Seconda parte dello studio: Branch models

I geni candidati presi in considerazione codificano per proteine coinvolte in numerosi processi fisiologici, non solo legati alla risposta cellulare all’ipossia. Le analisi precedenti ci hanno dato informazioni su come si sono evolute queste sequenze proteiche tuttavia non sono stati presi in considerazione fattori legati all’adattamento all’ipossia.

In questa seconda parte dello studio sono stati applicati dei modelli in grado di valutare la presenza di differenze nei tassi di sostituzione tra specie e alcune delle quali caratterizzate dall’adattamento ad ambienti ipossici..

Confrontare due linee distinte da un particolare adattamento permette di ipotizzare che eventuali differenze nei tassi di sostituzione siano dovute alla caratteristica che le contraddistingue, in questo caso l’ipossia. Questo permette di individuare più facilmente casi di selezione adattativa, diversificante.

Le analisi effettuate con questi modelli sono ristrette ai geni EPO ed HIF1a poiché tra i geni candidati sono gli unici per i quali sono disponibili le sequenze per la maggior parte delle specie di mammiferi che vivono in condizioni di ipossia considerate in questa parte dello studio.

7.3.4.1 Il dataset

Le specie di mammiferi adattate ad ambienti “ipossici” per le quali sono disponibili le sequenze di almeno uno dei due geni sopra citati sono: Vicugna pacos (Alpaca), Bos

grunniens (Yak o bue tibetano), Pantholops hodgsonii (Antilope tibetana), alcune specie

del genere Spalax (topo-talpa), Tursiops truncatus (delfino).

L’Alpaca appartiene alla famiglia dei Camelidae e rappresenta una delle specie domestiche più diffuse in Sud America insieme al Lama (Lama glama). Vive ad altitudini comprese tra i 3500 e i 5000 metri sulle Ande del Peru meridionale, della Bolivia settentrionale e del nord del Cile. Lo Yak, o bue tibetano, e l’Antilope tibetana appartengono entrambi alla famiglia dei Bovidae e sono diffusi negli altopiani del Tibet dove vivono a quote anche superiori ai 5000m.

105 Spalax rappresenta una specie di ratto-talpa cieca appartenente alla famiglia degli Spalacidae, che vive sotto terra a concentrazioni di O2 e CO2 variabili. Rappresenta il mammifero in grado di tollerare meglio e per tempi più lunghi l’ipossia: test di laboratorio hanno dimostrato che ha la capacità di sopravvivere anche per 14 ore a concentrazioni di ossigeno pari al 3% rispetto al ratto che decede dopo sole 2-4 ore (Shams et al. 2004).

Tursiops truncatus, più comunemente noto come delfino dal naso a bottiglia è un cetaceo

odontoceto appartenente alla famiglia dei Delfinidi. I cetacei sono comunemente noti per essere mammiferi completamente adattati alla vita acquatica e in grado di rimanere sott'acqua senza respirare (ipossia) per periodi di tempo molto più lunghi di tutti gli altri mammiferi.

Le specie utilizzate nell’applicazione di questi modelli sono indicate in Appendice 4 e le relazioni tra le specie utilizzate sono rappresentante in figura 25.

EPO HIF1a

106

7.3.4.2 Analisi dell’insieme delle specie adattate all’ipossia

Anche in questo caso abbiamo fatto delle ipotesi a cui abbiamo cercato di dare una risposta sfruttando i modelli di CODEML che stimano come varia tra i rami della filogenesi. In questi modelli è necessario specificare qual è la linea filogenetica per la quale si vuole testare l’ipotesi di un tasso evolutivo distinto dal resto dell’albero. Questi rami della filogenesi saranno segnalati al programma come rami foreground, mentre tutti gli altri saranno considerati rami background.

Nel nostro caso sono definiti foreground i rami della filogenesi che portano a specie adattate all’ipossia e background i rami che portano a specie che vivono in condizioni normali di ossigeno.

La prima cosa ci siamo chiesti è stata:

Le specie adattate all’ipossia e le specie che vivono in normali condizioni di ossigeno hanno subito pressioni selettive differenti? Ossia, i rami foreground assumono valori di omega differenti da quelli dei rami background?

Per rispondere a questa domanda abbiamo applicato i modelli più semplici definiti branch

models che permettono ad di variare lungo i rami della filogenesi, ma non tra i diversi

siti, stimando un medio su tutti i siti (Yang 1998, Yang 2007b). Questo permette di testare se ci sono differenze nei tassi di sostituzione tra i rami della filogenesi definiti come descritto sopra.

Modelli (M) applicati:

Ipotesi nulla (one ratio): assume lo stesso valore su tutti i rami.

Ipotesi alternativa (two-ratio): il/i ramo/i foreground assumono un valore di

diverso rispetto ai rami background, stimato dal programma.

Se il confronto tra i modelli mediante LRT favorisce il modello alternativo allora si può ipotizzare che le specie adattate all’ipossia si siano evolute con un tasso differente rispetto alle altre specie.

107 Una prima analisi è stata svolta raggruppando sotto la definizione di foreground i rami di tutte le specie adattate all’ipossia. Il confronto dei modelli in questo caso non ha portato risultati significativi né per EPO né per HIF1a (p-value>0,05) indicando che non ci sono sufficienti evidenze per affermare che le specie adattate all’ipossia abbiano valori di omega significativamente differenti da quelli di tutte le altre specie per questi due geni. Tuttavia le specie raggruppate come foreground sono adattate a condizioni diverse di ipossia e da tempi differenti. Se avessimo rilevato un diverso tasso evolutivo per tutte le specie ipossiche, pur molto distanti evolutivamente, avremmo concluso che l’adattamento sia stato raggiunto attraverso una forte convergenza che però, dato il numero di fattori implicati nella risposta fisiologica all’ipossia, potrebbe non essere molto probabile. Per questo abbiamo ripetuto le analisi considerando le specie adattate all’ipossia una alla volta come ramo foreground, escludendo dall’analisi le altre specie ipossiche.

7.3.4.3 Analisi delle singole specie adattate all’ipossia

Questa analisi ci ha permesso di individuare un valore specifico di omega per ognuno dei rami foreground testati nelle diverse analisi. Per quanto riguarda le specie di Spalax, queste sono state considerate tutte insieme indicando come ramo foreground quello che porta alla famiglia degli Spalacidae.

I risultati di questa analisi sono mostrati in tabella 10.

Per quanto riguarda il gene EPO nessuno dei confronti è risultato significativo (p- value>0,05) indicando che le specie che vivono in normali condizioni di normossia e le specie adattate all’ipossia, anche quando considerate separatamente, non mostrano differenze significative nei tassi di sostituzione.

Se si considera invece il gene HIF1a, il confronto mediante LRT tra il modello nullo e il modello alternativo ha mostrato risultati significativi nel test in cui come specie adattata all’ipossia è stato considerato il Bos grunniens (Yak). Sebbene il valore stimato di sia 0,89 per lo Yak e dunque non sia indicativo di selezione positiva per l’intero gene, la significatività del test ci indica che questa linea abbia subito un’accelerazione evolutiva

108 rispetto al resto dell’albero che potrebbe essere il risultato di un adattamento a condizioni di bassa pressione di ossigeno.

Modello nullo Modello alternativo

Specie foreground (ipossia) (normossia) LRT p-value

EPO