TABELLE PARAMETRI FARMACOCINETIC

Tabella 1 Parametri Farmacocinetici dell’enrofloxacina per ogni singola tartaruga.

Parametro Unità Tart. 1 Tart. 3 Tart. 4 Tart. 5 Tart. 6 Tart. 7 Tart. 8 Tart. 9 Tart. 10 Tart. 11 Tart. 12 Tart. 13 Tart. 14

R² 0,99 0,73 0,88 0,9 0,99 0,97 0,91 0,95 0,99 0,8 0,8 0,93 0,1 λz 1/h 0,025 0,016 0,02 0,012 0,0066 0,017 0,016 0,023 0,01 0,018 0,017 0,015 0,015 Hl h 27,5 41,95 33,5 59,16 104,26 41,13 43,03 29,92 68,07 38,5 39,7 46,11 46,02 Tmax h 4 2 4 4 2 2 2 4 2 2 2 2 2 Cmax ng/mL 13319,7 12968,9 8220,8 12572,7 15868,9 13973,1 9801,8 6717,5 8376,3 5794,7 10520,04 8464,2 8092,9 AUC 0-∞ h*ng/mL 342680 205961 159093 533114 534484 482272 233932 132578 248328 172217 302164 444572 222599 Vz mL/kg 1158,8 2938,3 3038,3 1600,9 2814,1 1230,3 2653,8 3255,8 3954,8 3225,1 1895,8 1496,5 2983,8 Cl mL/h/kg 29,2 48,55 62,86 18,76 18,71 20,73 42,75 75,43 40,27 58,07 33,09 22,49 44,94 AUMC 0-∞ h²*ng/mL 12649729 11771708 5506992 40402320 51372895 25825931 10918947 4987811 17550084 10600067 16039822 29236296 10190079 MRT h 37 57 35 76 96 53,55 46,7 37,6 70,7 61,5 53,1 65,8 45,8 4 . Risu ltati 43

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TABELLE PARAMETRI FARMACOCINETICI

Parametro Unità Media DS

R² 0,84 0,23 Λz 1/h 0,016 0,005 Hl H 47,60 20,25 Tmax H 2,61 0,960 Cmax ng/mL 10361 3103 AUC 0-∞ h*ng/mL 308769 144441 Vz mL/kg 2480,5 896 Cl mL/h/kg 39,68 18,15 AUMC 0-∞ h²*ng/mL 19004052,4 14002254 MRT H 56,59 17,52

Tabella 2 Parametri farmacocinetici medi dell’enrofloxacina e relative deviazioni standard

Parametro Unità Media SD

R² 0,94 0,12 Λz 1/h 0,018 0,0009 Hl H 37,4 24,2 Tmax H 8 2,4 Cmax ng/mL 301,68 147,6 AUC 0-∞ h*ng/mL 17751 5463 AUMC 0-∞ h²*ng/mL 1047421 548756 MRT H 59 21,3

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5. DISCUSSIONE

Nonostante le origini americane, da molti anni la tartaruga acquatica è considerata come animale domestico anche in Europa. Studiare la farmacodinamica e farmacocinetica di un antibiotico ampiamente commercializzato in medicina veterinaria come l’enrofloxacina è utile per salvaguardare la salute di questo animale e dell’ambiente circostante, visto che la tartaruga può infettarsi e contemporaneamente essere portatrice di agenti infettivi, per esempio la Salmonella (Nagano et al., 2006). Ogni anno la Salmonella causa 1,4 milioni di infezioni e 400 decessi. Circa il 6% di casi sono riconducibili al contatto diretto con rettili e spesso ad essere colpiti sono i bambini. Nelle tartarughe la Salmonella costituisce la flora intestinale e di conseguenza questo batterio viene riversato nelle feci, per cui l’uomo può entrare in contatto con esso. Le infezioni riguardano maggiormente i bambini perché la tartaruga è un animale lento, piccolo, pacifico e viene spesso trattato come giocattolo. È stato visto che un metodo efficace per ridurre le infezioni da Salmonella nelle tartarughe è quello di lavare la superficie delle uova con candeggina e successivamente, lavarle con antibiotici in una camera a vuoto; in particolare l’enrofloxacina svolge un ruolo fondamentale in questi trattamenti (Harris et al., 2010).

