Studio della struttura della transtiretina

Per studiare la stabilità della transtiretina, come prima cosa, ho pensato di studiare nel plasma la presenza di TTR e di RBP, sapendo dalla letteratura che la forma stabile di TTR, ossia il tetramero, è legato a RBP mentre l’eventuale presenza del dimero e del monomero di TTR non lo sono. A questo scopo ho utilizzato il campione di plasma del controllo 2C. Ho effettuato una prima prova di elettroforesi nativa su gel di acrilammide al 15% con successivo western blot e il risultato lo possiamo osservare nella figura 10.

Figura 10. Nell’immagine 6A vediamo la membrana colorata con metodo colorimetrico originale. Nell’immagine 6B vediamo la membrana scannerizzata e colorata con metodo colorimetrico. Nei pozzetti 1, 2, 7 e 8 sono stati caricati 20 µl di miscela contenente 0,5 µl di plasma, nei pozzetti 3, 4, 9 e 10 sono stati caricati 20 µl di miscela contenente 1,0 µl di plasma. Nei pozzetti 5 e 6 sono stati caricati 5 µl di standard. Nella parte sinistra di entrambe le immagini è stato utilizzato l’anticorpo primario anti-TTR, mentre nella parte di destra l’anticorpo primario anti-RBP.

Osservando l’immagine 10A possiamo apprezzare la presenza di bande alla stessa altezza (indicate dalla freccia) sia nella membrana in cui è stato utilizzato l’anticorpo primario anti- TTR che nella membrana in cui è stato utilizzato l’anticorpo primario anti-RBP. Nell’immagine 10B possiamo apprezzare anche la presenza di bande con diversa mobilità elettroforetica sia per RBP che per TTR (indicate con le frecce).

Questo tipo di esperimento deve essere sottoposto ad alcune osservazioni: la prima è che nonostante il blu di bromofenolo abbia raggiunto il fronte di corsa, i pesi molecolari non hanno corso lungo tutto il gel disponibile inoltre, il western blot relativo a TTR mostra più bande di quelle attese. Per questi motivi ho deciso di ripetere questo tipo di esperimento con la preparazione di un gel al 12% per cercare di ottenere una separazione migliore sia delle bande osservate sia de marcatori di peso molecolare. Questi ultimi sono, in realtà, una preparazione commerciale per SDS-PAGE, perciò il loro comportamento in condizioni native non è noto. Inoltre, per il nuovo esperimento, ho pensato di utilizzare due diversi tipi di anticorpo primario anti-TTR: uno utilizzato in nefelometria e l’altro utilizzato in istologia, per verificare l’eventuale presenza di bande aspecifiche.

Dalla seconda prova di elettroforesi nativa e western blot in cui sono stati testati due diversi anticorpi primari contro TTR possiamo osservare il risultato nella figura 11.

Figura 11. A: Immagine della membrana di nitrocellulosa in seguito a corsa elettroforetica colorata con colorante Ponceau. B: Immagine della membrana scannerizzata in seguito a western blot eseguito con Ab primario della nefelometria (sinistra) e Ab primario dell’istologia (destra) colorata con metodo colorimetrico. Nei pozzetti 1, 2, 7 e 8 sono stati caricati 20 µl di miscela contenente 0,5 µl di plasma, nei pozzetti 3, 4, 9 e 10 sono stati caricati 20 µl di miscela contenente 1,0 µl di plasma. Nei pozzetti 5 e 6 sono stati caricati 5 µl di standard.

L’immagine 11A corrisponde alla membrana di nitrocellulosa colorata con colorante Ponceau in seguito a corsa elettroforetica e trasferimento del gel su membrana di nitrocellulosa. Questa immagine mi permette di osservare una migliore separazione dei marcatori di peso molecolare sicuramente corrispondente a quanto atteso per le bande con peso molecolare tra 250 e 75 kDa; osservazione confermata anche dal fatto che l’albumina, con peso molecolare di circa 66 kDa, presente una mobilità elettroforetica poco superiore alla banda dei 75 kDa. Meno chiara è la separazione delle bande del marcatore con peso molecolare compreso tra 50 e 10 kDa:sapendo che in un gel al 12% contenete SDS, la banda da 15kDa si ritrova sul fronte di corsa, posso ipotizzare che le bande visibili corrispondano a quella da 20kDa, 37 kDa e 50 kDa.

