2. STRUTTURA E COMPONENTI CELLULARI DELLA BUCCIA D’UVA
3.1 TRATTAMENTI SULLE FECCE
a. Effetto litico provocato dal trattamento ad ultrasuoni sulle fecce fini
Le prove per valutare l’eventuale effetto litico provocato dagli ultrasuoni sulle strutture cellulari dei lieviti sono state effettuate su campioni di feccia fine fresca di Chardonnay (250 mL) raccolta presso la Cantina Rauscedo a tre mesi dalla vinificazione (Tab. 19) Subito dopo il trattamento, effettuato come previsto dal disegno sperimentale, sul campione di riferimento e sul trattato centrifugati (3000 rpm per 15 minuti) e microfiltrati (0,8 e 0,45 µm Mini-Sart, Sartorius Stedim Biotech, Goettingen, Germany), sono stati valutati rispettivamente i colloidi solubili (Usseglio-Tommaset e Castino, 1975) e le proteine solubili (metodo Lowry come riportato da Regenstein e Regenstein - 1984, prima e dopo trattamento del campione con polivinilpirrolidone PVPP – Sigma-Aldrich LLC, St. Louis, MO, USA) (Tab. 20).
Un’indagine più accurata per la valutazione della variazione nella composizione della frazione colloidale è stata, inoltre, svolta mediante cromatografia liquida ad alta pressione su gel ad esclusione molecolare. I campioni sono stati analizzati dopo filtrazione del centrifugato a 0,45 µm (Mini-Sart, Sartorius Stedim Biotech, Goettingen, Germany). Ai fini analitici sono stati utilizzati due rivelatori: uno spettrofotometrico (λ 280 nm) per la valutazione della frazione fenolica e proteica, l’altro a indice di rifrazione per l’analisi della frazione colloidale glucidica.
Sui campioni sono stati considerati anche altri parametri, quali il diametro medio delle particelle (Submicron Particle Sizer – NICOMP) del surnatante tal quale e filtrato a 0,8 µm (Mini-Sart, Sartorius Stedim Biotech, Goettingen, Germany) e la misura della carica elettrica superficiale eseguita mediante misuratore di carica superficiale Particle Charge Detector (MÜTEK).
Prova Campione Quantità trattata Tempi/Amplitudine trattamento Feccia fine
fresca
Testimone
250 mL
Ø
Trattato sperimentaleVedi piano
Tabella 19: Condizioni sperimentali per le prove di valutazione dell’effetto litico degli US sulla feccia fine fresca. Il trattamento è stato condotto secondo le condizioni previste dal piano sperimentale.
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Campione Determinazione analitica
Surnatante Carica elettrica superficiale
Torbidità
Test stabilità proteica
Diametro medio delle particelle Campione filtrato a 0,8 µm Colloidi solubili
Proteine solubili
Carica elettrica superficiale Diametro medio delle particelle Campione filtrato a 0,45 µm Quantificazione proteine
HPLC - gel permeation
Tabella 20: Schema riassuntivo delle determinazioni analitiche effettuate sui campioni, sottoposti a trattamento ad US, e non, dopo centrifugazione e/o filtrazione.
b. Confronto effetti trattamento ad ultrasuoni con lisi naturale e/o indotta (trattamento enzimatico)
Per la prova di confronto è stata utilizzata la stessa feccia della prova precedente (a), sulla quale sono stati valutati sia gli effetti immediati che quelli a lungo termine del trattamento ad ultrasuoni. Per la prova a lungo termine, le fecce sono state prelevate ed analizzate subito dopo trattamento e dopo 10 giorni, 3 mesi e 7 mesi dal trattamento di sonicazione; il campionamento ha previsto anche il prelievo del campione di riferimento e di quello trattato enzimaticamente (40 mg/L di enzima con attività β-glucanasica - Glucanex®, Novozymes Corp., Switzerland). Per ciascuna prova (riferimento, enzima, US) sono state preparate tre bottiglie (750 ml) saturate con azoto, conservate a 16 °C per 7 mesi ed agitate almeno una volta alla settimana.
Le condizione scelte prevedevano un trattamento di 3 minuti al 90% di amplitudine in quanto, da prove preliminari, si è verificato che questa è la condizione che comporta il maggior rilascio di colloidi.