La farmacocinetica dell’enrofloxacina è stata studiata anche in altre specie di tartarughe come le Caretta Caretta alle quali sono stati somministrati 10 mg/kg di enrofloxacina per via orale e le Trachemis Scripta Elegans alle quali sono stati somministrati 5 mg/kg di farmaco per via intramuscolare. In questi studi le concentrazioni plasmatiche di enrofloxacina restano sopra il limite di quantificazione per 168 ore nelle Caretta Caretta e

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per 48 ore per le Trachemis Scripta Elegans. Nel presente studio la concentrazione ematica di enrofloxacina permane sopra il limite di quantificazione per 192 ore. Il metodo analitico usato è risultato più sensibile dei metodi usati nei precedenti studi. Infatti, il limite di quantificazione calcolato è 0.05 µg/mL per le Trachemis Scripta Elegans e 0,03 µg/mL per le Caretta Caretta, valori molto maggiori rispetto a quello riscontrato nel presente studio (0,001 µg/mL). Questa maggiore sensibilità ha permesso di descrivere meglio la parte terminale della curva concentrazione vs tempo. La farmacocinetica ricavata dal presente studio è risultata differente da quella evidenziata in tartarughe simili (Trachemis Scritpta Elegans vs Trachemis Scripta Scripta), ma descrive in maniera più accurata l’andamento dell’enrofloxacina in seguito a somministrazione intramuscolare. Oltre ad usare una metodica più sensibile, sono state analizzate un numero di tartarughe notevolmente maggiori rispetto al precedente studio (6 vs 14), rendendo i presenti risultati statisticamente più forti. La cinetica mostrata in questo studio non sembra comunque discostarsi molto da quella in tartarughe più grandi come le Caretta Caretta (Jacobson et al., 2005).

Proprietà farmacocinetiche vantaggiose sia per l’enrofloxacina che per tutti i fluorochinoloni includono un rapido assorbimento, elevati volume di distribuzione ed emivita. Nelle specie Caretta Caretta, in seguito a somministrazione per via orale di enrofloxacina 10 mg/kg, il Tmax è di 5 ore, mentre nel presente studio è 2,5 ore, ciò suggerisce che la somministrazione per via intramuscolare permette un assorbimento più rapido rispetto alla somministrazione orale. Inoltre il tempo di emivita nelle Caretta Caretta risulta pari a 37,80 ore, nelle Trachemis Scripta Elegans di 17,64 ore, mentre in questa sperimentazione è stato trovato un valore di emivita molto

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maggiore (47,60 ore). Un vantaggio dell’elevato tempo di emivita è che la frequenza di somministrazione di enrofloxacina nelle tartarughe è ridotta rispetto ai mammiferi.

In seguito al lancio sul mercato negli anni ’80 i fluorochinoloni sono diventati il gruppo di antibiotici di origine sintetica più usato in medicina veterinaria. Tra questi l’enrofloxacina è l’antibiotico più comunemente usato anche per il trattamento di infezioni batteriche nei rettili per la sua attività contro gram +, gram – e pochi effetti collaterali associati al suo uso (Jacobson, 1999). Nonostante abbia molti vantaggi clinici come ampio spettro d’azione ed indice terapeutico, in alcuni studi è stato riscontrato che la forma iniettabile può essere estremamente irritante. Ad esempio in uno studio con le Galapagos tortoise (Casares, Enders, 1996) trattate con una soluzione di enrofloxacina 100 mg/mL a dosaggi 5 mg/kg per via intramuscolare, sono stati riscontrati notevoli effetti collaterali come convulsioni, ipereccitazione, diarrea e ipersalivazione. In un altro studio (James et al., 2003) sono state trattate tartarughe Trachemis Scripta Elegans le quali hanno ricevuto enrofloxacina 22 mg/mL a dosaggi 10 mg/kg per via intramuscolare, quindi una soluzione meno concentrata, ma a dosaggio più alto rispetto al precedente. Gli animali, in questo caso, in seguito all’iniezione hanno evidenziato dolore e fastidio nella zampa, dimostrata dal ritiro di questa nel guscio e dalla difficoltà di deambulazione. Dati questi effetti collaterali, in entrambi gli studi è stato suggerito che la somministrazione per via orale è quella ottimale (Jacobson et al., 2005). Nel presente studio, le tartarughe sono state trattate per via intramuscolare 10 mg/kg con una soluzione 50 mg/mL diluita a 10 mg/mL ed è stato visto che gli animali provano dolore all’iniezione, reagendo con movimenti veloci e scoordinati