Verificato che il gel al 12% permetteva una migliore migrazione delle proteine plasmatiche, è stato eseguito un western blot utilizzando due diversi tipi di anticorpo: l’anticorpo primario di coniglio anti-TTR utilizzato in nefelometria e l’anticorpo primario di coniglio anti-TTR utilizzato in istologia. Il risultato è mostrato in figura 11B in cui è possibile osservare la presenza delle stesse bande in entrambe le membrane di nitrocellulosa, concludendo che entrambi gli anticorpi riconoscono lo stesso antigene. Di contro, ottengo un numero di bande contenenti TTR maggiori rispetto a quelle attese, ossia quelle riferite al tetramero, al dimero e al monomero con peso molecolare corrispondente a 52, 26 e 13 kDa rispettivamente.

Da sottolineare è che fino a ora l’elettroforesi è stata eseguita in condizioni native, per cui oltre alla migrazione per dimensione, bisogna tenere in considerazione anche che la migrazione delle proteine possa risentire della loro densità di carica. Sapendo che sia la transtiretina che l’albumina hanno un punto isoelettrico acido, ci possiamo aspettare che in un gel preparato con una soluzione tampone a pH 8,8 la migrazione avvenga prevalentemente per dimensione. Tuttavia, ho deciso di eseguire una tecnica indipendente, cioè una cromatografia per esclusione molecolare, per capire se effettivamente nel gel nativo queste due proteine si siano separate per dimensione.

Nella figura 12 è possibile vedere il risultato della corsa cromatografica, ovvero un cromatogramma nel quale viene mostrato il volume di eluizione (ml) in funzione dell’assorbanza a 280 nm (UA).

Figura 12. Grafico ottenuto dalla corsa cromatografica. Sull’asse delle ascisse troviamo il volume di eluizione (ml) mentre sull’asse delle ordinate troviamo l’assorbanza a 280 nm (UA).

Dal cromatogramma in figura 12 possiamo osservare la presenza di due picchi: il primo picco corrispondente a un volume di eluizione di circa 8,38 ml e un secondo picco corrispondente a un volume di eluizione di circa 9,57 ml, nei quali sono incluse le proteine plasmatiche ad alto peso molecolare. A questo punto ho deciso di selezionare le frazioni comprese tra un volume di eluizione pari a 6,024 ml (frazione 12, corrispondente a 238437 Da) e un volume di eluizione pari a 13,524 ml (frazione 27, corrispondente a 14058 Da) sulle quali eseguire un’elettroforesi seguita da western blot.

Nella figura 13 è possibile osservare il risultato dell’elettroforesi nativa e successivo western blot, eseguito con l’utilizzo dell’anticorpo anti-TTR utilizzato in nefelometria.

Figura 13. A) Immagine della membrana di nitrocellulosa, in seguito a elettroforesi nativa, colorata con colorante Ponceau. B) Acquisizione al ChemiDoc della membrana di nitrocellulosa, in seguito a western blot, con l’utilizzo dell’anticorpo primario anti-TTR.

Nei primi 16 pozzetti sono stati caricati 20 µl di frazione (dalla n°12 alla n° 27), nel pozzetto 17 sono stati caricati 20 µl di plasma (P) e nell’ultimo pozzetto sono stati caricati 5 µl di standard (M.W.).

In questo caso l’elettroforesi è stata eseguita in un gel precast al 12% sempre in condizioni native. Nella figura 13A è riportata la membrana di nitrocellulosa colorata con colorante Ponceau, dove è possibile osservare che l’albumina eluisce nelle frazioni 17-20, corrispondenti all’intervallo di peso molecolare 92-52 kDa, come atteso sulla base del peso dell’albumina corrispondente a circa 66 kDa.

Nella figura 13B vediamo la membrana di nitrocellulosa in seguito a western blot eseguito con anticorpo primario anti-TTR utilizzato in nefelometria. Confrontando le bande di TTR rivelate nel campione di plasma e la loro separazione nelle frazioni cromatografiche posso concludere che nell’elettroforesi in condizioni native le bande visibili si siano effettivamente separate in base alla dimensione. Inoltre, le bande rivelate nel campione di plasma eluiscono tutte nelle frazioni comprese tra la n°15 e la n°20 (135358 – 52683 Da). Di particolare interesse sono le due bande presenti nelle frazioni 18-20 (indicate dalle frecce), che eluiscono nell’intervallo di pesi molecolari 76800 – 52700 Da e che presentano una mobilità elettroforetica compresa tra i 75 kDa e i 50 kDa: queste due bande sono compatibili con il peso molecolare atteso del tetramero TTR (52 kDa). La presenza del tetramero sembrerebbe essere confermata anche dal risultato della quantificazione nefelometrica per TTR delle frazioni cromatografiche che ha restituito una concentrazione pari a 3,21 mg/dl di TTR nella frazione 19; per le frazioni 18 e 20 è stato ottenuto un valore di concentrazione < 1,280 mg/dl.

