Sonde sequenza-specifiche

Idrolisi della sonda (TaqMan): si serve di una sonda recante un

fluoroforo (TaqManProbe), la quale è costituita all’estremità 5’ da una molecola ad alta energia detta REPORTER e da una a bassa energia all’estremità 3’ detta QUENCHER; la sonda è in grado di legarsi ad una specifica sequenza del templato. Quando la sonda è integra e viene eccitata da una fonte di luce, l’emissione del Reporter viene soppressa dal Quencher, a causa della vicinanza delle due molecole (FRET o Fluorescent Resonance Energy Transfer).

Se il probe viene tagliato, per effetto dell’attività 5’-esonucleasica caratteristica della Taq polimerasi, il trasferimento di energia tra i due ha termine in quanto l’emissione del Reporter sarà libera. Ne consegue un aumento di segnale direttamente proporzionale alla quantità di amplificato; tale segnale verrà poi catturato dal rilevatore (Manuale Roche, 2005).

Ibridazione della sonda: questa metodica richiede l’utilizzo di due

sonde marcate bersaglio-specifiche. La prima sonda di ibridazione posta a monte risulta marcata all’estremità 3’ con un fluorocromo FRET (colorante), che si comporta da donatore di energia di trasferimento fluorescente. La seconda sonda posizionata a valle è marcata all’estremità 5’ con un fluorocromo accettore. Quando eccitati, entrambi i fluorocromi emettono un segnale fluorescente specifico. Quando le due sonde invece le due sonde marcate sono libere nella soluzione, la distanza che intercorre tra di esse impedisce il trasferimento di energia tra i rispettivi fluorocromi. Le due sonde di acido nucleico marcate sono disegnate per ibridare con determinate sequenze bersaglio in modo che i fluoro cromi finiscano in posizione adiacente. Quando entrambe le sonde sono legate alla sequenza bersaglio, la vicinanza tra il colorante donatore e l’accettore permette il trasferimento di energia. Il risultato è l’emissione di fluorescenza ad una specifica lunghezza d’onda da parte dell’accettore. L’intensità della fluorescenza misurata nella reazione è proporzionale al numero di sonde ibridate alle sequenze bersaglio e alla quantità di prodotto bersaglio-specifico presente nella reazione (Manuale Roche, 2005).

Molecular beacons: essi sono delle variazioni degli oligonucleotidi

sonda a doppia marcatura. Presentano una struttura a forcina (“stelo e ansa”) contenente un fluorocromo con un quencher interno e, in soluzione libera, non emettono livelli di fluorescenza rilevabili. L’ansa della molecular beacon è una sequenza specifica con funzione di sonda complementare ad una molecola di acido nucleico bersaglio. Le sequenze del braccio ai lati della sonda sono complementari tra loro ma non sono correlate alla sequenza bersaglio e sono in grado di ibridare formando uno stelo. All’estremità di un braccio è legato un fluorocromo reporter mentre all’estremità dell’altro braccio è legato un quencher. Le sequenze del braccio formanti lo stelo, quando ibridate tra loro, mantengono il fluorocromo ed il quencher strettamente vicini, facendo si che la potenziale fluorescenza del fluorocromo possa essere “spenta” con un trasferimento di energia.

Quando una molecular beacon incontra la sua sequenza bersaglio di acido nucleico, le due molecole si legano formando un ibrido più stabile e più lungo dello stelo della molecular beacon. Essa va incontro spontaneamente ad un cambio conformazionale che allontana lo stelo, facendo così aumentare la distanza tra fluorocromo e quencher. In questo modo si interrompe il trasferimento di energia ed aumenta notevolmente il segnale fluorescente della molecular beacon, fino a livelli rilevabili. Questo meccanismo di rilevamento è abbastanza efficiente da permettere la discriminazione di singoli appaiamenti errati tra coppie di basi (Manuale Roche, 2005).

Fig.14: Molecular beacon.

Primer scorpion: sono primer PCR costituiti da uno stelo ed una coda

ad ansa contenente un fluorocromo ed un quencher. In questa conformazione il primer scorpion non è in grado di fluorescere perchè il fluorocromo è spento e lo stelo e l’ansa sono separati dalla sequenza

del primer da un “bloccante PCR”, ovvero una modifica chimica che impedisce alla DNA polimerasi di copiare la sequenza dello stelo e dell’ansa del primer scorpion durante l’amplificazione.

Nel corso della PCR, il primer scorpion è esteso a partire dalla sua estremità 3’; durante la fase di ibridazione, la sequenza della sonda nella coda del primerscorpion si ricurva per ibridare con la sequenza bersaglio del prodotto di PCR, separando così il fluorocromo dal quencher, e permettendo l’emissione di una fluorescenza rilevabile (Manuale Roche, 2005).

Fig. 15: Primer scorpion.

Il primo tipo di approccio, ovvero i coloranti fluorescenti, risulta il più semplice e meno costoso. Esso consente di monitorare l’amplificazione della doppia elica di DNA senza necessitare dell’utilizzo di una sonda, con lo svantaggio però, come già detto in precedenza, di ottenere falsi positivi per l’incapacità del colorante di discriminare tra le diverse specie di dsDNA. Di conseguenza ogni artefatto del primer ed altri prodotti di reazione non specifici contribuiranno alla misurazione dell’intensità del segnale fluorescente.

Per quanto riguarda la metodica basata su sonde sequenza-specifiche, in particolare la TaqMan, data la presenza della sonda stessa, essa possiede un’alta specificità. La sensibilità dei due approcci risulta comunque simile. Per tutti questi motivi, abbiamo utilizzato la metodica TaqMan al fine di valutare l’espressione del gene BAALC.

3.4.2 Protocollo

La metodica da noi utilizzata, ovvero la TaqMan mostrata in Figura 6, si esplica in 4 punti (Manuale Roche, 2005):

1) Costruzione di una sonda oligonucleotidica tramite l’utilizzo di opportuni software che ne definiscono la sequenza in base alla temperatura di melting (Tm) ed alla dimensione del prodotto di PCR (amplicone); inoltre le sequenze progettate non contengono regioni ricche in GC o regioni che potrebbero formare forti strutture secondarie. Ogni probe viene successivamente analizzato per verificare l’ibridazione potenziale (analisi di omologia), confrontando la sua sequenza con quelle contenute nei principali database a disposizione. 2) Se la sequenza target è presente, la sonda lega nel sito 3’ del

primer forward e viene tagliata dalla Taq polimerasi quando questa inizia a polimerizzare.

3) Il taglio della sonda porta a:

 separazione tra Quencher e Reporter, aumentandone così il segnale;

 rimozione della sonda dall’elica target, permettendo così l’estensione da parte dei primer la cui attività non viene perciò inibita.

4) Ad ogni ciclo le molecole di reporter subiscono un distacco dai rispettivi probe, con il risultato di un aumento dell’intensità della fluorescenza, la quale risulta essere direttamente proporzionale alla quantità di amplicone prodotto.

Fig. 16: Rappresentazione schematica di un saggio di RQ-PCR con il metodo TaqMan.