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solo per alcuni secondi ma non evidenziano difficoltà natatorie o deambulatorie in seguito alla somministrazione. Inoltre, seppur le tartarughe siano state trattate con una somministrazione intramuscolare, non sono stati riscontrati fenomeni di necrosi e irritazione tissutale come riscontrato con soluzioni di enrofloxacina a concentrazioni elevate. È’ probabile che, diluendo maggiormente la soluzione, si arrivi ad una condizione in cui l’animale non avverta nessun tipo di dolore. La somministrazione orale non è quindi risultata la più vantaggiosa in questa razza di tartarughe, poiché per animali di piccola taglia come le tartarughe Trachemis Scripta Scripta richiederebbe una sonda orogastrica o strumenti per bloccare la testa ed assicurare così l’arrivo del farmaco al livello gastrico, ma sono metodiche rischiose per l’insorgenza della polmonite ab ingestis, difficoltà respiratorie, soffocamento e potrebbero recare stress all’animale fino alla morte se applicati anche per brevi periodi (Wimsatt et al. 2008).

Da sempre, la minima concentrazione inibente (MIC) di un farmaco è stata usata per valutare i dosaggi antimicrobici al fine di avere un effetto terapeutico evitando gli effetti collaterali. La MIC però è un parametro abbastanza generico perché non valuta efficacemente il dosaggio da somministrare. Infatti, per la specie Pseudomonas Aeruginosa, un gram negativo che ha betalattamasi in grado di inattivare penicilline e cefalosporine e altera la permeabilità dei canali di membrana, un picco di concentrazione sanguigna 4 volte superiore la MIC esercita sia un effetto soprainibitorio che postantibiotico, prolungando la sua attività per diverse ore anche quando la concentrazione sanguigna scende sotto i valori di MIC. Più recentemente sono stati proposti altri 3 parametri per prevedere con più precisione il risultato terapeutico: (1) il tempo durante il quale la

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concentrazione sanguigna del farmaco rimane sopra i livelli di MIC ( t> MIC), (2) rapporto tra la massima concentrazione sanguigna e la MIC (Cmax/MIC) (3) rapporto tra AUC e MIC. Poiché i fluorochinoloni hanno un’attività antibatterica concentrazione dipendente, questi nuovi parametri sono stati identificati come possibili predittori farmacodinamici rispettivamente di risultati clinici e microbiologici per contrastare la resistenza batterica. In particolare sperimentazioni su modelli in vitro hanno evidenziato che alti valori di Cmax/MIC sono importanti nel prevenire la resistenza batterica, mentre AUC/MIC è un parametro importante per valutare l’effetto terapeutico e t>MIC è importante per sapere quanto tempo l’organismo è coperto dall’effetto terapeutico dell’antibiotico. È stato suggerito che valori Cmax/MIC > 10 sono richiesti per i chinoloni al fine di prevenire la resistenza batterica, mentre valori AUC/MIC nel range 100-125 sono consigliati al fine di avere un buon effetto terapeutico (Jacobson et al. 2005). Sebbene i valori di MIC isolati dalle tartarughe Trachemis Scripta Scripta non sono disponibili, sono stati riportati altri valori di MIC provenienti dalle tartarughe dalle orecchie rosse (Trachemis Scripta Elegans), come valori di riferimento. Uno studio con enrofloxacina (Jacobson et al.,2005) indica che nella maggior parte di batteri isolati da queste tartarughe il farmaco presenta una MIC < 0,5 µg/mL, mentre in alcuni batteri come la Pseudomonas, che sono più resistenti, ha una MIC intorno a 1,0 µg/mL. Nel presente studio, se prendiamo come valore di MIC 1,0 µg/mL per determinare la dose ottimale, vediamo che: (1) il tempo in cui la concentrazione sanguigna è maggiore della MIC è 72 ore di media, in particolare 96 h per la tartaruga 1, 48 h per la tartaruga 3,4, 9 e 11, 72 h per la tartaruga 8, 10, 12 e 14, 120 h per la tartaruga 6, 144 h per la tartaruga 7, 168 h per la tartaruga 13; (2) il rapporto Cmax/MIC è pari a 10,3 di media,

