standardizzazione: esistono diversi protocolli standard, nazionali e internazionali, che descrivono le varie fasi del test in maniera sistematica e puntuale.

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8.4 I bivalvi Crassostrea gigas e Mytilus galloprovincialis

8.4.1. Classificazione e morfologia

I bivalvi marini del genere Crassostrea e Mytilus sono organismi filtratori comunemente utilizzati come bioindicatori della qualità dell‟ambiente costiero. Questi organismi, infatti, sono in grado di bioaccumulare sia inquinanti organici sia metalli pesanti, e rispondono alle alterazioni indotte con caratteristici meccanismi fisiologici e genetici (Varotto, 2007). Più in particolare, la specie Mytilus galloprovincialis è presente a latitudini temperate in entrambi gli emisferi, anche se le sue zone di distribuzione possono comprendere acque più calde come quelle del mar Mediterraneo. L‟ostrica Crassostrea gigas, invece, originariamente era una specie esotica, proveniente dal Giappone ed introdotta nelle zone costiere estuarine dell‟America occidentale. Oggi questa specie si può ritrovare in Giappone, Corea, Siberia, Australia, Stati Uniti e Canada. In Europa è presente dalle isole inglesi fino al Portogallo ed anche nel mar Mediterraneo e nell‟Adriatico (fonte: www.fao.org). La classificazione completa di entrambe le specie è riassunta nelle tabelle 8.6 e 8.7.

Tabella 8.6 - Classificazione di Mytilus galloprovincialis ai diversi livelli tassonomici.

Tabella 8.7 - Classificazione di Crassostrea gigas ai diversi livelli tassonomici.

I molluschi bivalvi C. gigas e M. galloprovincialis possiedono le caratteristiche per essere dei buoni indicatori di qualità ambientale.

Regno Animalia Phylum Mollusca Classe Bivalvia Famiglia Mytilidae Genere Mytilus

Specie Mytilus galloprovincialis

Regno Animalia Phylum Mollusca Classe Bivalvia Famiglia Ostreidae Genere Crassostrea

DIEGO MINETTO – Tesi di Dottorato in Scienze Ambientali – XXIV Ciclo ₁₇₁ Figura 8.8 (a) e (b) – Esemplari di mitili M. galloprovincialis (a sx) e di ostrica C. gigas (a dx).

Il mitilo M. galloprovincialis possiede una conchiglia piuttosto liscia con due valve unite da del tessuto connettivo detto legamento della cerniera. Inoltre possiede dei muscoli ad esso antagonisti detti muscoli adduttori, responsabili della chiusura delle valve. Un‟appendice muscolosa, chiamata piede, è invece utilizzata dai mitili per sondare il substrato e, eventualmente, effettuare brevi spostamenti. Una volta raggiunto il substrato più idoneo i mitili producono dei filamenti proteici (bisso) che permettono loro di aderirvi efficacemente. Le gonadi sono costituite da tessuto ghiandolare che si insinua tra gli organi digestivi ed il mantello, una sorta di lamina che racchiude la massa viscerale. Gli adulti possono raggiungere le dimensioni di 10 cm anche se, mediamente, misurano c.a. 4 – 5 cm e sono, generalmente, di sessi separati. La maturità sessuale è raggiunta in circa 5 - 8 mesi. Le femmine possono emettere dai 5 ai 12 milioni di gameti (Varotto, 2007).

L‟ostrica C. gigas ha una conchiglia estremamente ruvida, molto scanalata e laminata. La valva inferiore ha una forma ricurva accentuata mentre quella superiore è piana. Come per i mitili, l‟apertura è regolata da appositi muscoli adduttori. Da adulte possono raggiungere i 25 cm di lunghezza anche se, di solito, le dimensioni medie sono di 10 – 15 cm. Gli adulti sono ermafroditi proterandri ovvero nascono di sesso maschile. Circa la metà di questi resterà di sesso maschile, gli altri, invece, muteranno il sesso. La maturità sessuale è raggiunta durante il primo anno di vita. Le ostriche sono molto prolifiche e ciascuna femmina può rilasciare fino a 50 – 100 milioni di uova in una singola emissione (U.S. Department of Interior and U.S. Army Corps of Engineers, 1988 - Biological Report 82(11.85), TR EL-82-4).

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8.4.2 Ecologia e riproduzione

I bivalvi sono organismi rappresentativi degli ambienti marini e di transizione grazie alla loro ampia distribuzione. Inoltre, giocano un ruolo ecologicamente importante nell‟ambiente sia come “filter feeders”, essendo comuni negli habitat marini di scogliera dove filtrano nella colonna d‟acqua fitoplancton, microalghe bentiche risospese, protozoi e detrito organico, sia come “deposit feeders”, trovandosi soprattutto nei sedimenti fangosi dove rimuovono particellato organico, in competizione per il cibo con la comunità microbica del sedimento (Losso, 2003). Sia i mitili che le ostriche riescono a trattenere particelle inferiori ai 2 – 3 µm, con un efficienza del 80 – 100%. Il periodo riproduttivo varia, nelle due specie.

Quando per i bivalvi le condizioni ambientali sono favorevoli essi iniziano a riprodursi. A fecondazione avvenuta, gli embrioni cominciano a svilupparsi fino a raggiungere lo stadio di larve natanti dette veliger o D-shape, per la loro caratteristica forma a “D”. Questo processo prevede tempistiche differenti, a seconda della specie. Questa fase, infatti, si estende per 48 h nel caso dei mitili e per 24 h nel caso delle ostriche.

