9.1 Messa a punto del metodo d’indagine basato su reporter fluorescenti
Per lo studio funzionale tramite reporter fluorescenti è stato necessario clonare le 4 varianti aplotipiche del promotore di MSLN a monte del gene copGFP, nel vettore HR220PA-1. Sono stati così ottenuti i vettori HR_HAP1/2/3/4. Trattandosi di un metodo in fase di messa a punto, i reporter fluorescenti sono stati utilizzati esclusivamente per l’analisi funzionale dei quattro aplotipi su cellule della linea Met5A.
9.1.1 Clonaggio del promotore di MSLN all’interno del vettore HR220PA-1
L’esito del clonaggio è stato verificato tramite colony-PCR e conseguente elettroforesi su gel di agarosio. In presenza del corretto inserto, la PCR dovrebbe produrre un amplicone della lunghezza di 1306 bp (1073 bp d’inserto + 233 bp di distanza fra primer e sito di clonaggio). I risultati delle
colony-PCR relative ai clonaggi delle quattro varianti del promotore di MSLN, sono mostrati in
[Figura 30].
L’inserto è stato sequenziato per tutta la sua lunghezza in ognuno dei costrutti ottenuti, allo scopo di confermare ulteriormente l’esito del clonaggio ed escludere la presenza di eventuali mutazioni che potrebbero essere inserite durante la PCR.
Figura 30: esito dei clonaggi dei quattro aplotipi all'interno del vettore HR220PA-1. Le bande ad un'altezza di 1306 bp
71 I risultati dei sequenziamenti, limitatamente alla regione degli SNPs in esame, sono mostrati in [Figura 31]. Tutti i costrutti sequenziati mostrano la corretta sequenza, sia a livello dei siti polimorfici che lungo tutto il promotore inserito.
9.1.2 Valutazione dell’efficienza di trasfezione
Nella fase di messa a punto, sono stati valutati due diversi metodi per la trasfezione del vettore HR_HAP_1 all’interno delle cellule Met5A: utilizzo di agenti trasfettanti (Lipofectamina 3000) ed elettroporazione. L’efficienza di trasfezione è stata valutata tramite citometria a flusso utilizzando come controllo negativo un campione di cellule non trasfettate. I risultati, riportati in [Figura 32], evidenziano un’efficienza di trasfezione molto bassa per il campione trattato con Lipofectamina
Figura 31: risultato del sequenziamento dei vettori HR utilizzati. L'immagine mostra la sequenza a livello dei siti
72 3000, dove appena il 3,96% di cellule esprime una fluorescenza rossa (filtro mCherry, 610/20 nm) superiore a quella del controllo negativo e quindi attribuibile alla presenza del vettore.
Al contrario, le cellule trattate con elettroporazione mostrano livelli di trasfezione soddisfacenti, con il risultato migliore (63,2% di cellule trasfettate) ottenuto tramite l’utilizzo della “soluzione L” in combinazione con il programma di elettroporazione T-020. Alla luce di questi risultati abbiamo dunque optato per l’elettroporazione come metodo di trasfezione per le cellule Met5A con i vettori HR.
9.1.3 Analisi dei livelli di fluorescenza tramite citofluorimetria a flusso
La valutazione dell’effetto dei quattro aplotipi sull’espressione di MSLN tramite reporter fluorescenti è stata effettuata come riportato nel paragrafo 5.3.2. L’analisi della varianza ha mostrato una differenza significativa tra i diversi costrutti (p-complessivo per ANOVA <0,0001). Utilizzando i livelli di RFU della variante più comune (HAP_1) come valore di riferimento (100%,
Figura 32: efficienza di trasfezione valutata tramite citofluorimetria a flusso. (A) La trasfezione tramite
Lipofectamina 3000 mostra un'efficienza del 3,96% (percentuale di cellule con un livello di fluorescenza
rossa superiore a quello del controllo negativo). (B) Esito della trasfezione tramite elettroporazione con utilizzo di “soluzione L” e programma T-020: l’efficienza di trasfezione risulta in questo caso del 63,2%).