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approssimativamente uguale al valore consigliato ma si è comunque osservato che un gruppo di tartarughe (1, 5, 6, 7, 8, 12) presentano un rapporto Cmax/MIC superiore, nel range di 10-13, mentre un gruppo di tartarughe (3,4,9,10,11,13,14) hanno un rapporto Cmax/MIC inferiore, nel range di 5,7-8,4; (3) il rapporto AUC/MIC medio è 308, quindi molto maggiore del range consigliato, in particolare i valori singoli cadono in un intervallo di 132-534. Da questi parametri farmacodinamici possiamo concludere che la dose di 10 mg/kg di enrofloxacina somministrata inizialmente alle tartarughe per via intramuscolare è molto efficace per il trattamento di infezioni da ceppi batterici che hanno una MIC fino a 1,0 µg/mL, ma i dati provenienti dal parametro (2) ci fanno capire che in alcuni soggetti c’è comunque un lieve rischio di resistenza batterica.

Il dosaggio somministrato nel presente studio sembra quindi ottimale, infatti l’enrofloxacina ha un meccanismo d’azione selettivo per le cellule batteriche ad una concentrazione 0,1- 10 µg/mL, mentre a concentrazioni 100-1000 µg/mL perde la sua selettività ed inibisce anche la topoisomerasi II presente nelle cellule mammifere (Papich, Riviere, 2009). Nel presente studio è stata riscontrata una concentrazione massima di enrofloxacina (Cmax) di 10,3 µg/mL, quindi è stato raggiunto il massimo grado di potenza antibatterica, senza oltrepassare il limite oltre il quale il farmaco potesse agire anche sulle cellule di tartaruga.

Durante questa sperimentazione i campioni sono stati ottenuti tramite prelievo di sangue dal seno venoso post-occipitale (zona cervicale). Tale procedura è risultata abbastanza difficoltosa poiché il sangue fuoriesce dopo alcuni secondi e defluisce lentamente, col rischio di coagulazione nella

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siringa. Inoltre nell’ottenere i campioni c’è il rischio di contaminazione da parte della linfa. Dove tale contaminazione è risultata evidente (sangue di colore chiaro e sbiadito) è stato ripetuto il prelievo, anche se effettivamente non sarebbe stato necessario poiché la concentrazione di enrofloxacina presente nella linfa è equivalente alla concentrazione di farmaco nel sangue (Liu et al., 2002). L’enrofloxacina, una volta nel sangue, non ha una percentuale alta di legame con le proteine plasmatiche, inoltre è lipofila e oltrepassa bene le membrane grazie alla diffusione passiva, quindi questo si riflette in un elevato volume di distribuzione (Bidgood, Papich, 2005).