Figura 8.9 - Embriologia del M. edulis. 1 – 4 = segmentazione (gp = globo polare; lp = lobo polare); 5 = blastula; 6 = gastrula; 7 = gastrula ciliata; 8 – 9 = trocofora; 10 = veliger (Losso, 2003).

DIEGO MINETTO – Tesi di Dottorato in Scienze Ambientali – XXIV Ciclo ₁₇₃ La temperature ideali di crescita per i mitili sono comprese tra i 5 ed i 20 °C (Varotto, 2007), mentre per le ostriche queste devono essere di 20 °C o superiori, per almeno 3 settimane consecutive, successive al raggiungimento dello stadio di veliger (U.S. Department of Interior and U.S. Army Corps of Engineers, 1988 - Biological Report 82(11.85), TR EL-82-4).

8.4.3 I test di tossicità 8.4.3.1 Princìpi

I test di ecotossicologici che prevedono l‟uso di bivalvi possono essere distinti in test a breve termine, caratterizzati da un breve periodo di esposizione degli embrioni (ore o al massimo giorni) a concentrazioni elevate di sostanza tossica, e test a lungo termine, con esposizioni che possono durare per diverse settimane a concentrazioni sub-letali d‟inquinante. Il test a breve termine fornisce una risposta immediata, è sensibile e di facile esecuzione; il test a lungo termine è molto sensibile, ma richiede strumentazioni aggiuntive per la coltura del fitoplancton con cui nutrire le larve. Ad ogni stadio vitale dei bivalvi corrisponde un determinato tipo di test (Losso et al, 2003):

 la fertilizzazione prevede l‟esposizione al tossico dello sperma con cui vengono fecondate le uova non contaminate: questa tipologia di test (test di spermiotossicità) è poco usata con i bivalvi, perché notoriamente meno sensibile rispetto all‟embriotossicità;  lo sviluppo embrionale, dall‟uovo fecondato alla larva D-shape, è il responso

maggiormente usato nei test a breve termine con bivalvi (test di embriotossicità). Il periodo d‟incubazione delle uova per raggiungere questo stadio larvale varia da specie a specie (24 h per Crassostrea sp., 48 h per Mytilus sp.);

 lo sviluppo larvale, dal veliger (larva D-shape) al pediveliger (circa 20 giorni) è utilizzato nei test a lungo termine, che considerano come endpoint sia la mortalità che alcuni parametri morfometrici relativi allo sviluppo della larva (lunghezza, larghezza).

Il principale limite dei test con i bivalvi è legato alla difficoltà di avere sempre a disposizione esemplari sessualmente maturi per l‟emissione di gameti. Per ovviare a questo limite, il periodo riproduttivo di alcune specie può essere “dilatato” ricorrendo al condizionamento degli organismi. Con questa tecnica, usata soprattutto con le ostriche, la maturazione delle gonadi è ottenuta in laboratorio tramite l‟aumento graduale della temperatura dell‟acqua fino a 24 - 25 °C e il mantenimento degli organismi in condizioni stabili per un periodo che va da una a otto settimane (Losso, 2003).

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Nella fattispecie, per questo lavoro di Tesi, coi bivalvi sono stati effettuati test di embriotossicità.

Questo tipo di test è un test di tossicità sub-cronico basato sull‟osservazione delle eventuali anomalie che possono insorgere, a causa dell‟esposizione ad un tossico, durante la delicata fase dello sviluppo larvale (fig. 8.9). L‟esposizione, quindi, deve essere mantenuta per tutto il tempo dello sviluppo larvale che, come si è visto (cfr. par. 8.4.2), ha una durata di 48 h nel caso dei mitili e di 24 h nel caso delle ostriche. La percentuale di anomalie rilevata (somma delle larve malformate e degli embrioni non sviluppatisi) rispetto alle larve sane è dunque proporzionale agli effetti embriotossici della sostanza testata. Da queste percentuali è possibile, inoltre, ricavare il valore di EC50 per la sostanza risultata embriotossica.

8.4.3.2 Elaborazione dei dati

Trascorso il necessario tempo di esposizione (24 o 48 h), il test viene fissato con formalina. Si passa quindi al conteggio delle anomalie, per ricavare la misura della tossicità, osservando 100 embrioni e annotando se questi sono: a) normoformati, b) malformati, oppure c) non sviluppati (rimasti allo stadio di trocofora). La somma di b) + c) è pari alla percentuale di effetto. Il dato deve essere normalizzato, rispetto al controllo negativo, mediante l‟algoritmo di Abbott, ovvero:

100 % 100 % % _         C C i Eff Eff Eff

dove %Effi è la % di effetto dell‟osservazione i-esima e %EffC la % di effetto nel controllo

negativo.

Una volta in possesso dei dati di effetto normalizzati, è possibile ricavare il valore di EC50 mediante l‟utilizzo di un programma basato sul metodo non parametrico “Trimmed Spearman- Karber”. Il metodo è in grado di aggiustare opportunamente (trim) la poligonale ricavata dai punti sperimentali, eliminando una parte di dati al disotto e al di sopra di un certo valore, in modo da ottenere la retta che meglio rappresenta l‟insieme delle osservazioni sperimentali. Dall‟equazione lineare così calcolata, il programma fornisce il valore di EC50 per la sostanza testata.

8.4.3.3 Caratteristiche

Come già detto, uova, embrioni e larve dei molluschi bivalvi sono da tempo utilizzati nei test di tossicità. I vantaggi nell‟uso dei primi stadi vitali sono:

1) l‟alta sensibilità: gli organismi nella cruciale fase di sviluppo embrionale sono