Test di migrazione e proliferazione cellulare

Il test è stato eseguito su una linea cellulare epiteliale corneale di coniglio immortalizzata (RCE, ECACC) fatta crescere in un mezzo di crescita cellulare avente la seguente composizione: Dulbecco’s modified Eagles medium (DMEM) arricchito con Ham’s nutrient F12 (1:1), L-glutamina (1% v/v, 2 mM), penicillina (100 UI/ml), streptomicina (0.1 mg/ml), amfotericina B (0.25 µg/ml), siero fetale bovino (15% v/v), insulina (5 µl/ml), fattore di crescita epidermico (10 ng/ml). Le cellule sono state incubate a 37°C, in atmosfera satura

di umidità e con il 5% di CO2. Per gli esperimenti, RCE sono state seminate su due tipolgie

di piastre di Petri (Culture-Insert 2 Well in µ-Dish 35 mm, Ibidi e Culture-Insert 4 Well in µ-Dish 35 mm, high, Ibidi ) in cui è presente un inserto. Nella prima, l’inserto è costituito da

2 camere con un’area di crescita ciascuna di 0.22 cm2 divise da un setto che occupa uno

spazio tra le cellule di 500 ± 50 µm. La seconda, invece, presenta un inserto costituito da

4 camere con un’area di crescita ciascuna di 0.35 cm2 divise un setto di 500 ± 100 µm e

uno spazio centrale di 1000 ± 100 µm.

Fig. 10- µ-Dish Ibidi 0.22 cm2

Fig

.

11

-

µ-Dish Ibidi 35 mm

RCE sono state seminate, alla concentrazione di 6·105 cellule/ml, 70 µl in ciascuna

camera per quelle da 22 mm e 110 µl per quelle da 35 mm. Dopo 24 ore, le cellule hanno raggiunto la confluenza e l’inserto è stato rimosso, mostrando 2 o 4 aree cellulari separate da un’apertura di dimensioni precise. La coltura è stata quindi mantenuta in condizioni di crescita diverse fino alla totale chiusura dell’apertura. A tempi prestabiliti di 0, 2, 4, 6, 8, 24 ore dopo la rimozione dell’inserto sono state eseguite microfotografie tramite il microscopio digitale (Dino-Lite Pro, USB Handheld Digital Microscope) e le immagini sono state analizzate mediante il software ImageJ (software di dominio pubblico sviluppato dal National Institute of Mental Health, dipartimento del NIH) per determinare la dimensione dell’apertura e da essa il percorso di migrazione cellulare.

RCE sono state mantenute in contatto con:

- mezzo di crescita contenente il 5% di siero;

- mezzo senza siero (SS) addizionato di 5% v/v LP (); - matrice PVA-LP disciolta in 2 ml di mezzo SS;

- matrice PVA/PVP- LP disciolta in 2 ml di mezzo SS.

6. Risultati

Questa parte del presente lavoro di tesi ha riguardato la preparazione di matrici liofilizzate in grado di migliorare la somministrazione oftalmica nell’area precorneale e di prolungare il tempo di conservazione del lisato piastrinico, usato nella cura delle lesioni corneali

associate alla patologia dell’occhio secco. Sono state preparate due tipologie di matrici

liofilizzate, una contenente PVA 5% e l’altra una miscela di PVA/PVP (5:1), sia caricate

con LP che non. Tali materiali polimerici sono stati scelti in base ad esperimenti precedentemente eseguiti in termini di tempo di idratazione, viscosità dopo ridispersione, tollerabilità e tempo di permanenza nell’area precorneale delle matrice liofilizzata. Le matrici liofilizzate medicate, PVA-LP e PVA/PVP-LP, sono state sottoposte ad un test di proliferazione e migrazione cellulare, come test indicativo della velocità di guarigione di una ferita superficiale corneale. Risultati positivi possono indirettamente indicare il mantenimento dell’integrità del lisato piastrinico nella forma farmaceutica e la stabilità del materiale.

