STRUTTURA DELLE PGIP

Le PGIP codificano per una proteina comprendente un peptide segnale, indispensabile per la traslocazione nel reticolo endoplasmatico, e, per un polipeptide maturo di 300-315 residui amminoacidici, che presenta diversi potenziali siti di glicosilazione. La PGIP matura è caratterizzata dalla presenza di un dominio LRR, formato da 10 ripetizioni, di circa 24 residui amminoacidici ciascuno, e da terminazioni carbossiliche ed amminiche altamente conservate. Le PGIP sono caratterizzate dal fatto che presentano elementi di struttura secondaria caratteristici, costituiti da foglietti β (β-strand/β-turn), che si formano per la presenza, in ogni modulo LRR, di motivi xxLxLxx. I residui di leucina formano un core idrofobico, mentre le catene amminoacidiche laterali, fiancheggianti le leucine, sono esposte al solvente ed interagiscono con il ligando (Kobe e Deisenhofer, 1995). Il motivo xxLxLxx è ipervariabile, ed è ritenuto il probabile sito di legame con il ligando. L’analisi della famiglia genica Pgip, in fagiolo e Arabidopsis, ha evidenziato che la principale forza divergente per queste proteine è determinata dall’insorgenza di mutazioni puntiformi, come delezioni, inserzioni e sostituzioni al livello del motivo xxLxLxx. Come accennato precedentemente, le piante possono esprimere più tipi di PGIP che, seppur differenziandosi per pochi residui amminoacidici, manifestano differenti specificità nei confronti di PG diverse, secrete dallo stesso patogeno o da patogeni di specie differenti (De Lorenzo et al., 2001). Un esempio esplicativo, ci è fornito da esperimenti di mutagenesi sito-specifica, effettuati sulle PGIP di fagiolo (PvPGIP). La PGIP1 inibisce la PG di A. niger, ma non quella di Fusarium moniliforme, mentre la PGIP2 le inibisce entrambe. La sostituzione al residuo amminoacidico 224 della PGIP2 con quello presente sulla PGIP1 (Lys caratteristica della PGIP1 al posto della Gln), determina la perdita di inibizione nei confronti della PG di F. moniliforme (Leckie et al.,1999), dimostrando che anche una singola mutazione, è in grado di determinare un cambiamento di specificità della proteina, e questa sostituzione cade proprio all’interno del motivo xxLxLxx, ritenuto il sito di legame con il ligando. La determinazione della struttura cristallografica della PvPGIP2 (Di Matteo et al., 2003) ha

mutagenesi sito specifica effettuati sulla PG di F. moniliforme dimostrano che l’interazione con la PGIP2 è mediata da almeno due residui positivi (Arg267 e Lys269), posti in prossimità del sito catalitico della PG che sono potenzialmente coinvolti nel legame al substrato. Il gruppo di residui amminoacidici negativi della PGIP2, formati da tre residui di acido aspartico, sono conservati in tutte le PGIP (De Lorenzo et al., 2001), e interagiscono con l’Arg267 e la Lys269 della PG, e coprendone il sito attivo, ne prevengono il legame al substrato. Il fatto che la PGIP interagisca con i residui presenti nel sito catalitico dell’enzima, potrebbe evidenziare una efficiente strategia evolutiva adottata dalla PGIP stessa per impedire alla PG fungina di sfuggire al suo riconoscimento. Il residuo amminoacidico Gln224 della PvPGIP2 che è cruciale per il riconoscimento della PG di F. moniliforme, è adiacente al gruppo di residui amminoacidici negativi coinvolti nell’interazione con la PG andando a bloccare il complesso. Recentemente sono stati effettuati anche esperimenti di mutagenesi sito specifica associati a quelli di risonanza plasmonica di superficie (Spadoni et al., 2006). Da questi esperimenti effettuati sulla PvPGIP2 è stato chiarito il ruolo rivestito dal gruppo di residui amminoacidici carichi positivamente comprendenti arginina e lisina (R183, R206, K230; R252) posti vicino a quel gruppo di residui sopra citati carichi negativamente e responsabili dell’interazione con la PG (Fig. 8). A seguito di esperimenti di mutagenesi sito specifica nei quali venivano sostituiti questi residui positivi con altri di differente natura, è stato dimostrato il loro coinvolgimento nel legame alla pectina, infatti in mutanti per una singola sostituzione si riscontrava una riduzione nella capacità della PvPGIP2 di legare l’acido poligalatturonico (PGA), mentre in quelli con 2 o più sostituzioni si riscontrava una perdita totale di abilità nel legare il PGA. La cosa più interessante è il fatto che in questi mutanti non veniva persa invece l’attività inibitoria nei confronti della PG di A. niger rispetto al selvatico, ciò sta a dimostrare che questi gruppi di residui amminoacidici (per il legame alla pectina e per il legame alla PG di A. niger) sono nettamente separati. Un’ipotesi riportata in questo lavoro (Spadoni et al., 2006) per spiegare gli attuali risultati è proprio quella che chiarisce il ruolo funzionale della PGIP nella pianta, secondo questa ipotesi la PGIP viene espressa in modo costitutivo ed in associazione alla pectina al fine di preservarla dalla degradazione da parte della poligalatturonasi e ciò avviene prima della formazione del complesso caratteristico PGIP-PG. Una prova a supporto di questa affermazione si può riscontrare in esperimenti che rilevano il quantitativo di uronidi (rilasciati durante la degradazione della pectina da parte della PG) in piante transgeniche di frumento che esprimono la PvPGIP2. In quest’ultime si osserva un decremento del rilascio degli uronidi a seguito del trattamento con la PG di F. moniliforme rispetto ai controlli nullisegreganti (Janni et al., 2008); un’ipotesi per spiegare questi risultati è che probabilmente le piante transgeniche che sovraesprimono la PGIP vanno incontro a modificazioni nell’architettura della parete cellulare che renderebbe meno accessibili i siti bersaglio alle PG.

Figura 8 Struttura tridimensionale della PvPGIP2 : A) sono riportati i residui amminoacidici positivi coinvolti nel legame alla pectina; B) Potenziale elettrostatico di superficie che permette di determinare la localizzazione dei due cluster di residui amminoacidici positivi e negativi presenti nella PvPGIP2 responsabili dell’interazione con la pectina e con le PG (Spadoni et al., 2006).

Il legame delle PGIP con le PG può avere una differenza nella cinetica di inibizione come nel caso dell’inibizione verso la PG di F. moniliforme e verso la PG di A. niger. Nel primo caso abbiamo un esempio di inibizione competitiva (Federici et al., 2001) mentre nel secondo caso di inibizione non competitiva (Stotz et al., 2000). Esperimenti di docking molecolare (Sicilia et al 2005) sull’interazione delle due isoforme PvPGIP1 e PvPGIP2 con la PG di Botritis cinerea (BcPG), indicano che le due PGIP hanno un modo di inibizione del tipo misto (sia non- competitiva che competitivo) nei confronti di questa PG; in questo caso la PGIP interagisce con l’N terminale dell’enzima coprendo parzialmente il sito di taglio.