Per confermare le mutazioni geniche a carico del gene di fusione BCR-ABL, il DNA è stato sequenziato mediante ABI 310 (Applied Biosystem). Il processo è complesso e formato da diverse fasi:
• PCR (Polymerase chain reaction, reazione a catena della polimerasi): è una reazione di
amplificazione delle sequenze di DNA, innescato da una coppia di primer la cui sequenza può essere ricavata da articoli e banche dati o mediante progettazione ex-novo. Con la PCR, attraverso 40 cicli, si possono amplificare specifici frammenti di DNA, solitamente tra 200 e 1200 bp, utili per il sequenziamento. La procedura viene allestita aggiungendo 1 µL di DNA dei campioni con una concentrazione di 20 ng/μL e utilizzando la ricetta inserita in tabella 2.
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Il programma di amplificazione è caratterizzato dall’alternarsi di tre diversi stadi di temperatura per 40 cicli:
- denaturazione, a 95°C per 30 s, che permette la separazione dei due filamenti di DNA, - annealing, 50-65°C per 30 s, con una temperatura specifica per ciascuna coppia di primer
che determina l’appaiamento dei due con le rispettive regioni complementari all’interno dei filamenti di DNA denaturati,
- elongazione, a 72°C per 30 s, che permette la sintesi del DNA grazie all’intervento della Taq, utilizzando il singolo filamento come stampo.
Ne risulta, così, un’amplificazione esponenziale del segmento di DNA di interesse.
• Gel di controllo della PCR: viene valutata la buona riuscita dell’amplificazione tramite una
corsa elettroforetica su gel preparati al momento. Il gel viene preparato sciogliendo 0, 5 g di agarosio (UltraPure™ Agarose) in 50 mL di TBE 0,5X, a cui si aggiungono 2 µL di SYBR™
Safe DNA Gel Stain (tutti forniti da Invitrogen™). Una volta pronto, si caricano 3 µL di
campione addizionati con 2 µL di DNA Gel Loading Dye (6X, ThermoFisher Scientific) e si lascia correre a 120 V per circa 20’. Il DNA così intercalato emette luce fluorescente (590 nm), rilevata tramite VERSADOC-4000 (BIO-RAD), uno strumento dotato di fotocamera digitale attraverso la quale si acquisisce l’immagine del gel.
I campioni vengono conservati overnight in emoteca a 4°C.
• Purificazione della PCR: la purificazione dei campioni viene effettuata tramite CleanSweep™ PCR Purification Reagent (ThermoFisher Scientific), per cui si addizionano 5 µL di prodotto
della PCR con 2 µL di reagente del kit. La soluzione così ottenuta viene quindi posta a 37°C per 15’ per idrolizzare i primer e defosforilare i dNTP, poi viene incubata a 80°C per 15’ per inattivare il reagente aggiunto.
Tabella 2 - Componenti necessari per la reazione di amplificazione
Reagenti Volume/Campione (µL)
FastStart™ Taq DNA Polymerase
Primer Forward 10 nM Primer Reverse 10 nM 10X Buffer MgCl2 dNTP mix Nuclease-free H2O 0,25 1,25 1,25 2,5 1,5 0,5 16,75 Totale 24 μL
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• Cycling: il protocollo prevede che il filamento del DNA sia amplificato in maniera
indipendente per ciascuno dei due primer, in presenza dei terminatori BigDye. Per ogni campione sono stati quindi amplificati sia il filamento guidato dal primer forward sia quello del reverse in due reazioni separate. Per ottenere la soluzione di cycling si utilizzano i reagenti riportati in tabella 3, mentre il programma di amplificazione è riassunto in tabella 4.
Si avvia il programma di cycling, dopo aver introdotto i campioni in PCR, e si effettua la reazione impostando 25 ripetizioni secondo il seguente schema:
• Purificazione del prodotto di cycling: lo scopo perseguito con questo passaggio è quello di far
precipitare il DNA e purificarlo da eventuali residui aspecifici. Si prepara quindi una mix per ogni campione seguendo lo schema riportato in tabella 5.
Tabella 5 - Reagenti utilizzati per la precipitazione del DNA
Reagenti Volume/Campione (µL)
EtOH assoluto
Acetato di Sodio 3M (NaAc) Nuclease free water
30,64 1,5 7,86
Totale 4,5
In ogni tubino contenente il DNA amplificato e marcato, si aggiungono 40 μL di mix e si esegue un’incubazione a -20°C di almeno 2 ore. Trascorso il tempo necessario, si esegue una centrifuga
Tabella 3 - Componenti utilizzati per il cycling
Reagenti Volume/Campione (µL) Big Dye Primer 10 ng/μL Buffer 5X Campione Nuclease-free H2O 1 0,32 2 1 5,68 Totale 10 μL
Tabella 4 - Schema di amplificazione per il programma di cycling
Fase Step 1 Step 2 Step 3
Temperatura (°C) 96 96 54
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a 4°C per 30’ alla massima velocità e si svuota accuratamente la eppendorf. Si aggiungono 100 µl di EtOH al 70% (300 µl acqua + 700 µl di etanolo) e si esegue un’ulteriore centrifuga a 4°C per 15’. Si svuota nuovamente la eppendorf e si lascia asciugare l’etanolo mediante una centrifuga di 5’ a 500 rpm con l’apertura dei tubini rivolta verso il basso.
• Solubilizzazione e denaturazione: si solubilizza il DNA con 10 µl di formammide e si
effettua un ciclo di denaturazione dei campioni per 2’ a 96°C. Terminata questa operazione i campioni sono pronti per essere analizzati nel sequenziatore.
• Sequencing: l’ultimo passaggio prevede
l’analisi in un sequenziatore automatico (Fig. 24), uno strumento con elevate potenzialità che permette di identificare mutazioni o anomalie strutturali nella sequenza dei DNA. Infatti, il sequenziamento permette di ricostruire l’ordine delle basi azotate che si susseguono all’interno di un tratto di DNA.
Il sequenziamento automatico prevede l’utilizzo di fluorocromi, non radioattivi e non tossici, per marcare i diversi ddNTP (dideossiribonucleotidi) e dell’elettroforesi capillare, usando come mezzo di separazione un polimero incluso nel capillare di silice. La soluzione contenente l’amplificato viene posta a contatto con l’anodo del capillare su cui viene applicato un campo elettrico. Le molecole del campione cominciano a migrare con velocità differenti lungo il capillare e i frammenti di DNA marcato vengono colpiti da una sorgente luminosa (laser ad Argon) che gli permette di emettere una fluorescenza rilevabile da un sensore. La fluorescenza produce quattro differenti colori, ognuno dei quali è associato ad una base nucleotidica: adenina, timina, guanina e citosina. La rappresentazione dei risultati ottenuti è costituita da un’elettroferogramma, in cui ogni picco rappresenta una base letta durante il procedimento. Si individuano, così, la successione delle basi che rappresentano la sequenza.