73 SEM ± 2,3%), sono stati osservati livelli significativamente maggiori per i costrutti HR_HAP_2 e HR_HAP_3, rispettivamente 116% (SEM ± 2,6%) e 112,6% (SEM ± 2,4%). Non è invece risultata alcuna differenza significativa fra HR_HAP_1 e HR_HAP_4, 98% (SEM ± 2,2%) [Figura 33].
9.2 Studio funzionale tramite reporter bioluminescenti
Lo studio funzionale tramite reporter bioluminescenti è stato condotto a partire da vettori pre- esistenti contenenti le varianti del promotore di MSLN a monte di un gene codificante per la luciferasi di lucciola. In questo caso, l’analisi funzionale è stata effettuata sia su cellule di mesotelio sano (Met5A) che su cellule di mesotelioma pleurico (Mero14).
9.2.1 Risultato del saggio della luciferasi per lo studio delle quattro varianti del promotore
Il saggio della luciferasi è stato utilizzato per valutare l’effetto degli SNP selezionati sull’espressione di MSLN. Anche in questo caso l’analisi della varianza ha evidenziato una differenza significativa fra i costrutti in esame in entrambe le linee cellulari (p-complessivo ANOVA=0,0012 per Mero14, 0,0168 per Met5A). Comparando i livelli di RLU dell’aplotipo più comune, HAP_1 (100%) con quelli derivanti dagli altri aplotipi, è stato possibile osservare un incremento significativo per HAP_2 e HAP_4 in entrambe le linee cellulari, rispettivamente 187% (SEM ± 11,2%) e 182% (SEM ± 11,5%) nelle Mero14 [Figura 34] e 148% (SEM ± 9,6%) e 160%
Figura 33: risultati dello studio funzionale mediante reporter fluorescenti. (A) Esito del multiple range test effettuato
sul dato normalizzato, che mostra livelli di espressione significativamente più alti in presenza di HAP_2 e 3 rispetto alla alla variante comune HAP_1. Non emerge invece alcuna differenza fra HAP_4 e HAP_1. (B) Rappresentazione grafica del confronto fra i livelli di RFU nei quattro aplotipi: i livelli di HAP_1 sono stati utilizzati come riferimento ed impostati a100%. Gli istogrammi rappresentano i livelli RFU medi e le barre l’errore standard.
74 (SEM ± 9%) nelle Met5A [Figura 35]. Non è stata osservata alcuna differenza significativa per quanto riguarda HAP_3.
Figura 34:risultati dello studio funzionale mediante reporter bioluminescenti su cellule della linea Mero14. (A) Esito del multiple range test effettuato sul dato normalizzato. I livelli di espressione in presenza di HAP_2 e 4 risultano significativamente più elevati rispetto a quelli dell’aplotipo comune di riferimento (HAP_1). Non emerge invece alcuna differenza fra HAP_3 e HAP_1. (B) Rappresentazione grafica del confronto fra i livelli di RLU nei quattro aplotipi: i livelli di HAP_1 sono stati utilizzati come riferimento ed impostati a100%. Gli istogrammi rappresentano i livelli RLU medi e le barre l’errore standard.
Figura 35:risultati dello studio funzionale mediante reporter bioluminescenti su cellule della linea Met5A. (A) Esito del multiple range test effettuato sul dato normalizzato. I livelli di espressione in presenza di HAP_2 e 4 risultano significativamente più elevati rispetto ad HAP_1. Non è presente alcuna differenza significativa fra HAP_3 e HAP_1.
(B) Rappresentazione grafica del confronto fra i livelli di RLU nei quattro aplotipi: i livelli di HAP_1 sono stati
utilizzati come riferimento ed impostati a100%. Gli istogrammi rappresentano i livelli RLU medi e le barre l’errore standard.
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