L’analisi cromatografica conferma che nel plasma siano presenti aggregati di TTR, particolarmente evidenti nelle frazioni 16 e 17 che però risultano non quantificabili nell’analisi nefelometrica. Sulla base di queste osservazioni posso quindi ipotizzare che in nefelometria si possa quantificare solo il tetramero TTR e non i suoi aggregati.

Un’ultima osservazione che posso fare sulla base dei risultati ottenuti con l’elettroforesi nativa e la separazione cromatografica è che il dimero e il monomero di TTR non sono rilevabili in circolo, quanto meno con l’anticorpo utilizzato.

A questo punto, ho effettuato una elettroforesi SDS-PAGE (dalla frazione n°14 alla frazione n°19), sia in condizioni non riducenti (figura 14) che riducenti (figura 15), per vedere se e in quali condizioni fosse possibile degradare gli aggregati di TTR per ottenere il dimero e/o il monomero.

Figura 14. Immagine di membrana di nitrocellulosa in seguito a SDS-PAGE e successivo western blot, colorata con metodo colorimetrico. L’anticorpo utilizzato è un anticorpo primario di coniglio utilizzato in nefelometria. Nei pozzetti esterni sono stati caricati 20 µl di controllo negativo (B), dal pozzetto 2 al pozzetto 7 sono stati caricati 20 µl di frazioni (dalla n°14 alla n°19), nel pozzetto 8 sono stati caricati 20 µl di campione intero (P) e nel pozzetto 9 sono stati caricati 5 µl di standard (M.W.).

Nella figura 14 vediamo una membrana di nitrocellulosa in seguito a SDS-PAGE e successivo western blot, colorata con metodo colorimetrico. In questo caso notiamo sempre la presenza di aggregati di TTR a elevato peso molecolare (freccia in alto), bande evidenti all’altezza di 75 kDa (freccia centrale) e infine bande all’altezza di 15 kDa (freccia in basso) che molto probabilmente contengono il monomero TTR.

A questo punto, sapendo dalla letteratura che tetrameri di TTR possono formare ponti di solfuro tra loro tramite il residuo Cys10 presente in ogni monomero, ho pensato di eseguire una seconda elettroforesi SDS-PAGE con frazioni ridotte in presenza di beta- mercaptoetanolo e incubate per 15 min a 37°C o 5 min a 95°C. Il risultato è possibile vederlo in figura 15.

Figura 15. A) Acquisizione al ChemiDoc di membrana di nitrocellulosa in seguito a SDS-PAGE con beta- mercaptoetanolo e successivo western blot di frazioni e plasma intero riscaldati a 37°C. B) Acquisizione al ChemiDoc di membrana di nitrocellulosa in seguito a SDS-PAGE con beta-mercaptoetanolo e successivo western blot di frazioni e plasma intero riscaldati a 95°C. Nei pozzetti esterni sono stati caricati 20 µl di controllo negativo (B), dal pozzetto 2 al pozzetto 7 sono stati caricati 20 µl di frazioni (dalla n°14 alla n°19), nel pozzetto 8 sono stati caricati 20 µl di campione intero (P) e nel pozzetto 9 sono stati caricati 5 µl di standard (M.W.).

Nell’immagine 15A vediamo un’acquisizione al ChemiDoc della membrana di nitrocellulosa in seguito a SDS-PAGE con beta-mercaptoetanolo e successivo western blot, di frazioni e plasma intero ridotti a 37°C, mentre nell’immagine 15B vediamo gli stessi campioni ridotti a 95°C.

L’esperimento in condizioni di riduzione ci conferma la presenza di ponti di solfuro tra gli aggregati di TTR, evidenziato dalla perdita delle bande a elevato peso molecolare. Confrontando le due condizioni di riduzione, posso anche ipotizzare di aver ottenuto solo una parziale denaturazione degli aggregati in caso di riduzione a 37°C.

Nelle condizioni più estreme della riduzione (figura 15B) sono particolarmente evidenti nelle frazioni 18 e 19 due bande, una corrispondente al monomero (15 kDa, freccia rossa) e una con mobilità elettroforetica poco superiore al marcatore dei 37 kDa (freccia nera), che potrebbe ancora rappresentare una forma di parziale riduzione di aggregati di TTR. In esperimenti successivi dovrà essere quindi verificato l’effetto di condizioni di riduzione ancora più stringenti. Curiosamente tali bande sono presenti anche nelle frazioni 16 e 17, ma con intensità molto ridotta rispetto a quanto visualizzato in figura 13, ciò pone il sospetto che questo anticorpo possa dare dei riconoscimenti aspecifici in western blot.

I dati raccolti con questi ultimi esperimenti, inoltre, evidenziano che l’anticorpo utilizzato è in grado di riconoscere anche il monomero di TTR, ciò suggerisce che, in condizioni native, le forme prevalenti di TTR circolante siano il tetramero e i suoi aggregati.