Studio in Vitro per determinare gli effetti del laser sulle cellule del

tessuto reticolare trabecolare (effetti termici del trattamento laser) 32

In una serie di esperimenti condotti su cellule del tessuto reticolare trabecolare pigmentate e non, irradiate con diversi tipi di laser, sono stati valutati i seguenti parametri: la soglia di risposta al trattamento laser, la capacità del laser di bersagliare selettivamente le cellule pigmentate, e gli effetti indotti dal trattamento evidenziabili alla microscopia elettronica a trasmissione.

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I sistemi laser utilizzati sono stati: (1) un laser a onda continua argon; (2a) un laser a lampada flash pulsante con impulsi della durata di 8 microsecondi; (2b) un laser a lampada flash pulsante con durata degli impulsi di 1 microsecondo;(3a) un laser Q-switched Nd:YAG a frequenza raddoppiata che emette a 532nm con durata degli impulsi di 10 nanosecondi e (3b) un laser Q- switched modalità normale Nd:YAG che emette a 1064 nm e con una durata di impulsi di 10 nanosecondi. Le cellule pigmentate di tessuto reticolare trabecolare necessarie sono state generate stimolando colture confluenti di tessuto reticolare trabecolare con melanina.

La determinazione della soglia di risposta è stata ottenuta sottoponendo le colture di cellule a diverse esposizioni di radiazioni. Cellule di controllo sono state preparate stimolando cellule di tessuto reticolare trabecolare contenenti microsfere di lattice, in modo da determinare l’effetto dell’irradiazione del laser sulle cellule con all’interno un materiale diverso dal cromoforo. E’ stata definita la soglia di esposizione quando si è osservato il 50% di citotossicità della cellula. La citotossicità della cellula e la sua selettività sono state determinate grazie ad un saggio fluorescente di vitalità/citotossicità realizzato in un arco di tempo di 30 minuti di irradiazione laser. A seguito della definizione della soglia di esposizione radiante, i due tipi di colture cellulari sono state irradiate con una esposizione che andava da un po’ al di sotto a un

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po’ al di sopra della soglia stessa, in modo da definire l’intervallo all’interno del quale si poteva ottenere un bersagliamento selettivo. Le cellule sono state anche preparate per la microscopia elettronica a trasmissione (TEM) al fine di determinare le proporzioni del danno cellulare e intracellulare, e per valutare le conseguenze subite dalle adiacenti cellule non pigmentate. Dopo aver irradiato le colture cellulari con ognuno dei sistemi laser presi in considerazione, è stato osservato che, al di sotto di una scorrevolezza di 10-106 mj/cm2, non è stata evidenziata alcuna lesione né nelle cellule del tessuto reticolare trabecolare, né nelle cellule di controllo con microsfere in lattice. Il bersagliamento selettivo delle cellule pigmentate del tessuto reticolare trabecolare al punto di soglia di esposizione radiante è stato ottenuto sia con il laser pulsante a lampada flash a 588 nm con 1 microsecondo di durata dell’impulso, sia con il laser a doppia frequenza Q-switched Nd:YAG a 532 nm con durata dell’impulso di 10 nanosecondi. Con questi due laser, un’irradiazione con livelli di scorrevolezza 20 volte superiori alla soglia della dose di esposizione ha portato ad una completa citotossicità (cioè 100%) delle cellule pigmentate del tessuto reticolare trabecolare. Non è stato possibile ottenere un bersagliamento selettivo di sole cellule pigmentate del tessuto reticolare trabecolare né usando il laser a onda argon-ione emettente 514 nm, né attraverso il laser a lampada a flash pulsante con emissione a 590 nm con impulsi di 8 microsecondi. Con

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questi laser infatti all’interno della zona di irradiazione entrambe le cellule del tessuto reticolare trabecolare, pigmentate e non, sono state danneggiate; inoltre a livelli di trattamento superiori alla soglia, molte cellule nella zona irradiata sono state vaporizzate. Il risultato importante tuttavia è che è stato possibile ottenere un bersagliamento selettivo delle cellule pigmentate attraverso l’utilizzo di impulsi della durata di 1 microsecondo o meno. Le cellule non pigmentate adiacenti infatti non hanno mostrato alcuna evidenza di danni, e la lesione a quelle pigmentate era talmente lieve che con difficoltà tali cellule si potevano distinguere morfologicamente rispetto alle altre. Questo ci suggerisce non solo che le cellule pigmentate possono essere circoscritte selettivamente, ma che tale bersagliamento si può ottenere senza una seria disgregazione dell’architettura cellulare.

La microscopia elettronica a trasmissione è stata usata per stabilire l’entità del danno cellulare e/o intracellulare prodotto su entrambi i tipi di cellule. Dopo aver irradiato le suddette culture con impulsi a 10 nanosecondi generati tramite il laser Q-switched Nd:YAG a frequenza raddoppiata, è stato possibile verificare che la lesione si limitava alle sole cellule pigmentate, mentre non è stato rilevato alcun danno ultrastrutturale alle adiacenti cellule non pigmentate. Queste scoperte hanno stabilito la capacità dei singoli impulsi laser di breve durata e basso livello di scorrevolezza di mirare in maniera selettiva alle cellule

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pigmentate del tessuto reticolare trabecolare, nelle quali la melanina serve da cromoforo o bersaglio per assorbire l’energia laser. In questo studio inoltre sono stati utilizzati ampi diametri di zone o spot (da 200 um a 2mm); questo in contrasto con il diametro piu’ piccolo (50 um) usato clinicamente nelle procedure con ALT. Poiché gli effetti sul tessuto sono localizzati a livello subcellulare senza lo sviluppo di un collaterale danneggiamento termico coagulativo, la zona di irradiazione può dunque avere dimensioni maggiori rispetto all’ALT. In più, i dati ottenuti da questo studio suggeriscono che i parametri laser appropriati stabiliti nel sistema di coltura della cellule del tessuto reticolare trabecolare sono equivalenti a quelli usati clinicamente nell’ALT. L’irradiazione di cellule pigmentate, non pigmentate e di controllo con un laser argon che emette a 514 nm, ha avuto quindi come risultato danni cellulari compatibili con le capacità di trattamento usate clinicamente durante una ALT.

3.2 Studi in vitro per la valutazione dei responsi di citocinesi all’ALT e SLT