Studio del livello dell’mRNA della GRK1 e delle RGS1 nelle retine WT ed sst1KO dopo 1h di trattamento in condizioni d’ischemia, in presenza od in

assenza dell’octreotide

Oltre che dal processo d’internalizzazione, i segnali intracellulari regolati dai recettori GPCRs possono essere inibiti dal processo di desensitizzazione (Liu et al., 2007; Lombardi et al., 2004; Métayé et al., 2005). A tal proposito, è noto che il recettore sst2 può essere soggetto al processo di desensitizzazione (Gunn et al., 2006; Liu et al., 2007). Diverse ricerche hanno dimostrato che il processo di desensitizazione viene regolato da due famiglie di proteine ad attività chinasica: le GRKs e le RGSs (Larminie et al., 2004; Métayé et al., 2005; Ribas et al., 2007). In aggiunta, è stato dimostrato che nella retina dei vertebrati, tra cui uomo e topo, possono essere espresse le GRKs (de Almeida & Ventura, 2004; Krispel et al., 2006; Liu et al., 2005; Premont et al., 1994; Weiss et al., 2001; Zhao et al., 1998) e le RGSs (Cabrera et al., 1998; Chen et al., 2003; Hu et al., 2001; Kereszetes et al., 2004; Krispel et al., 2006; Levay et al., 1999; Morgans et al., 2007; Rahman et al., 1999; Zhang et al., 1999). Diverse ricerche suggeriscono che l’espressione delle GRKs e delle RGSs può variare, influenzando di conseguenza la risposta dei recettori accoppiati alle proteine G e quindi le risposte cellulari (Chen et al., 2006; Gros et al., 1997; Lombardi et al., 2004; Métayé et al., 2005; Rockman et al., 1998; Shelat et al., 2006; Ungerer et al., 1997; Xu et al., 2007). Abbiamo voluto verificare l’eventuale implicazione del fenomeno della desensitizzazione nei meccanismi alla bese dell’incremento del danno neuronale e del rilascio di glutammato osservato nelle retine ischemiche sst1KO quando sono trattate con l’octreotide. Tramite RT-PCR e Real-Time RT-PCR abbiamo studiato l’espressione della GRK1 e della RGS1 nelle retine WT ed sst1KO trattate per 1h in condizioni di controllo od in condizioni d’ischemia, in presenza o meno di octreotide. Come mostrato in Fig. 20A, tramite RT-PCR nelle retine WT trattate per 1h in condizioni di controllo abbiamo ottenuto prodotti amplificati corrispondenti all’mRNA della GRK1 e della RGS1 attesi. Ugualmente, l’espressione dell’mRNA della GRK1 e della RGS1 è stata osservata anche nelle retine sst1KO trattate in condizioni di controllo (dato non mostrato). Tramite Real-Time RT-PCR condotta utilizzando SYBER Green, abbiamo voluto quantificare l’espressione relativa dell’mRNA della GRK1 e della RGS1 nel nostro sistema. Per tali motivi, i primers utilizzati sono stati inizialmente testati per generare una curva standard su un ampio intervallo di quantità di cDNA e per calcolare l’efficienza della Real-Time RT-PCR (Tab. 1), parametri, questi, notoriamente critici per una successiva e corretta quantificazione del livello dell’mRNA. In aggiunta, il livello dell’mRNA della GRK1 e della RGS1 sono stati normalizzati al gene utilizzato come standard interno stabile (Vandesompele et al., 2002). Come standard interno stabile nei nostri esperimenti abbiamo considerato l’mRNA dell’RPL13a, dopo aver verificato che la sua espressione non è

cambiata nelle differenti condizioni sperimentali. L’mRNA dell’RPL13a è stato indicato, infatti, come potenziale controllo interno stabile durante l’ischemia (Tian et al., 2007). Come mostrato in Fig. 20B, rispetto alla condizione di controllo (colonne nere), il trattamento delle retine WT per 1h in condizioni d’ischemia (colonne grige) ha indotto un marcato incremento del livello dell’mRNA della GRK1 e della RGS1 (circa 17 e 32 volte il livello osservato in condizioni di controllo, rispettivamente). L’incremento dell’espressione della GRK1 e della RGS1 nelle retine ischemiche sst1KO è stato molto simile a quello osservato nelle retine WT (dato non mostrato). Come mostrato in Fig. 20C, D, rispetto alla condizione d’ischemia in assenza dell’octreotide (colonne nere), il trattamento con octreotide (colonne grige) ha indotto una significativa riduzione del livello dell’mRNA della GRK1 (circa 47%) e della RGS1 (circa 70%) nelle retine WT. Diversamente, nelle retine ischemiche sst1KO, il trattamento con octreotide ha indotto una significativa riduzione del livello dell’mRNA della GRK1 (circa 74%) ma non ha influenzato il livello dell’mRNA della RGS1.

Fig. 20

Analisi mediante RT-PCR e Real-Time RT-PCR dell’mRNA della GRK1 e della RGS1 nelle retine WT ed sst1KO trattate per 1h in condizioni di controllo ed in condizioni d’ischemia, in presenza od in

assenza dell’octreotide

(A) Immagine rappresentativa del gel ottenuto nella RT-PCR condotta nelle retine WT trattate per 1h in condizioni di controllo. Vengono mostrati gli amplicifati corrispondenti all’mRNA l’mRNA del gene di controllo RPL13a (banda di 182 bp), della GRK1 (banda di 153 bp) e della RGS1 (banda di 153 bp). Prodotti simili sono stati ottenuti nelle retine sst1KO. (B) In condizioni di controllo (colonne nere), nelle retine WT il livello dell’mRNA della GRK1 e della RGS1 che si misura tramite Real-Time RT-PCR semiquantitativa è simile. Una situazione simile è stata osservata nelle retine di controllo sst1KO. L’ischemia (colonne grigie) in assenza dell’octreotide induce un significativo incremento del livello dell’mRNA della GRK1 e della RGS1 nelle retine WT. Risultati del tutto simili simili sono stati ottenuti nelle retine sst1KO. Come calibratore per la misura della quantità relativa dell’RNA messaggero è stato considerato il livello della GRK1 nelle retine WT di controllo. *p<0.01 e **p<0,001 vs il rispettivo valore misurato in condizioni di controllo; ANOVA seguito dal test di comparazione multipla Newman-Keuls). (C) Rispetto al livello misurato in condizioni d’ischemia in assenza dell’octreotide (colonne nere), in presenza dell’octreotide (colonne grigie) si osserva una significativa riduzione del livello dell’mRNA della GRK1 nelle retine WT ed sst1KO. (D) In presenza dell’octreotide si osserva una riduzione significativa del livello dell’mRNA della RGS1 nelle retine ischemiche WT, mentre non si osservano effetti significativi nelle retine ischemiche sst1KO. Come calibratore per la misura della quantità relativa dell’RNA messaggero è stato considerato il livello della GRK1 (C) o della RGS1 (D) nelle retine ischemiche WT in assenza di octreotide.*p<0.01 e **p<0,001 vs i valori misurati nelle rispettive retine ischemiche in assenza di octreotide; ANOVA seguito dal test di comparazione multipla Newman-Keuls. Ciascuna colonna negli istogrammi rappresenta la media±S.E.M dei dati ottenuti da otto

campioni. Per ogni campione in ciascuna condizione sperimentale sono stati utlizzati gli mRNA estratti dai sei retine.

6. DISCUSSIONE DELL’EFFETTO NEUROPROTETTIVO