalizza l’ossidazione del substrato chemiluminescente sviluppando luce.

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Per il western blot sono stati utilizzati: anticorpi primari specifici per: mTOR tot 1:1000 in 5% di latte scremato(w/v) in TBS-T; mTOR-P 1:1000 in 5% di albumina di siero bovino (BSA) (w/v) in TBS-T p53 tot 1:500 in 5% di latte scremato (w/v) in TBS-T; p53-P 1:1000 in 5% di latte scremato (w/v) in TBS-T; p70S6K tot 1:500 in 5% di BSA (w/v) in TBS-T; p70S6K-P 1:1000 in 5% di BSA (w/v) in TBS-T; PGC1a tot 1:2000 in 5% di latte scremato (w/v) in TBS-T; ERK-P 1:3000 in 5% di latte scremato (w/v) in TBS-T; ERK TOT 1:500 in 5% di BSA(w/v) in TBS-T e anticorpi secondari coniugati con HRP IgG anti-mouse ed anti-rabbit 1:3000 in 5% di latte scremato (w/v) in TBS-T. L’anticorpo anti-βactina 1:20000 in 3% di latte scremato (w/v) in TBS-T è stato utilizzato per il controllo di caricamento e per la normalizzazione dei risultati.

L’analisi densitometrica è stata effettuata usando il software ImageJ 1.51j8.

2.2.7 Saggio di mobilità (wound healing).

Questo saggio è una tecnica in vitro usata al fine di valutare la migrazione cellulare in due dimensioni. Generalmente in un monostrato, viene creata un'area di separazione tra le cellule attraverso danni meccanici, termici o chimici; nel nostro caso l’insulto che ci ha permesso di determinare la formazione del setto di divisione è stato di natura meccanica (graffio in direzione diagonale con puntale da 200µl o rimozione di un inserto presente su piastra specifica). L'esposizione all'area libera delle cellule induce quest’ultime a migrare nello spazio. Le pScont e pScN-II sono state piastrate alla densità di 180000 cellule/cm2 _{in ciascuno dei due} inserti presenti nelle Culture-Insert 2 well micro-Dish (IBIDI). Trascorse 12 ore, tempo necessario per permettere alle cellule di aderire alla piastra, è stato rimosso l’inserto. Successivamente, il mezzo è stato aspirato e dopo due lavaggi con PBS, le cellule sono state incubate per 48 h, in terreno DMEM contenente 0,25% di FBS. La migrazione viene seguita per diverse ore e le immagini vengono acquisite ed analizzate tramite lo strumento JuliBr Live Cell Movie.

2.2.8 Analisi statistica.

Tutti i dati sono riportati come media ± SD. Le differenze significative tra i gruppi sono state determinate usando lo Student’s t-test per dati non appaiati o l’analisi della varianza ad una via (ANOVA) seguita dal confronto multiplo Tukey. Per l’analisi statistica è stata utilizzata la versione 4.0 del software GraphPad InStat (GraphPad Software, San Diego, CA). Un valore p (p value) <0.05 è stato considerato statisticamente significativo.

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