I risultati del test di proliferazione e migrazione cellulare sono riportati in Tab.4 come riduzione dello spazio di apertura fra due aree cellulari nel tempo (tempo di chiusura in ore), rappresentante lo spazio (m) e la velocità di guarigione (m/h). La migrazione dopo 8 ore di esperimento, la velocità di guarigione e il tempo di chiusura sono stati valutati mettendo le cellule a contatto con il mezzo di crescita in cui il siero in esso presente è stato sostituito con LP (LP) o le rispettive matrici disciolte in mezzo senza siero (PVA-LP, PVA/PVP-LP). Come controllo è stato utilizzato il mezzo di crescita contenente 5% di siero. Dopo 8 ore di contatto con il mezzo di crescita, la migrazione cellulare è stata di 89.515.19 m con una velocità di guarigione di 12.195.23 m/h e 43.84 ore necessarie per ottenere la completa chiusura della ferita. Quando il siero è stato sostituito nella stessa quantità con lisato piastrinico ricco in fattori di crescita, si assiste ad un aumento della

migrazione cellulare (121.4032.80 m) e della velocità di guarigione (16.546.65 m/h) con riduzione del tempo di chiusura della ferita, passando da 43.84 a 32.99 ore. L’effetto del LP è messo ancora più in risalto quando è stato veicolato nella matrice PVA/PVP-LP. L’aggiunta di PVA/PVP-LP al mezzo di crescita senza siero porta agli stessi risultati ottenuti con il lisato piastrinico quando consideriamo la migrazione dopo 8, ma ad un incremento nella velocità di chiusura dello spazio tra le aree cellulari ed una ulteriore riduzione del tempo di chiusura, raggiungendo le 25 ore.

Nel caso della matrice PVA-LP non è stato possibile effettuare il test a causa di interferenze sulle misure sperimentali.

In conclusione, LP sembra agire positivamente sulla velocità di proliferazione delle cellule; l’inserimento dello stesso in una matrice polimerica, in particolare PVA/PVP, agevola ulteriormente la guarigione delle ferite, probabilmente stimolando l’adesione e la proliferazione cellulare.

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Tab. 3 – Tempo di idratazione (TIM) delle matrici polimeriche in studio (Media ± ES, n=4).

Fig. 12 – Indice di comprimibilità delle formulazioni allo studio.

Formulazione TIM, ore PVA 0.78 ± 0.01 PVA/PVP 0.83 ± 0.01 HPMC 6.02 ± 0.05 HPMC/PVP 6.09 ± 0.04

Tab. 6 – Indice di comprimibilità (IC) delle matrici allo studio (Media ± ES, n=6).

Fig. 13 – Profilo di rilascio di FITC-DX dalle formulazioni di PVA rispetto al controllo

(FITC-DX). Formulazione IC PVA 77.76 ± 9.15 PVA/PVP 89.95 ± 8.06 HPMC 77.30 ± 8.27 HPMC/PVP 100.2 ± 6.72

Fig. 14 – Profilo di rilascio di FITC-DX dalle formulazioni di HPMC rispetto al controllo

(FITC-DX).

Tab. 4 - Risultati del test di proliferazione e migrazione cellulare.

Formulazioni Migrazione dopo 8 ore (µm) ± e.s. Velocità di guarigione (µm/h) ± e.s. Tempo di chiusura (h) Mezzo di crescita 89.50 ± 15.19 12.19 ± 5.23 43.84 LP 121.40 ± 32.80 16.54 ± 6.65 32.99 PVA-LP - - - PVA/PVP-LP 120.7 ± 13.77 19.64 ± 13.77 25.504

Tab. 5 - Dimensione molecolare ottenuta mediante Dynamic Light Scattering delle matrici

liofilizzate allo studio.

Formulazione Diametro Idrodinamico (nm ± SE) BVZ sol. 10.30 ± 0.25 HPMC/PVP 53.41 ± 4.76 648.7 ± 37.65 HPMC/PVP/BVZ 12.53 ± 0.96 653.9 ± 39.22 PVA/PVP 12.10 ± 2.24 78.60 ± 8.22 437.4 ± 85.29 PVA/PVP/BVZ 14.70 ± 2.53 96.15 ± 19.25 573.7 ± 89.60

Nel documento Matrici liofilizzate per la somministrazione oftalmica di principi attivi di natura proteica (pagine 52-66)