2.4.1 Conte cellulari
Questo tipo di tecnica consiste nel conteggio manuale del numero di cellule vive per ogni campione, ed è stata utilizzata per effettuare uno screening iniziale sulla tossicità delle sostanze in esame.
Le cellule (OC-k3 e PC12 indifferenziate) sono state seminate su piastre da 24 pozzetti alla concentrazione di 100.000 cellule/ml; venivano lasciate aderire al fondo e dopo 24h si trattavano secondo le modalità descritte precedentemente per ogni linea cellulare.
Allo scadere dei tempi di trattamento (al massimo 72h), da ogni pozzetto venivano staccate le cellule e si prelevano due aliquote da 10µl sulle quali è stato eseguito il conteggio del numero di cellule vive nel campione utilizzando la camera di Burker al microscopio a contrasto di fase (Nikon Eclipse TS100) con ingrandimento 10X.
Da ogni campione sono state eseguite 8 letture (una per ogni quadrante di cui è composta la camera). Dai dati raccolti è stata ricavata la media. Il valore medio è stato moltiplicato per il fattore di diluizione di 104
per ottenere il numero medio di cellule vive per ml di campione. Questo dato è stato graficato e sottoposto ad analisi statistica.
2.4.2 Saggio colorimetrico
Questo tipo di esame permette di valutare la vitalità cellulare aggiungendo direttamente al terreno di coltura un sale ((3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5- (3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium, inner salt= MTS) che viene convertito dalle cellule vitali in un composto colorato e solubile nel terreno di coltura, il formazano. La quantità di formazano prodotta è direttamente proporzionale al numero di cellule vive. Questa
metodica è veloce e ci ha permesso di eliminare problemi relativi al distacco delle cellule dal pozzetto, al rischio di perdere del campione e, inoltre, essendo la lettura effettuata da uno strumento veniva ridotto l’errore.
Questo test è stato svolto sia sulle PC12 indifferenziate per verificare i dati dei conteggi, sia sulle PC12 differenziate per le quali le altre metodiche per lo studio della vitalità sono risultate non adeguate.
Le cellule dopo essere state seminate in piastre da 96 pozzetti alla concentrazione di 1000-5000 cellule/100μl/pozzetto, sono state lasciate aderire per 24h dopo di che si è proceduto al trattamento come specificato precedentemente. Nel caso delle PC12 differenziate le cellule sono state trattate dopo i 6 giorni di differenziamento. Scaduto il tempo di trattamento ad ogni pozzetto sono stati aggiunti 20µl di una miscela composta da MTS (CellTiter 96® AQueous MTS Reagent Powder, Promega) e PMS (Sigma) in rapporto 20:1. Dopo 4h di incubazione a 37°C, è stata effettuata una lettura a 492nm con il lettore di piastre (SIRIO, SEAC S. R. L., Firenze).
Il valore di assorbanza ottenuto per ogni campione, espresso come densità ottica (OD= optical density), è stato analizzato e sottoposto a indagine statistica.
2.4.3 Citofluorimetro
Il citofluorimetro a flusso è uno strumento che ci ha permesso di svolgere indagini sulla vitalità e sulla mortalità cellulare esaminado un numero di eventi di molto superiore (dai 10.000 eventi in su) rispetto alle tecniche fin qui descritte. Quindi ci ha fornito dei dati più attendibili e precisi.
Questa tecnica è ideale per l’analisi di cellule che vivono in sospensione, ma con qualche accorgimento si riescono ad ottenere buoni risultati anche con quelle in adesione, molto importante è che una volta distaccate, per favorire la separazione delle singole cellule occorre
mescolare bene la sospensione cellulare durante i vari passaggi dell’analisi. Con le OC-k3 non sono stati riscontrati problemi nell’utilizzo di questa metodica, mentre con le PC12 indifferenziate e differenziate in neuroni sono sorte grosse difficoltà. Le prime tendevano a rimanere troppo aggregate anche una volta distaccate dalla fiasca, per le seconde il distacco causava dei traumi che falsavano la lettura. Pertanto questa tecnica è stata utilizzata solo sulle OC-k3.
I campioni sono stati preparati seminando le cellule in piastre da 6 pozzetti alla concentrazione di 150.000 cellule/pozzetto. Dopo 24h sono state trattate come descritto per le singole linee cellulari. Per ogni esperimento sono stati anche preparati dei pozzetti contenenti cellule non trattate che sono state utilizzate per settare lo strumento come verrà spiegato di seguito.
Al termine del trattamento (24h e/o 48h) le cellule sono state staccate con Tripsina EDTA (30 secondi a 37°C) e in seguito, la sua azione disgregante veniva bloccata riutilizzando il terreno prelevato precedentemente dai corrispettivi pozzetti, in modo da non eliminare le eventuali cellule che erano finite in sospensione a causa del trattamento. Le cellule staccate sono state raccolte e posizionate negli appositi tubi per l’analisi citofluorimetrica e mantenuti in ghiaccio.
Ai campioni è stato aggiunto ioduro di propidio (PI, SIGMA) alla concentrazione finale di 2µg/ml, per circa 10 minuti al buio, poi è stata eseguita l’analisi al citofluorimetro (FACS-Calibur, Becton Dickinson) valutando come parametri la SSC/FSC (side scatter/ forward scatter) e la fluorescenza emessa dalle cellule marcate con il PI (FL2-H). Lo ioduro di propidio è un intercalante del DNA, normalmente le cellule vive, che hanno quindi le pompe di membrana intatte, sono in grado di espellerlo; quando la cellula viene danneggiata o muore non riuscendo più a eliminare il PI lo incorpora nel nucleo, grazie a questo fenomeno è possibile distinguere le cellule vie da quelle morte.
Lo strumento è stato settato utilizzando un campione non trattato tale e quale come controllo negativo, chiamato BIANCO, ed un secondo al quale è stato aggiundo aggiunto lo 0,1% di NP40 (SIGMA) e 2µg/ml di PI, quest’ultimo campione costituisva un controllo positivo per la fluorescenza, in quanto NP40 è un detergente che uccide tutte le cellule e il PI colora solo i nuclei delle cellule morte.
Per ogni campione sono state calcolate, la percentuale di cellule vive e quella di cellule morte con il programma Cell Quest Pro (Becton Dickinson), questi dati sono stati sottoposti ad analisi statistica e la mortalità è stata graficata.