L’enrofloxacina nell’organismo della tartaruga viene metabolizzata a ciprofloxacina grazie ad una reazione di deetilazione ed entrambi le molecole hanno attività antibiotica (Brown, 1996). Data l’ampia commercializzazione e uso dei fluorochinoloni in ambito veterinario, molti studi di farmacocinetica sono stati fatti a riguardo di queste 2 molecole e sono state prese in considerazione varie specie animali, per esempio mammiferi e specie acquatiche. Per quanto riguarda i mammiferi sono state studiate molte specie. Un esempio è quello di capre alle quali sono stati somministrati 2,5 mg/kg di enrofloxacina soluzione iniettabile per via intramuscolare. Parametri farmacocinetici evidenziano che l’AUC dell’enrofloxacina è 2,09 µg*h/mL mentre la ciprofloxacina ha un’AUC pari a 0.74 µg*h/mL. A livello endogeno l’enrofloxacina viene metabolizzata per il 35% a ciprofloxacina, quindi l’azione antibiotica è maggiormente attribuita all’enrofloxacina, mentre la ciprofloxacina è probabile che contribuisca all’effetto terapeutico 1/3 rispetto all’enrofloxacina (Reo et al., 2001). Come specie acquatiche, invece, sono stati investigati specie di Eriocheir Sinensis (granchio cinese), ai quali sono stati somministrati 5 mg/kg di enrofloxacina per via intramuscolare tra il

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quarto arto e la membrana parietale. I valori di AUC per l’enrofloxacina e la ciprofloxacina riscontrati nell’emolinfa sono rispettivamente 269,24 µg*h/mL e 39,99 µg*h/mL. La percentuale di enrofloxacina metabolizzata a ciprofloxacina è 15 %, molto minore rispetto alla specie mammifera. Anche in questo caso si può ipotizzare che l’attività antibiotica è maggiormente dovuta all’enrofloxacina (Guanghong et al., 2006). Nel presente studio i valori di AUC di enrofloxacina e ciprofloxacina nelle tartarughe sono rispettivamente 308,769 µg*h/mL e 17,751 µg*h/mL. La percentuale di enrofloxacina metabolizzata a ciprofloxacina è circa 5% e questo indica che l’attività antibatterica è attribuita maggiormente all’enrofloxacina come negli studi precedenti. Inoltre la percentuale di farmaco metabolizzata è molto più bassa e questo è dovuto al fatto che il metabolismo nelle tartarughe è molto lento rispetto alle altre specie (Ertl, Winston, 1997).

Il metabolismo di fase I degli xenobiotici avviene grazie ad una superfamiglia enzimatica molto numerosa, ovvero il citocromo P450, che fa parte della classe delle monoossigenasi. Il ruolo di questo sistema enzimatico è stato ampiamente studiato nei mammiferi (Ortiz de Montellano, 1995), mentre scarsa attenzione è stata riservata per i rettili. In uno studio (Ertl, Winston, 1997) è stato visto che nei rettili le famiglie di citocromi maggiormente espresse sono la CYP1A e la CYP2B, mentre per quanto riguarda il metabolismo generale dei fluorochinoloni, l’enrofloxacina è metabolizzata a ciprofloxacina grazie ad una reazione di deetilazione che avviene tramite il CYP450 3A (Vaccaro et al., 2003). Questo può essere utile, nel presente studio, per giustificare i bassi livelli di ciprofloxacina prodotta nelle tartarughe. Infatti, si può supporre che siano carenti della sottofamiglia del citocromo P450 3A, per cui metabolizzando poco l’enrofloxacina, si

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riscontrano basse concentrazioni di ciprofloxacina ed alte concentrazioni del farmaco parentale nel sangue. Un’altra considerazione importante è che la ciprofloxacina è il metabolita primario, ma anch’essa può essere metabolizzata ad altri metaboliti coma mostrato in figura 26. Infatti sia nell’uomo che nell’animale si possono ritrovare tracce di formil-ciprofloxacina (FCPFLX), oxociprofloxacina (OCPFLX), desetilciprofloxacina (DECPFLX) e solfociprofloxacina (SCPFLX) sia nelle urine che nelle feci, in seguito a somministrazione di ciprofloxacina (Anadon et al., 2001).

54 Ciprofloxacina Enrofloxacina DECPFLX FCPFLX SCPFLX DECPFLX

Figura 26 Metaboliti primari e secondari derivati dall’enrofloxacina.

