umano in un modello 3D per studiare la terapia con
l’immunotossina SS1P
Il mesotelio è un monostrato cellulare di tipo epiteliale che avvolge le grandi cavità sierose. Le cellule mesoteliali sono di derivazione mesodermica ed hanno una morfologia piatta e molto espansa. I mesoteli prendono il nome dalla grande cavità che avvolgono e sono: il peritoneo, il pericardio e le pleure.
Il mesotelioma è un tumore che origina dal mesotelio, dovuto prevalentemente alla lunga esposizione all’amianto (90). Il mesotelioma maligno è spesso resistente alla chemioterapia (91) e alla radioterapia (92). La prognosi è infausta e la sopravvivenza media varia da pochi mesi a meno di 2 anni (93).
Studiando la resistenza all’apoptosi del mesotelioma, Broaddus et al. hanno riportato, in uno articolo del 2008, che le cellule di mesotelioma acquisiscono tale resistenza una volta formati gli sferoidi 3D in vitro (94). È quindi evidente come gli sferoidi in vitro riescano a riprodurre molte caratteristiche del microambiente tumorale. La terapia a base di anticorpi è emersa come una nuova strategia promettente per il trattamento del mesotelioma e altri tumori solidi (95; 84). Tuttavia, i microambienti tumorali che presentano significative barriere alla penetrazione di anticorpi e di immunoconiugati sono stati studiati solo in vivo. Un modello di tumore in vitro semplice, affidabile e ad alta produttività potrebbe essere molto utile per la caratterizzazione e lo screening di anticorpi e immunoconiugati nella terapia antitumorale.
34 Attualmente in fase di sperimentazione clinica nel mesotelioma, la SS1P è un’immunotossina costituita dalla fusione del frammento Fv (la porzione variabile che lega l’antigene) di un anticorpo anti-mesotelina con la esotossina A dello pseudomonas. Xiang et al. (43) hanno esaminato come il microambiente tumorale influenzi la penetrazione e l’attività tumoricida della SS1P in un nuovo modello di sferoide coltivato in vitro utilizzando una linea cellulare del mesotelioma umano (NCI-H226) e due linee di cellule primarie isolate dalle asciti dei pazienti affetti da mesotelioma maligno (Figura 7).
Figura 7. Costituzione di sferoidi di mesotelioma umani.
Monostrati e sferoidi della linea cellulare di mesotelioma umano NCI-H226 e delle linee di mesotelioma primario NCI-M-03 e M-NSC-13. Barre di scala 400 µ m (eccetto 200 µm per gli sferoidi NSC-M-13).
35 Anche se le cellule di mesotelioma cresciute come monostrato e come sferoidi hanno espresso livelli simili di mesotelina, gli sferoidi sono stati almeno 100 volte meno sensibili alla SS1P. Per comprendere questa disparità di citotossicità, Xiang et al. (43) hanno prodotto delle molecole SS1P marcate con il fluorocromo Alexa488 (Figura 8): utilizzando la microscopia confocale per esaminare l’andamento temporale della penetrazione di SS1P all’interno degli sferoidi, hanno osservato una limitata penetrazione dopo 4 ore.
Figura 8. Penetrazione della immunotossina SS1P marcata
con Alexa488 in sferoidi
tumorali.
A) L’SS1P marcata con Alexa488
(fluorescenza verde). Una sezione trasversale vicino al centro di uno sferoide NCI-H226 valutato a ore 0, 8 e 16 mediante microscopia confocale.
B) Sovrapposizione delle immagini
in campo luminoso e in
fluorescenza di uno sferoide.
C) Media dell’intensità di fluorescenza della SS1P. Barre di scala, 400 µm.
36 Mediante microscopia elettronica è stato evidenziato un significativo aumento sia del numero di giunzioni strette nella zona centrale degli sferoidi, sia dell’espressione di E-caderina, una proteina coinvolta nel montaggio e nella sigillatura delle giunzioni strette e altamente espressa nel mesotelioma maligno, negli sferoidi rispetto alle colture in monostrato. È interessante notare come l’E-caderina sia uno tra i biomarker più importanti che sono stati proposti come utili nella diagnosi del mesotelioma (96; 97).
Nel loro studio, Xiang et al. (43) hanno dimostrato come un trattamento mirato alla inibizione dell’espressione (mediante siRNA – small inhibitory RNA) o dell’attività (mediante anticorpi) della E-caderina fosse in grado di migliorare la terapia con l’immunotossina SS1P.
L’E-caderina e le altre molecole di adesione cellulare saranno quindi alla base degli studi futuri sul mesotelioma come potenziali bersagli terapeutici.
37
Conclusioni e sviluppi futuri
La cultura di sferoidi è un strumento di biomimetica versatile e importante in molte aree: dalla medicina rigenerativa, allo studio in vitro e agli approcci orientati ad altre applicazioni. I miglioramenti tecnici negli ultimi dieci anni hanno facilitato la fabbricazione di un gran numero di sferoidi altamente riproducibili sia per dimensioni che per costituzione cellulare.
Nonostante nei processi biologici si possa osservare un’aggregazione spontanea in forme sferiche, bisogna considerare come sia opportuno non limitare questi modelli alla forma sferica, perché dei meccanismi di deformazione locale potrebbero svolgere dei ruoli importanti ed attualmente sconosciuti. Di primaria importanza è l’utilizzo degli sferoidi insieme a metodiche di HTS. Questo pone però nuove problematiche, a partire da quelle tecniche, che devono essere risolte di volta in volta con soluzioni su misura. Lo sviluppo di nuovi saggi e l’analisi di grosse moli di dati sono due importanti sfide da affrontare per il futuro dello studio HTS degli sferoidi.
Per concludere, crediamo che la coltura di cellule sferoidi sia in grado di fornire nuove intuizioni e soluzioni per la ricerca scientifica. Abbiamo apprezzato gli studi che hanno indagato e indagheranno sulla formazione di tessuti complessi come modelli biologici o soluzioni ingegnerizzate, soprattutto perché, in un futuro non lontano, potranno permettere ad un numero sempre maggiore di pazienti di beneficiare di tessuti ingegnerizzati di organi come cuore e pancreas per la terapia di malattie con grosso impatto sia sociale che economico come l’insufficienza cardiaca congestizia o il diabete mellito.
38
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