Anche con uno strumento così complesso, l’HPCL è ancora utile per rimuovere le interferenze dal campione che andrà incontro alla ionizzazione. Strettamente correlate alla LC/MS sono alcune altre tecniche come
l’Iniezione di flusso/MS, la CE o CEC/MS, la LC capillare o nano LC/MS. In tutti i casi v’è la necessità di
un interfacciamento che eliminerà il solvente e genererà ioni nella fase gassosa, trasferiti poi alle ottiche dello spettrometro di massa.
(http://chemweb.ucc.ie/mass%20spec/MS%20summary.pdf)
La maggior parte degli strumenti utilizzano la ionizzazione a pressione atmosferica in cui l’eliminazione del solvente e i vari livelli di ionizzazione sono combinati alla sorgen te e si evidenziano a pressione atmosferica.
Pertanto la tecnica di ionizzazione più convincente per l’accoppiamento LC-MS, è rappresentata proprio dalla Atmospheric Pressure Ionization (API) dove la ionizzazione avviene a pressione atmosferica, introducendo poi gli ioni nel sistema ad alto vuoto dell’analizzatore di massa guidati da opportuni campi elettrici.
L’ESI è una delle molteplici varianti dell’API applicata tra l’uscita di un unità HPLC e l’ingresso di uno spettrometro di massa. Quando appunto si scegliesse la ESI la ionizzazione ad impatto elettronico, l’eliminazione del solvente e i vari gradi di ionizzazione sono separati. L’interfaccia è un particolare fascio di ioni, che separa il campione dal solvente e segue tosto alla introduzione del campione sotto forma di particelle secche nella regione ad alto vuoto.5 Nell’ESI classico la nebulizzazione avviene per semplice repulsione elettrostatica tra le particelle (goccioline) cariche producendo come abbiamo visto, uno spray molto allargato; si può osservare altresì, l’Ion Spray Ionization (ISI) in cui la nebulizzazione viene assistita da un nebulizzatore a gas (aria o azoto) che produce uno spray più direzionale, una maggiore compatibilità con acqua, nonché la possibilità di utilizzare flussi più elevati. Queste caratteristiche rendono particolarmente adatto l’ISI all’accoppiamento con l’HPLC. In ogni caso è spesso utile suddividere il flusso proveniente dall’HPLC prima del collegamento alla sorgente, al fine di ottenere un miglioramento del rapporto segnale/rumore, un recupero di parte del campione senza alterare la sensibilità in quanto l’ESI dipende dalla concentrazione dell’analita e non dalla sua quantità. Nella TIS (Turbo Spray Ionization) infine si può incrementare la velocità di evaporazione del solvente mediante immissione controcorrente di un flusso di aria riscaldata per operare come già osservato, a flussi di anche 1-5ml/min senza necessità di frazionare, suddividere un insieme di dati particolarmente grande (“splittare” da to split).
1.3.4 Modalità di acquisizione dei dati
Full Scan MS, Product Ion Scan ( MS/MS o MSn), Selected Ion Monitoring (SIM), Selected Reaction Monitoring (SRM), Neutral Loss Scan (NL), Precursor Ion Scan (PIS).
Nella modalità Full Scan MS l’analizzatore trasmette al detector tutte le masse e pertanto il cromatogramma deriva dalla corrente ionica totale (TIC), e non risulta selettiva in una miscela complessa. Considerando il tempo di sosta nell’analizzatore (dwell time) come abbiamo già accennato, si comprende come questa modalità sia poco idonea a rilevare le sostanze di cui si hanno solo tracce a disposizione.
Migliori risultati si ottengono usando l’analizzatore a trappola ionica che permette di trattenere in studio gli ioni interessati per un tempo modulabile a volontà. Gli ioni vengono segnalati come Extracted ion
chromatogram (XIC).
Un cromatogramma SIM (Selected Ion Monitoring) assomiglia a quello XIC (detto anche EIC) e monitorizza solo gli ioni oggetto dell’indagine; ma a differenza di quest'ultimo, dove i segnali vengono estratti da una scansione completa, nel SIM vengono direttamente acquisiti solo i segnali di interesse. Ovvero solo quelli provenienti da ioni con particolare rapporto m/z. E’ la tecnica più adatta a quantificare le sostanze in tracce che potrebbero sfuggire alle precedenti metodiche. Lo ione viene identificato quando il dwell time (tempo di sosta) è come quello dello standard puro e quando i picchi sono almeno 3 volte più evidenti di quello del rumore di fondo.
Un cromatogramma Selected Reaction Monitoring (SRM), monitoraggio di reazione selezionata, è un tipo di cromatogramma che si ottiene con spettrometri di massa tandem come rilevatori. Il cromatogramma riporta i segnali degli ioni prodotti da specifici ioni genitori. Dallo ione precursore si segue il processo fino allo ione frammento. Lo ione padre viene fatto collidere con gas azoto o argon nel secondo analizzatore per ottenere gli ioni figlio, ovvero il prodotto che si accumula nel terzo analizzatore. Anche questa metodica come la SIM permette di recepire le sostanze appena in tracce, poiché la sensibilità in Full Scan MS/MS è maggiore.
(http://webcache.googleusercontent.com/search?q=cache:vnvaE2cqKJoJ:www.fedoa.unina.it/815/1/tesi_di_do ttorato_tartaglione.pdf+&cd=1&hl=it&ct=clnk&gl=it. , pp. 17-21.)
La MRM (Multiple Reaction Monitoring) è l’applicazione della SRM (Selected Reaction Monitoring) agli ioni prodotti da uno o più ioni precursori.
Nella PIS (Precursor Ion Scan, MS/MS o MSn ) si seleziona un determinato ione avente un certo rapporto m/z (ione precursore). Nel quadrupolo, la massa selezionata trasmessa da Q1 collide in Q2 (vedi descrizione della cella di collisione [q2]) con il gas azoto generando gli ioni prodotto. Il lavoro è terminato dalla separazione degli ioni da parte di Q3 che opera nella modalità Full Scan MS con risultato di uno spettro di frammentazione. E’ assai adatta alla distinzione tra composti che abbiano una parte della loro struttura molecolare identica, ovvero condividano un tratto o frammento comune.
Nella Neutral Loss Scan (NL) il triplo quadrupolo lavora in regime Full Scan ma la scansione in Q1 e Q3 è differente per la diversa perdita neutra, peraltro calcolata a distinzione anche qui tra sostanze che abbiano qualche gruppo funzionale comune. La NL segue in altre parole gli ioni che per frammentazione perdono un certo frammento neutrale ai fini del riconoscimento della sostanza ma finisce per distinguerlo da un frammento a valenza diagnostica.
(http://clas.ucdenver.edu/sasl/Instrumentation/Organic/LCMS/LC%20Training/05%20Quadrupole%20Sca n%20Modes.pdf. , 5.3, p. 7.)