Studio precedente di 31P-MRS in soggetti DMB

In uno studio precedente di Risonanza Magnetica con Spettroscopia al Fosforo 31 condotto sempre presso l’IRCCS Stella Maris di Calambrone (Linsalata et al., 2006) ponendo a confronto quanto ottenuto da 9 pazienti con Distrofia Muscolare di Becker di età media di 28,2 anni (range 12-43) e 20 volontari maschi e femmine di età media pari a 30,8 anni (range 22-35), con la stessa metodologia da noi utilizzata e successivamente descritta, si è osservato nei dati a riposo un pH basale meno acido nei secondi mentre non si sono apprezzate differenze significative nelle quantità intrafibrali di Pi e PCr. I dati in esercizio ponevano in evidenza come la maggior parte dei soggetti Becker riusciva a raggiungere deplezioni della PCr a valori vicini al 50% (al contrario dei controlli) e come questi pazienti manifestassero una rapida esauribilità muscolare, tanto da far registrare tempi di durata dell’esercizio inferiori rispetto ai soggetti sani.

I pazienti affetti da DMB, in seguito ad esercizio muscolare, raggiungevano valori di pH minimo e differenze tra pH a riposo e pH minimo (ΔpH) paragonabili a quelle dei controlli sani per percentuali di idrolisi di PCr chiaramente inferiori. Per verificare la risposta metabolica a diversi gradi di inversione della PCr èstato anche sottoposto uno stesso soggetto sano a tre diversi carichi di lavoro all’ergometro allo scopo di valutare diverse condizioni metaboliche alla fine dell’esercizio. Il soggetto posto a tre diversi carichi di lavoro raggiungeva livelli di idrolisi della PCr pari, rispettivamente, del 38, 48, e 57%, a cui corrispondevano valori di pH minimo e di tau significativamente diversi tra loro. I soggetti normali di controllo comprendevano sia maschi che femmine, poiché in letteratura è dimostrato come il sesso non influenzi i valori di pH, PCr e Pi all’interno della fibra muscolare (Mattei et al, 2002). I risultati ottenuti a riposo confermavano la presenza di un incremento dei valori basali di pH nei Becker rispetto ai controlli sani, già segnalato in letteratura, mentre divergevano da questa per quanto concerneva la quantità di PCr e Pi presenti nella fibra: a tale proposito non si sono evidenziate differenze statisticamente significative tra i due gruppi (Barbiroli et al, 1992; Kemp et al, 1993, Lodi et al, 1999).

Il protocollo di esercizio all’ergometro poneva in evidenza, innanzitutto, una rapida esauribilità dei Becker rispetto ai controlli. Tentativi di personalizzare il protocollo incrementale, calcolando le entità degli incrementi in funzione della forza massima sprigionabile dai soggetti, non hanno eliminato il problema: l’esauribilità non sembrava, quindi, attribuibile esclusivamente all’ipostenia caratteristica della distrofia di Becker. Inoltre, i livelli di deplezione di PCr e i tempi di esercizio osservati nei Becker e nei controlli non differivano sostanzialmente con il protocollo personalizzato poi adottato per lo studio. I dati ricavati dall’esercizio evidenziavano come la maggior parte dei pazienti Becker non riescisse a raggiungere percentuali di idrolisi di PCr del 50% tuttavia i soggetti

Becker raggiungevano livelli di pH minimo simili a quelli dei controlli a dispetto di percentuali di idrolisi di PCr minori: il ΔpH, ovvero la capacità di acidificazione del mezzo interno dei Becker, era paragonabile a quella dei controlli, seppure con percentuali di idrolisi di PCr minori.

Questo contrastava con i dati presenti in letteratura, in particolare con la teoria di Lodi concernente un diminuito potere acidificante della fibra distrofinopatica dovuto al ridotto utilizzo del glucosio ematico, a sua volta determinato dal mancato ruolo di facilitazione della captazione dl glucosio esercitata dalla distrofina nel muscolo sano (Lodi et al, 1999).

Inoltre, un ΔpH simile era ottenuto a percentuali di idrolisi della PCr minori e in tempi più rapidi: il paziente Becker esperisce la stanchezza prima del normale a dispetto di una sintesi di lattato probabilmente minore (esercizio significativamente più breve a parità di uguale tempistica di reclutamento delle vie metaboliche anaerobie). Questo dato sembrava porre in relazione la stanchezza soggettiva con lo stato di acidificazione, spostando, a tale proposito, l’attenzione dall’acido lattico (considerato classicamente il mediatore principe della stanchezza soggettiva) verso altri metaboliti acidi prodotti dall’alterazione dello stato di riposo.