Dai cromatogrammi del presente lavoro oltre ai picchi relativi all’enrofloxacina e alla ciprofloxacina è stato evidenziato un ulteriore picco, forse relativo ad un altro metabolita. Esso ha un andamento simile alla ciprofloxacina ed è tempo-dipendente, ma non avendo uno standard puro di questa molecola non è stato possibile quantificarlo. Si suppone che tale

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composto sia o un metabolita secondario dell’enrofloxacina, o che sia un metabolita derivante dalla ciprofloxacina, la quale, appena formata, viene subito metabolizzata da specie di CYP 450 1A o 2B, perché le più espresse nelle tartarughe (Ertl, Winston, 1997). Comunque ulteriori studi sono necessari per chiarire questo punto.

Un altro aspetto importante del nostro studio riguarda il fatto che le tartarughe sono entrate a far parte della catena alimentare umana. Infatti, per molte culture orientali tali animali sono fonte di cibo (Ertl, Winston, 1997), come ad esempio la cultura occidentale impiega la carne di suino. In questo caso, data la preoccupazione della resistenza batterica, la World Health Organization (WHO) e la Food and Drug Administration hanno stabilito restrizioni sull’uso di fluorochinoloni in medicina veterinaria, perché concentrazioni di ciprofloxacina si possono ritrovare nella carne di animali destinata alla macellazione (Blesa et al., 2012). Tali restrizioni dovrebbero allargarsi anche ad altre specie animali impiegate dall’uomo nella catena alimentare, come le tartarughe, descrivendo con precisione il tempo necessario all’animale per liberarsi dell’antibiotico in relazione al suo metabolismo e i Limiti Massimi Residuali (LMR), ovvero la concentrazione massima di farmaco consentita che possiamo trovare in una carne trattata, senza alcun rischio. È importante considerare però che la concentrazione di enrofloxacina e ciprofloxacina riscontrata nel plasma non è uguale alla concentrazione che troviamo nei tessuti. Uno studio (Davis et al., 2002), infatti, ha evidenziato che dopo la somministrazione di enrofloxacina, il rapporto ciprofloxacina : enrofloxacina nei tessuti dei bovini è maggiore di 1, a differenza della bassa concentrazione sanguigna di ciprofloxacina. Inoltre la concentrazione di quest’ultima nella carne rimane per oltre 12 giorni dopo

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la somministrazione. Bisogna tenere presente che in alcune culture orientali la tartaruga è consumata abitualmente, ed è quindi necessario valutare le concentrazioni plasmatiche dell’antibiotico. Ancora più sicuro è valutare residui di enrofloxacina e del suo metabolita ciprofloxacina anche nei tessuti e nelle parti edibili. Un altro fattore da prendere in considerazione è la stabilità dei residui chinolonici a procedimenti di cottura, come è stato dimostrato per l’acido ossolinico in alcune specie ittiche. In seguito a cottura del salmone, possono essere presenti residui di farmaco non individuabili nel prodotto fresco (Badino, Odorel, 2009). Ciò suggerisce che il procedimento di cottura favorisca il rilascio di residui di farmaco da organi e/o tessuti che fungerebbero da serbatoio, ma non è chiaro se questa considerazione si possa estendere al presente studio poiché l’enrofloxacina non è un chinolonico, ma bensì un fluorochinolone e ad oggi non ci sono ancora studi che valutano l’influenza della cottura sulla stabilità di tali residui nei tessuti di tartaruga.

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6. CONCLUSIONI

Dalla seguente sperimentazione si può affermare che la somministrazione di enrofloxacina 10 mg/mL alla dose di 10 mg/kg per via intramuscolare in tartarughe Trachemis Scripta Scripta sia adatta per il trattamento di infezioni batteriche. La cinetica piuttosto lunga nel tempo permette somministrazioni meno frequenti rispetto a specie mammifere, ma è necessaria maggiore attenzione alla presenza di residui nel caso di allevamento di tartarughe a scopo alimentare. Ulteriori approfondimenti su tempi di sospensione e LMR sono richiesti, al fine di salvaguardare anche la salute del consumatore.

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