Ad ogni campionamento sono stati prelevati e centrifugati 100 mL di campione e monitorati gli stessi parametri analitici valutati per la prova precedente (Tab. 19).
Gli effetti a breve termine (0, 10 e 20 giorni) sono stati valutati su una replica della prova con le fecce B le cui caratteristiche sono descritte in seguito. In questo caso, sono stati scelte due diverse condizioni di trattamento: 3 minuti al 90% e 5 minuti al 60% su un campione di 250 mL. È stata aggiunta una β-glucanasi commerciale alla concentrazione di 50 mg/L. Tutti i trattamenti sono stati effettuati in triplo (Tab. 21).
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Prova Campione Quantità trattata Tempi/Amplitudine trattamento monitoraggioTempo Confronto nel breve e lungo perido Testimone 750 mL Ø t0, 10 giorni, 3 e 7 mesi Trattato US 3 min 90% Feccia + Enzima Ø Effetto nel breve perido Testimone 250 mL Ø t0, 10 e 20 giorni
Trattato US 5 min 60%3 min 90% Feccia +
Enzima Ø
Tabella 21: Condizioni sperimentali per le prove di valutazione nel breve e lungo periodo dell’effetto litico degli US sulla feccia fine fresca confrontata con il campione sottoposto a lisi naturale (Testimone) e a quello aggiunto di enzima.
c. Effetto del trattamento ad ultrasuoni su tre diverse fecce
Per confrontare gli effetti su tre diversi tipi di fecce di vino bianco sono state scelte le condizioni di trattamento più intense: 3 e 5 minuti al 60% e 90% di amplitudine su 250 mL di campione (Tab. 22).
Le fecce A e B sono state raccolte in aziende della DOC Colli Orientali del Friuli, mentre la feccia C nella DOC Friuli Grave.
Feccia A: proveniente dal serbatoio di primo travaso, varietà del vitigno cv. Friulano, ceppo lievito commerciale Zymaflore X5 (Laffort); termine fermentazione 11 settembre. Grossolana e con aspetto non omogeneo.
Feccia B: feccia fine, di aspetto liquido ed aromatica, proveniente da due botti in rovere sottoposta a bâttonage ogni due giorni; i vini sono stati trasferiti nelle barriques a fine fermentazione ed il travaso successivo è stato effettuato a fine novembre. Una delle botti conteneva cv. Friulano (fine fermentazione 30/9/201, inoculato con Sacch. cerevisiae Top15 - Enartis) mentre l'altra cv. Pinot Bianco (fine fermentazione 16/10/2011, inoculato sia con Torulaspora delbrueckii Zymaphlore alfa che con S. cerevisiae VL1 - Laffort). Feccia C: densa e viscosa, ha comportato difficoltà nel rimescolamento.
Sulle tre fecce sono stati monitorati tre parametri: i colloidi solubili totali, le proteine solubili e totali (metodo KDS-BCA) ed i polisaccaridi totali (metodo del fenolo).
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Prova Campione Quantità trattata Tempi/Amplitudine trattamento
Feccia fine fresca Testimone Feccia A, B, C 250 mL Ø Trattato Feccia A 3 min 60% e 90% 5 min 60% e 90% Trattato Feccia B Trattato Feccia C
Tabella 22: Condizioni sperimentali per le prove di valutazione dell’effetto litico degli US su tre diverse fecce fini confrontate con i rispettivi campioni non trattati (Testimone).
d. Aggiunta di fecce trattate con ultrasuoni al vino instabile
Le fecce trattate con ultrasuoni, con contenuto noto di proteine e polisaccaridi, sono state centrifugate ed aggiunte al vino instabile in modo da ottenere una concentrazione di glicoproteine comprese tra 50 e 300 mg/L.
Per le prove sono stati utilizzati due vini instabili a fine fermentazione: un Sauvignon blanc proveniente dalla DOC Colli Orientali del Friuli ed un Sauvignon blanc della DOC Friuli Grave.
Prima e dopo (48 ore) l’aggiunta, sono stati eseguiti i test di stabilità proteica e determinato il contenuto di proteine e polisaccaridi in modo da verificare quali colloidi rimangono solubili.