I dati relativi alla cinetica di recupero, infine, ottenuti mostravano come il tau fosse dipendente dal pH raggiunto dal soggetto nel corso dell’esercizio, come ben evidenziato dal lavoro ottenuto sottoponendo lo stesso volontario sano a tre diversi carichi di lavoro che hanno comportato il raggiungimento di pH più acidi proporzionalmente al maggior grado di idrolisi della PCr. I risulati ottenuti hanno motivato l’approfondimento dello studio con ulteriori ricerche relative al metabolismo di altre patologie neuromuscolari e all’estensione del campione in età evolutiva per il frequente esordio in questa epoca di vita di tali patologie.

5.3. Pazienti

Sono stati inclusi nello studio 3 pazienti con diagnosi di LGMD2B con deficit di disferlina (2 M e 1 F) con età media di 23,3 anni (range 16-34 anni) e 10 pazienti con diagnosi clinica di LGMD2A con deficit di calpaina-3 alla biopsia muscolare (6 M e 4 F), con età media di 31,4 anni (range 16- 44 anni).

Tra i pazienti LGMD2B due erano fratelli seguiti presso l’IRCCS Stella Maris di Calambrone. L’età media di esordio di malattia dei soggetti affetti da LGMD2B era intorno ai 15 anni. Tra i pazienti LGMD2A inclusi in questo lavoro, sette erano seguiti presso l’ambulatorio per le malattie neuromuscolari della Clinica Neurologica di Pisa, due pazienti provenivano dall’ambulatorio per le

presso l’ambulatorio per le malattie muscolari del Dipartimento di Neuroscienze dell’Università di Padova. L’età media all’esordio della malattia era 18,4 ± 8,8 anni; non erano presenti altre patologie associate e nessuno assumeva terapie specifiche.

Tutti i soggetti erano stati precedentemente sottoposti per la diagnosi a biopsia muscolare dal muscolo deltoide o quadricipite femorale, con ricorso alle metodiche istologiche e immunoistochimiche standard ed analisi in western blot (WB) della quantità di disferlina o calpaina-3 espresse.

L’esame istopatologico standard dei soggetti LGMD2A evidenziava la presenza, sebbene in entità variabile nei diversi soggetti, di un processo miopatico di tipo distrofico, con atrofia muscolare, centralizzazione nucleare, degenerazione miofibrale e, in 2/3 dei casi, fibre lobulate. La quantificazione mediante WB della calpaina-3 mostrava assenza completa della proteina in 6 casi e deficit parziale (dal 5 al 20% dei valori normali) nei restanti 4 soggetti.

In un paziente la diagnosi genetico-molecolare ha evidenziato una delezione omozigote sull’esone 1 nel gene CAPN3 (140_142delACT esone 1), mentre in un altro soggetto è stata riscontrata una mutazione missense in doppia eterozigosi sull’esone 1 e sull’esone 19. Negli altri casi la diagnosi genetica è in corso.

Prima dello studio, tutti i soggetti sono stati sottoposti a valutazione cardiologica e pneumologica, risultate nella norma.

I pazienti sono stati quindi avviati ad un protocollo di studio di MRS muscolare a completamento diagnostico.

Tutti i partecipanti allo studio hanno firmato un modulo di consenso informato e lo studio è stato condotto secondo le regole della Good Clinical Practice.

Sono stati acquisiti per i gruppi controllo i dati relativi ad un campione in età evolutiva e un campione in età adulta. I dati dei due campioni controllo sono stati inizialmente confrontati tra loro e successivamente, rispettivamente, con i dati dei due campioni dei soggetti affetti da LGMD. I soggetti in età evolutiva considerati erano 11 (6 M e 5 F) con età media di 12,9 anni (range 10,0- 18,3); gli adulti erano 8 (4 M e 4 F) con età media di 29 anni (range 25,0-37,0) . I soggetti in età evolutiva hanno partecipato allo studio dopo approvazione da parte del Comitato Etico e previo consenso dei genitori in seguito alle illustrate informazioni sulle modalità di esecuzione dello studio. Il campione di bambini è stato suddiviso in tre fasce di età: 8-10 anni, 11-13 anni, 14-18 anni. Tale suddivisione è apparsa necessaria per poter valutare l’andamento del metabolismo del muscolo dall’età prepuberale a quella puberale in particolare nel confronto con i soggetti adulti sani.

Utile è stato anche il riferimento ai risultati di risonanza magnetica con spettroscopia al fosforo 31 ottenuto in uno studio effettuato precedentemente presso l’IRCCS Stella Maris relativo ai muscoli gastrocnemi di nove pazienti affetti da Distrofia Muscolare di Becker comparato con quello di venti soggetti adulti sani.